半夏瀉心湯預(yù)防應(yīng)激性胃黏膜損傷及對Bcl-2和Caspase-3的影響

劉 余，譚達全，羅桂香，李定祥，尹 勇，郭春秀*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

應(yīng)激性胃黏膜損傷是機體在遭受身體、心理障礙等應(yīng)激狀態(tài)時，發(fā)生的一種急性胃黏膜病變。 隨著社會壓力的不斷增加，人們的心理障礙問題愈發(fā)嚴重，此病的發(fā)生率也成大幅上升勢頭，已嚴重危害人們的健康和生命。 現(xiàn)代研究證實胃黏膜細胞過度凋亡是應(yīng)激性胃黏膜損傷發(fā)生的機制之一[1]。 雖然近年來有研究[2-4]證實半夏瀉心湯能有效地預(yù)防應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生，但是缺乏半夏瀉心湯對胃黏膜細胞凋亡影響以抗應(yīng)激性損傷的研究。 本實驗擬通過對束縛水浸應(yīng)激大鼠胃黏膜上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 家族和Caspase-3 表達的影響， 探討半夏瀉心湯預(yù)防應(yīng)激性胃黏膜損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

半夏瀉心湯所用中藥（半夏、黃芩、黃連、干姜、人參、炙甘草、大棗）均一次性購自湖南楚仁堂大藥房。 藥物劑量比例按《傷寒論》原著：半夏半升，黃芩、黃連、人參、炙甘草各三兩，黃連一兩，大棗十二枚，根據(jù)文獻[5]換算為現(xiàn)代用量，半夏55.7 g，黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875 g，黃連15.625 g，大棗42 g。 藥物水煎30 min，2 次，提取水煎液，合并， 水浴濃縮至含生藥3.05 g/mL， 貯于冰箱中備用。 奧美拉唑， 北京康蒂尼藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：20 mg/片， 實驗時以生理鹽水稀釋成0.203 mg/mL 濃度。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)、 引物(上海生工公司)、 辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（Proteintech）、Caspase-3 抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(Proteintech)。 TS-92 搖床、QL-901 旋渦混合器(其林貝爾)、PCR 儀(Eppendorf)、電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽、DYCZ-40A 轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)等。

1.2 動物分組與給藥

健康SD 大鼠40 只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達生物有限責任公司，動物許可證號：SCXK(湘)2011-0003。 大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為4 組：空白組、模型組、中藥組、西藥組，每組10 只。 4 組動物于實驗前飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心， 控制室溫（25±2）℃， 相對濕度（65±5）%，飼養(yǎng)條件相同。 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，中藥組給予半夏瀉心湯藥液30.5 g/kg 灌胃，1 次／d，持續(xù)3 d； 西藥組給予奧美拉唑2.03×10-3g/kg 灌胃；空白組和模型組以等體積生理鹽水灌胃處理。

1.3 造模及取材

除空白組外，中藥組、西藥組、模型組大鼠采用束縛水浸應(yīng)激法[6]制作急性胃潰瘍模型。 大鼠禁食不禁水24 h，將大鼠仰臥捆綁固定于鼠板上，然后將鼠板直立于(20±1) ℃的水箱中，水面平大鼠胸骨劍突水平，水浸10 h 后大鼠取出松綁。造模后1 h，大鼠10%水合氯醛麻醉仰臥固定于鼠板上，剖腹取胃，觀察胃黏膜損傷指數(shù)（UI），每組隨機抽出5 只大鼠胃黏膜置于Trizol 中，-80 ℃冰箱凍存，RTPCR 法待檢Bcl-2、Bax mRNA 的表達； 每組其余5只大鼠胃黏膜置于-80 ℃冰箱凍存，Western-blot 法待檢Caspase-3 表達。

1.4 指標檢測

1.4.1 UI 觀察 大鼠取胃后沿胃大彎剖開，用生理鹽水沖洗干凈， 再用毛筆輕輕刷去胃黏膜表面黏液， 在濾紙上平展開，10 倍放大鏡下肉眼觀察大鼠的胃黏膜損傷情況，按文獻[6]：斑點糜爛計1 分；糜爛長度＜1 mm 計2 分； 糜爛長度1～2 mm 計3 分；糜爛長度2～3 mm 計4 分； 糜爛長度＞4 mm 計5分；寬度＞2 mm 者計分加倍，累計所得損傷指數(shù)。

1.4.2 Western-blot 法檢測Caspase-3 表達 胃黏膜組織勻漿提取上清液，用常規(guī)操作方法提取胃黏膜組織總蛋白；SDS-PAGE 電泳；轉(zhuǎn)膜2 h；用TBST配制5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h；加入顯色液，以X 光膠片曝光。 每張膜上做一種目的蛋白和相應(yīng)的內(nèi)參蛋白。 圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化。 將目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin 的灰度值以校正誤差，將其比值（相對灰度值）作為結(jié)果。

1.4.3 RT-PCR 法檢測Bcl-2、Bax mRNA 表達 應(yīng)用Trizol 試劑盒提取總RNA，組織總mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 操作步驟按照說明書進行。 20 μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配置：5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μL，oligo (d T)0.5 μL，dNTPs 0.5 μL， 逆轉(zhuǎn)錄酶MmLV 1 μL，DEPC 處理水10 μL，RNA 模板4 μL。 反應(yīng)條件：37 ℃，1 h；95 ℃，5 min；滅活MmLV。 10 μL 擴增體系配置：10×Ex buffer 1 μL， dNTP 1 μL， 上游引物0.5 μL， 下游引物0.5 μL，cDNA 1 μL，Ex Taq DNA polymerase 0.15 μL，ddH2O 5.85 μL。 擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃(Bcl-2)/60 ℃(Bax) 30 s，72 ℃30 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。 PCR 產(chǎn)物電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察、照相、掃描，將圖片采集，并用Quality one軟件對圖像進行分析，計算目的蛋白與總蛋白（Beta-actin）的光密度比值。

引物序列如下：Bcl-2 引物序列：Bcl-2-F：5’-GGTGAACTGGGGGAGGATTG -3’，Bcl -2 -R：5’ -CCACAGAGCGATGTTGTCC -3’；Bax 引 物 序 列：Bax-F：5’-GGGATGGCCTCCTTTCCTAC-3’，Bax-R：5’-TTCCAGATGGTGAGTGAGGCA -3’；actin 引物序列：actin-F：5’-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’，actin-R：5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 軟件進行分析， 計量資料數(shù)據(jù)用“±s”表示。正態(tài)性檢驗，若符合正態(tài)分布者，多組比較采用單因素方差分析 （One-way ANOVA），方差齊者用LSD 和SNK 法， 若方差不齊者用Tamhane’s T2 或Dunnett’s T3 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠UI 結(jié)果比較

空白組大鼠胃黏膜未見明顯損傷，模型組大鼠UI 最高，與空白組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明束縛水浸應(yīng)激刺激可造成胃黏膜的急性損傷；與模型組比較，中藥組和西藥組UI 均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表1。

表1 各組大鼠UI 結(jié)果比較 （±s，n=10）

表1 各組大鼠UI 結(jié)果比較 （±s，n=10）

注：與空白組比較★★P＜0.01；與模型組比較▲▲P＜0.01。

組 別空白組模型組中藥組西藥組給藥劑量（g/kg·d）— —30.5 2.03×10-3 UI 0 41.80±5.59★★22.70±5.12★★▲▲23.30±7.90★★▲▲

2.2 各組大鼠胃黏膜Bcl-2、Bax mRNA 表達結(jié)果比較

與空白組比較， 模型組大鼠胃黏膜Bcl-2 表達顯著降低(P＜0.01)、Bax 表達顯著增強(P＜0.01)，提示束縛水浸應(yīng)激造模可抑制Bcl-2 mRNA 表達、促進Bax mRNA 表達，使Bcl-2/Bax 表達失衡。 與模型組比較，中藥組和西藥組均可顯著促進Bcl-2 表達(P＜0.01)，中藥組與西藥組比較，西藥組促進Bcl-2 表達的作用優(yōu)于中藥組(P＜0.05)。 見表2。

2.3 各組大鼠胃黏膜活化Caspase-3 表達的比較

與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜細胞活化的Caspase-3（17kd）表達顯著升高(P＜0.01)，酶原Caspase-3（35 kd）顯著降低(P＜0.01)，提示束縛水浸應(yīng)激造模，可促進Caspase-3 的活化。 與模型組比較，中藥組和西藥組可顯著降低活化Caspase-3 的表達(P＜0.01)。 見表3，圖1。

表2 各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA 表達結(jié)果比較（±s，n=5）

表2 各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA 表達結(jié)果比較（±s，n=5）

注：與空白組比較★P＜0.05，★★P＜0.01；與模型組比較▲▲P＜0.01；與中藥組比較◆P＜0.05。

組 別空白組模型組中藥組西藥組Bcl-2(光密度比值)0.915±0.105 0.343±0.098★★0.602±0.063★★▲▲0.783±0.087▲▲◆給藥劑量（g/kg·d）— —30.5 2.03×10-3 Bax(光密度比值)0.419±0.154 0.997±0.201★★0.773±0.148★0.652±0.222

表3 各組大鼠Caspase-3 表達的比較 （±s，n=5）

表3 各組大鼠Caspase-3 表達的比較 （±s，n=5）

注：與空白組比較★P＜0.05，★★P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

Caspase-3（35 kd）（相對灰度值）0.83±0.15 0.28±0.12★★0.54±0.14★▲0.57±0.16▲組 別空白組模型組中藥組西藥組給藥劑量（g/kg·d）— —30.5 2.03×10-3 Caspase-3（17 kd）（相對灰度值）0.23±0.07 0.70±0.20★★0.42±0.09★▲▲0.43±0.11★▲▲

圖1 大鼠胃黏膜Caspase-3 蛋白western-blot 電泳圖

3 討論

正常情況下胃黏膜細胞通過平衡的凋亡和增殖機制，維持黏膜細胞數(shù)量的穩(wěn)定和胃黏膜整體的完整性。 研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)下，黏膜上皮細胞凋亡增加，增殖受到抑制，說明應(yīng)激過程中胃黏膜上皮細胞的過度凋亡參與了胃黏膜的損傷[1]。

細胞凋亡的發(fā)生受到細胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，在已知的凋亡調(diào)節(jié)蛋白中，Bcl-2 家族蛋白發(fā)揮著細胞凋亡“主開關(guān)”的作用，其抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩類蛋白相互作用調(diào)節(jié)，決定著細胞的存活與凋亡，Bcl-2 表達增強則抑制細胞凋亡的發(fā)生，Bax 表達增強則促進細胞凋亡的發(fā)生。 研究[7-8]發(fā)現(xiàn)水浸束縛應(yīng)激導(dǎo)致細胞過度凋亡，其發(fā)生的機制與增加促凋亡基因Bax 的表達和減少抑凋亡基因Bcl-2 的表達有關(guān)。而Caspase 家族是細胞凋亡過程中的啟動者和執(zhí)行者， 是細胞死亡蛋白酶。 其中Caspase-3 作為凋亡級聯(lián)反應(yīng)下游的凋亡執(zhí)行因子中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子，它的活化標志著凋亡進入不可逆階段[7]。 在正常細胞內(nèi)部，Caspase 處于非活化的酶原狀態(tài)，不具備生理活性，只有被激活的Caspase-3才具備生理活性，引發(fā)細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。 Bcl-2 家族蛋白可改變線粒體膜的通透性， 細胞色素c 進入細胞液， 與抗惡性貧血因子1 和Caspase-9 組成凋亡復(fù)合體，Caspase-9 激活后， 作用于下游的Caspase-3 酶原，激活Caspase-3，被活化的Caspase-3引發(fā)細胞不可逆性凋亡[9]。 因此在執(zhí)行細胞凋亡和促進創(chuàng)傷愈合的過程中Caspase-3 發(fā)揮重要的作用。

半夏瀉心湯是《傷寒論》中“辛開苦降”的代表方劑。 在本研究中半夏瀉心湯按照原方劑量配伍，半夏劑量大大超過《中藥學(xué)》《中藥大辭典》和《中華本草》等權(quán)威著作規(guī)定的用量5～10 g。 但譚達全等[10]通過對仲景運用半夏的經(jīng)驗和規(guī)律進行總結(jié)與研探，發(fā)現(xiàn)大劑量半夏生用，經(jīng)過湯劑煎煮，既能解半夏之毒，又不破壞其治病有效成分而達到了增強療效之目的，且后世很多醫(yī)家[11-13]在臨床也證實仲景使用半夏，劑量超常，但功效卓著。 至今半夏瀉心湯的治療應(yīng)用遠超仲景原來的心下痞、腸鳴而嘔的范疇，廣泛應(yīng)用于中焦寒熱錯雜、升降失調(diào)引發(fā)的諸癥。王鳳澤等[14]認為“只要是脾胃中焦之氣機升降運動失常所導(dǎo)致的水濕運化障礙，氣滯血瘀及一切病理產(chǎn)物阻塞中焦所出現(xiàn)的一切病證， 均可使用該方”。唐虹[15]則總結(jié)出脾胃病機總不離寒熱及升降失常，因而對脾胃病的治療常用辛開苦降法。

大鼠束縛水浸的應(yīng)激性胃黏膜病變與臨床心理和身體應(yīng)激的胃潰瘍病變的病機相似，實驗和臨床[16-18]證實半夏瀉心湯可有效防治胃黏膜病變，包括應(yīng)激性胃黏膜損傷。 本實驗結(jié)果顯示，束縛水浸應(yīng)激后， 胃黏膜損傷明顯， 胃黏膜上皮細胞Bcl-2 mRNA 表達明顯降低，Bax mRNA 表達明顯增高，Caspase-3 被明顯活化， 從而引發(fā)胃黏膜上皮細胞的不可逆性過度凋亡。 預(yù)先給予半夏瀉心湯，可明顯抑制胃黏膜的急性損傷，Bcl-2 mRNA 的表達明顯增強，Caspase-3 酶原的活化受到抑制，表明半夏瀉心湯可通過抑制胃黏膜上皮細胞的過度凋亡從而對抗胃黏膜損傷。

綜上，半夏瀉心湯可通過增強Bcl-2 mRNA 的表達、抑制Caspase-3 酶原的活化，從而有效對抗應(yīng)激性胃黏膜上皮細胞的過度凋亡，預(yù)防應(yīng)激性胃黏膜急性損傷的發(fā)生，但其抑制凋亡的具體機制及對凋亡信號通路的影響還有待進一步研究。

[1]劉 婧，李兆申.大鼠應(yīng)激性胃黏膜損傷時細胞發(fā)生凋亡[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床[J].2007，27(9)：1 038-1 042.

[2]徐 穎，張祖志，方正清，等.半夏瀉心湯對應(yīng)激性胃黏膜損傷大鼠血管活性腸肽含量的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2004，16(2)：97-98.

[3]張 忠，司銀楚，吳海霞，等.半夏瀉心湯及其拆方對應(yīng)激性胃潰瘍大鼠膽堿能神經(jīng)元的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11(4)：283-284.

[4]張 忠，司銀楚，白麗敏，等.半夏瀉心湯及其拆方對應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃泌素的影響[J].世界華人消化雜志，2005，13(10)：1 223-1 224.

[5]柯雪帆，趙章忠，張玉萍，等.《傷寒論》和《金匱要略》中的藥物劑量問題[J].中國中醫(yī)藥雜，1983(12)：36-38.

[6]Guth PH，Aures D，Paulsen G. Topical aspfin plus HCI gastric lesions in the rat. Cytoprotective effect of prostaglandin，cimetidine，and probanthine [J]. Gastroenterology，1979，76(1)：88-93.

[7]牛廷獻，史智勇，姜進軍.凋亡相關(guān)基因bcl-2 和Bax 在大鼠應(yīng)激性潰瘍中的表達及作用[J].中國實驗動物學(xué)報，2005，13(3)：170-172.

[8]劉 婧， 李兆申， 宛新建， 等. 凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax 和Fas/Fas L 在應(yīng)激性潰瘍發(fā)生發(fā)展過程中的表達及作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83(6)：504-509.

[9]何永鋒，樊廷俊.Bc1-2 家族蛋白與細胞凋亡[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，2002，34(4)：289-294.

[10]譚達全，張炳填，李鑫輝.仲景妙用半夏雜談[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24(1)：146-149.

[11]張銀梅.半夏臨床運用點滴[J].中華現(xiàn)代臨床醫(yī)藥雜志，2003（11）：59.

[12]朱樹寬.半夏善治三叉神經(jīng)痛[J].中醫(yī)雜志，2001，42(2)：73.

[13]吳鞠通.吳鞠通醫(yī)案[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1960，181.

[14]王澤鳳，王 敏，史新萍.半夏瀉心湯在胃腸疾病方面的應(yīng)用[J].中國實用醫(yī)藥，2009，4(9)：167-168.

[15]唐 虹.辛開苦降法治療脾胃病淺析[J].中醫(yī)研究，2010，23(5)：59-60.

[16]房亞洲.半夏瀉心湯治療消化性潰瘍臨床分析[J].光明中醫(yī)，2011，26(1)：97-98.

[17]渡邊泰雄.半夏瀉心湯對水浸拘束誘發(fā)大鼠胃潰瘍的抑制作用以及腦和胃的單胺調(diào)節(jié)[J].國外醫(yī)學(xué)·中醫(yī)中藥分冊，1998，20(6)：23-24.

[18]許景峰，王金萍，許 茜.半夏瀉心湯對大鼠胃潰瘍及小腸功能的影響[J].中國藥業(yè)，2002，11(2)：48-49.