抗流感病毒藥物研究進展

高巖，劉宗英，李卓榮

·綜述·

抗流感病毒藥物研究進展

高巖，劉宗英，李卓榮

流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，具有流行面廣、傳染性強、發(fā)病率高等特點，其波及范圍之廣、造成經(jīng)濟損失之大位于傳染性疾病之首［1］。近年來，隨著全球物種活動范圍的加大，人、禽、豬和其他種屬間流感病毒基因重組的概率大大增加，使流感病毒變異性增強［2］，產(chǎn)生了具有高致病性的新變種病毒［3］。目前，應對流感病毒感染的主要措施是疫苗接種和藥物治療。疫苗接種很難使老人、兒童等高危人群產(chǎn)生有效免疫，且不能為機體提供廣泛持久的免疫防護；同時流感病毒株不斷的進化和新病毒株的出現(xiàn)，更大大降低了疫苗的有效性［4］；因此藥物治療仍然是最好的控制流感病毒傳播的手段［5］。目前 FDA 已批準上市的抗流感病毒藥物，包括 2 個神經(jīng)氨酸酶抑制劑（奧司他韋和扎那米韋）和 2 個 M2 離子通道抑制劑（金剛烷胺和金剛乙胺），CFDA 除已批準上述 4 個藥物上市外，還批準了一個神經(jīng)氨酸酶抑制劑（帕拉米韋）上市。近十年來，這些抗流感病毒藥物在體內(nèi)外誘生出大量的耐藥病毒株，如H1N1 病毒對奧司他韋產(chǎn)生了耐藥、H1N1 病毒和 H3N2病毒對金剛烷胺產(chǎn)生了耐藥［6］，因此，設計研發(fā)新型抗流感病毒藥物已迫在眉睫。

流感病毒是一種負螺旋單鏈 RNA 病毒，根據(jù)其核蛋白（nucleoprotein，NP）和基質(zhì)蛋白（matrix protein，MP）抗原決定簇的不同，將流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）3 個類型［7］。流感病毒的包膜上嵌有兩種糖蛋白：血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）。在流感病毒入侵宿主細胞及傳播的過程中，這兩種蛋白扮演著非常重要的角色［8］。流感病毒的復制周期主要包括以下幾個階段（圖1）：①黏附——病毒通過其表面的血凝素吸附在宿主細胞表面；②內(nèi)吞——通過細胞內(nèi)吞作用，病毒進入宿主細胞形成胞內(nèi)體；③膜融合——病毒包膜與胞內(nèi)體膜融合，病毒核糖核蛋白（vRNP）進入宿主細胞胞漿；④入核——病毒核糖核蛋白進入細胞核；⑤RNA 合成——在細胞核內(nèi)進行病毒遺傳信息的復制；⑥出核——合成且組裝好的vRNP 被運送出細胞核；⑦組裝——裝配成成熟病毒，在宿主細胞表面出芽；⑧釋放——神經(jīng)氨酸酶水解唾液酸釋放新病毒［9］。阻斷流感病毒復制周期中的任何一個階段，都可以有效地抑制病毒的感染。本文對近年來報道的作用于流感病毒復制周期中不同階段的抗流感病毒化合物進行綜述。

圖1 流感病毒復制周期（1：黏附；2：內(nèi)吞；3：膜融合；4：入核；5：RNA 合成；6：出核；7：組裝；8：釋放）

1 血凝素抑制劑

血凝素有兩大主要功能：一是識別并結(jié)合宿主細胞表面的唾液酸受體，使病毒黏附于宿主細胞表面；二是在酸催化下發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，介導病毒包膜與胞內(nèi)體膜融合，將病毒釋放進入胞漿。血凝素抑制劑包括阻止病毒黏附于宿主細胞的黏附抑制劑和阻止病毒包膜與胞內(nèi)體膜融合的膜融合抑制劑。

1.1 黏附抑制劑

1.1.1 唾液酸類似物 唾液酸（圖2）是一類九碳單糖族化合物，在病毒與宿主細胞的結(jié)合和子代病毒從宿主細胞釋放中均起重要作用，因此其類似物既可以是血凝素抑制劑，又可以是神經(jīng)氨酸酶抑制劑［10］。游離的唾液酸單體在體內(nèi)不能阻止病毒黏附，但多價態(tài)的唾液酸類似物可以有效地阻止病毒黏附于宿主細胞［11］，如多價態(tài)的唾液酸偶聯(lián)聚乙二胺（G4-SA）對于多種流感病毒亞型（H1N1、H2N2 和 H3N2）均具有抑制活性［12］。但多價態(tài)唾液酸類似物具有細胞毒性，Hendricks 等［13］合成了一系列連有脂質(zhì)體的唾液酸類似物，這類化合物在弱化細胞毒作用的同時，具有較強的抗病毒活性。包埋摩爾百分比為 7.5% 唾液酸類似物的脂質(zhì)體體外對H1N1 病毒血凝素的 IC90為 0.041 μmol/L；而且顯著提高感染 1000 pfu H1N1 病毒（90% 致死量）小鼠的存活率。

1.1.2 抗病毒蛋白 最具代表性的抗病毒蛋白是唾液酸酶的融合蛋白，它能夠移除宿主上皮細胞表面的唾液酸受體，從而抑制病毒的黏附。由于它不直接作用于病毒，因此不易出現(xiàn)病毒耐藥性。DAS181 是一種廣譜抗流感病毒藥物，能夠抑制包括高致病性禽流感 H5N1 在內(nèi)的各種流感病毒。目前 DAS181 已經(jīng)完成 II 期臨床研究［14］。Cyanovirin-N（CV-N）是在藍藻中發(fā)現(xiàn)的一種抗病毒蛋白，通過與病毒表面血凝素的甘露寡糖結(jié)合，降低病毒的感染性。CV-N 幾乎對所有的甲型和乙型流感病毒株均表現(xiàn)出較高的抗病毒活性［15］。遺憾的是，細胞毒性和免疫原性阻斷了該蛋白的進一步研發(fā)。近期從大腸桿菌細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一種 linker-CVN（LCVN），即在 N 末端具有柔性親水性多肽的 CV-N，后經(jīng)過對其進行結(jié)構(gòu)改造得到 N 端 α-胺聚乙二醇化的PEG20k-LCVN，其在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好抗流感病毒活性，體外對 H3N2 和 H5N3 病毒的 EC50分別為 0.43 μmol/L和 0.04 μmol/L，明顯優(yōu)于陽性對照藥利巴韋林；2.0 mg/（kg·d）給藥劑量下可使感染 H3N2 病毒小鼠的存活率提高 2 倍［16］。

1.1.3 核苷類似物 2-脫氧尿苷（圖2）在體外以劑量依賴型作用方式抑制 H1N1 病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶，對H5N2 流感病毒的 IC50為 45 μg/ml，且在治療劑量內(nèi)無細胞毒作用。該化合物雖然靶向于病毒表面的血凝素和神經(jīng)氨酸酶，但主要通過阻斷糖基化過程發(fā)揮作用［17］，作用機制新穎。

1.1.4 天然產(chǎn)物 Neoechinulin B（圖2）是深海赤散囊菌F33 發(fā)酵產(chǎn)物的提取分離物，具有廣譜抗流感病毒活性，對多種耐藥病毒株（如耐奧司他韋 H1N1 病毒和耐金剛烷胺H3N2 病毒）有較強的抑制作用，EC50為 13～27 μmol/L。Neoechinulin B 能與血凝素結(jié)合，競爭性抑制血凝素與唾液酸的結(jié)合，阻止病毒黏附于宿主細胞［18］。該化合物不易產(chǎn)生耐藥性，是具有研發(fā)前景的抗流感化合物。Ou 等［19］通過虛擬對接研究發(fā)現(xiàn)姜黃素（圖2）也能與病毒血凝素結(jié)合，體外對 H1N1 流感病毒的 EC50為 0.17 μmol/L；其體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要為四氫姜黃素，能夠通過與之不同的作用機制阻止病毒復制，說明姜黃素中的二烯酮結(jié)構(gòu)是該類化合物表現(xiàn)出不同抑制作用的關(guān)鍵官能團。中藥白芍醇提物中的脂溶性組分在體外對 H1N1 病毒的 IC50為 0.016 mg/ml［20］，對H3N2 病毒也表現(xiàn)出良好的抗病毒活性，是一種對 H1N1、H3N2 以及耐奧司他韋流感病毒均有效的廣譜抗病毒組分。有報道稱，軟羽衣草提取物具有抑制 H1N1、H3N2 和 H5N2流感病毒的活性［21］。另據(jù)報道，銀杏葉提取物也能抑制血凝素與唾液酸結(jié)合，對 H1N1 和 H3N2 流感病毒有效［22］。

1.2 膜融合抑制劑

1.2.1 MBX2329 和 MBX2546 MBX2329 和 MBX2546（圖3）是通過高通量篩選得到的具有廣譜抗流感活性的化合物，能夠抑制 2009 H1N1、禽流感 H5N1 以及耐奧司他韋 H1N1 病毒感染，與奧司他韋聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用。作用機制研究表明，兩個化合物均能抑制酸催化的血凝素構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而阻止血凝素介導的膜融合，對多種流感病毒（H5N1、H1N1 和耐奧司他韋 H1N1）的 IC50為 0.3～5.9 μmol/L。此類化合物可作為新型抗流感藥物研發(fā)的先導化合物，也可用于研究酸催化血凝素構(gòu)象轉(zhuǎn)變的分子機制［23］。

1.2.2 苯磺酰胺類化合物 RO5464466 和 RO5487624（圖3）是苯磺酰胺類化合物的代表，在體內(nèi)外均能抑制 H1N1 病毒感染，在體外對不同 H1N1 流感病毒株的EC50為 0.09～0.66 μmol/L；在體內(nèi)能夠延長感染 40 倍半數(shù)致死量 H1N1 病毒（致死劑量）小鼠的存活時間，顯著提高小鼠存活率；但該類化合物對 A/Hongkong/8/68 和A/Human/Hubei/3/2005 兩株 H3N2 流感病毒無抑制活性。作用機制研究表明，這類化合物能夠阻止低 pH 誘導的血凝素構(gòu)象轉(zhuǎn)變，是血凝素構(gòu)象穩(wěn)定劑?？赡苡捎谧饔脵C制不同，此類化合物體內(nèi)活性弱于陽性對照藥奧司他韋［24］。

2 神經(jīng)氨酸酶抑制劑

神經(jīng)氨酸酶能夠水解宿主細胞表面的唾液酸釋放新病毒，是一個非常有吸引力的靶標。神經(jīng)氨酸酶抑制劑具有對多種亞型流感病毒廣譜有效、患者耐受性高等優(yōu)點，得到廣泛研究。

2.1 帕拉米韋

帕拉米韋（peramivir）（圖4）是具有胍基和親脂側(cè)鏈的環(huán)戊烷類衍生物，是繼扎那米韋和奧司他韋之后的第 3 種流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑，其體外抗 H5N1 病毒的效果與扎那米韋和奧司他韋相當；感染 24 或 48 h 后注射單劑量藥物，可大大提高感染 H1N1 病毒小鼠和感染 H5N1 病毒小鼠的存活率；具有耐受性好、毒性小等優(yōu)點［25］。帕拉米韋注射劑能有效治療耐奧司他韋的流感病毒感染，適用于流感危重患者和無法口服或吸入藥物患者的治療［26］。2013年4月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準了抗流感新藥帕拉米韋氯化鈉注射液；該藥在美國正在進行 III 期臨床試驗。

2.2 辛酸拉尼米韋

辛酸拉尼米韋（laninamivir octanoate）（圖4）是神經(jīng)氨酸酶抑制劑 R125489 的前藥，通過單次吸入治療流感。由于經(jīng)鼻給藥后其活性代謝產(chǎn)物拉尼米韋在呼吸道內(nèi)滯留時間長，并且拉尼米韋可與各種類型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶發(fā)生穩(wěn)定結(jié)合，因此具有長效抗流感病毒活性［27］。該藥對甲型 H1N1、H3N2 流感病毒和乙型流感病毒的 EC50均達到納摩爾級。目前該藥已在日本上市，在美國正在進行 III期臨床試驗。相比于帕拉米韋而言，拉尼米韋更不易產(chǎn)生耐藥性，而且有可能開發(fā)出靜脈注射劑型，避免吸入給藥的不順應性。

2.3 奧司他韋類似物

AV5080（圖4）對甲型流感病毒神經(jīng)氨酸酶表現(xiàn)出強抑制活性，體外抗 H5N1 和 H1N1 流感病毒的 EC50分別為 0.03 和 0.07 nmol/L，而且對奧司他韋耐藥流感病毒株也表現(xiàn)出強抑制活性，該化合物還顯示出良好藥代動力學特性［28］。AV5075S 是 AV5027（圖4）的甲磺酸前藥，是流感病毒神經(jīng)氨酸酶的競爭性抑制劑［29］。AV5027 體外抗H1N1 流感病毒神經(jīng)氨酸酶的 IC50為 0.18 nmol/L，是陽性對照藥磷酸奧司他韋的 12 倍。對感染 H3N2 流感病毒小鼠的體內(nèi)研究表明，以 5 mg/（kg·d） 的劑量給藥，AV5075S的治療效果優(yōu)于陽性對照藥奧司他韋，使小鼠存活率提高了80%～90%，消除了體重減輕效應，在該化合物的治療劑量內(nèi)沒有觀察到毒性反應［30］。Tamiphosphor（TP）（圖4）也是奧司他韋衍生物，能與神經(jīng)氨酸酶活性位點的 3 個精氨酸殘基發(fā)生靜電結(jié)合，具有較強的神經(jīng)氨酸酶抑制活性，從而抑制人類和禽流感病毒的復制。另外，胍基-Tamiphosphor（TPG）（圖4）對耐奧司他韋流感病毒株有效，EC50＜1 μmol/L；鼻腔內(nèi)給予低劑量的 TPG 能大大提高感染流感H1N1 病毒小鼠的存活率［31］。

圖3 膜融合抑制劑

圖4 神經(jīng)氨酸酶抑制劑

2.4 二氫呋喃并吡啶酮類

Jang 等［32］通過對 7500 個化合物進行隨機篩選和結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到化合物 1（圖4），其體外抗甲型 H1N1、H3N2 病毒和乙型流感病毒的 EC50為 5.0～6.2 μmol/L，并且濃度達到 900 μmol/L 時無細胞毒作用?；衔?以劑量依賴型作用方式降低感染細胞的病毒蛋白水平，也能以同種方式抑制子代病毒的產(chǎn)生。作用機制研究表明該化合物能抑制流感病毒的神經(jīng)氨酸酶，阻止病毒釋放。

2.5 天然神經(jīng)氨酸酶抑制劑

Grienke 等［33］通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)了來自光果甘草的化合物 2（圖4），其體外抑制 H1N1 病毒神經(jīng)氨酸酶的 IC50為 0.25 μmol/L，該化合物可能通過抑制神經(jīng)氨酸酶發(fā)揮抗流感病毒作用。也有報道將南非睡茄中的 Withaferin A（WA）與神經(jīng)氨酸酶進行分子對接，兩者具有較強的親和力，且WA 具有弱化 H1N1 流感病毒神經(jīng)氨酸酶的作用［34］。

3 核蛋白抑制劑

核蛋白的功能是與病毒 RNA 結(jié)合，通過相互連接包裹RNA 形成病毒核糖核蛋白，使病毒遺傳信息得以復制。核蛋白具有高度保守性，是抗流感病毒藥物理想的作用靶點［35］。

3.1 苦參喹諾里西啶類生物堿

從苦參屬植物提取得到的苦參生物堿中，二氫苦豆堿（圖5）抗甲型流感病毒活性最強，其體外抗 H1N1 流感病毒的 EC50為 11.2 μmol/L，對其進行化學修飾，得到了抗病毒活性更強的化合物 3（圖5），其體外抗 H1N1 流感病毒的 EC50為 6.2 μmol/L。作用機制研究表明其能夠作用于流感病毒復制周期的多個階段，核蛋白是一個可能的作用靶標［36］。

3.2 萘普生

Lejal 等［37］通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)抗炎藥萘普生（圖5）能夠與核蛋白結(jié)合，阻止核蛋白在病毒復制中發(fā)揮作用。其體外抗 H5N1 病毒的 EC50為 16 μmol/L，對 H1N1 和 H3N2突變株同樣有效。另外，由于萘普生具有雙重作用機制（抑制 COX-2 和核蛋白），療效較高。

3.3 噻唑酰胺類化合物

Shen 等［38］研究發(fā)現(xiàn)阻斷病毒核蛋白上的 E339…R416鹽橋，能夠阻止核蛋白形成聚合體，誘導單體核蛋白產(chǎn)生，致使其不能包裹 RNA 形成病毒核糖核蛋白。Shen 等針對E339…R416 鹽橋建立了分子模型并進行虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)化合物 4（圖5）能夠與該位點結(jié)合，其體外抗突變型 H1N1病毒的 IC50為 2.7 μmol/L。E339…R416 鹽橋具有高度保守性，是研究抗病毒藥物的一個較為理想的作用靶點。

圖5 核蛋白抑制劑

圖6 RNA 聚合酶抑制劑

4 RNA 聚合酶抑制劑

流感病毒 RNA 依賴性 RNA 聚合酶（RdRP）負責宿主細胞中病毒 RNA 的轉(zhuǎn)錄和復制，由 PA、PB1 和 PB2三個亞基構(gòu)成，其中 PA 具有核酸內(nèi)切酶活性，參與病毒RNA 啟動子的結(jié)合，且能與 PB2 相互作用；PB1 具有聚合酶和核酸內(nèi)切酶活性；PB2 具有“搶帽”活性，與宿主細胞 mRNA 前體物結(jié)合，進行病毒 RNA 的轉(zhuǎn)錄。由于三個蛋白具有高度保守性，是非常有前景的抗流感藥物作用靶點［39］。

4.1 法匹拉韋

法匹拉韋（favipiravir）（圖6）為嘌呤核酸類似物，是一個特異性抑制病毒 RNA 聚合酶的抗流感病毒藥物，通過被細胞磷酸核糖基化轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问椒ㄆダf-RTP 發(fā)揮作用。法匹拉韋靶向于 RNA 依賴性 RNA 聚合酶，而宿主細胞無此靶標，因此該藥不干擾宿主細胞 DNA 或 RNA的合成，無細胞毒作用。法匹拉韋為廣譜抗流感藥物，對包括 H1N1、H5N1、H7N9 流感病毒在內(nèi)的多種甲型、乙型、丙型流感病毒均有抑制活性。法匹拉韋還能夠抑制其他RNA 病毒，如沙粒病毒、布尼亞病毒以及非洲流行的埃博拉病毒等［40］。該藥已在日本和美國完成抗流感病毒的 III期臨床試驗［41］。

4.2 環(huán)己基羧酸類化合物

Clark 等［42］發(fā)現(xiàn)環(huán)己基羧酸類化合物具有抗流感作用，其中 VX787（圖6）對包括 2009 H1N1 和禽流感 H5N1 在內(nèi)的各種甲型流感病毒均有較強抑制作用，其體外抗 H3N2病毒 EC50為 0.6 nmol/L；10 mg/kg·次（每日兩次）給藥可使感染 H1N1 病毒的小鼠肺部病毒量迅速減少［43］。VX787是 RNA 聚合酶 PB2 亞單位的抑制劑，其整體治療效果優(yōu)于陽性對照藥奧司他韋，目前正在進行 II 期臨床試驗。

4.3 7-甲基鳥嘌呤衍生物

Pautus 等［44］通過在 PB2 的帽端結(jié)合腔進行分子對接，發(fā)現(xiàn)化合物 5（圖6）能夠與 PB2 帽端結(jié)合位點作用，抑制 PB2 的“搶帽”活性，從而使病毒不能利用宿主細胞mRNA 進行轉(zhuǎn)錄和復制。化合物 5 體外抗 H3N2 流感病毒 PB2 的 IC50為 0.6 μmol/L。

4.4 四氮唑類化合物

化合物 6［45］和 7［46］（圖6）是通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)的作用于 PA 的核酸內(nèi)切酶抑制劑。兩個化合物均具有較強抑制活性，其對 H1N1 流感病毒核酸內(nèi)切酶的 IC50分別為0.15 和 0.011 μmol/L。

5 核糖核蛋白出核抑制劑

化合物 8（圖7）是從牛角瓜乳膠中分離得到的一種新木脂素糖苷，其體外抑制人甲型和乙型流感病毒的 EC50為13.4～39.8 μmol/L，對禽流感病毒無抑制作用。初步構(gòu)效關(guān)系研究表明，糖基部分連接的香草酚是活性必需基團?；衔?8 以劑量依賴型作用方式抑制流感病毒對核轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)錄因子 NK-κB 通路的活化，阻斷 vRNP 出核；同時核出口的病毒核糖核蛋白也被抑制［47］。由于化合物 8 作用機制獨特，具有一定的研發(fā)前景。

圖7 核糖核蛋白出核抑制劑

6 結(jié)語與展望

新型流感病毒的大流行威脅著人類的健康，不斷出現(xiàn)的病毒耐藥性也敦促科學家們研發(fā)新型抗流感病毒藥物。近幾年報道了幾種作用于流感病毒復制周期不同階段的新型化合物，新型化合物抗病毒譜更廣，對耐藥病毒株的選擇性更高。其中帕拉米韋和辛酸拉尼米韋則已經(jīng)分別在我國和日本上市；DAS181、VX787 和法匹拉韋 3 個化合物已經(jīng)進入臨床研究階段；有些化合物即將進入臨床；多數(shù)化合物尚處于候選物研究階段。相信隨著人類對流感病毒復制周期分子機制認識的深入，隨著新靶標的相繼發(fā)現(xiàn)和確證，抗流感病毒藥物的研究取得了較大進展，更多新型抗病毒藥物將會被發(fā)現(xiàn)。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2015.06.013

國家自然科學基金青年基金（81402827）

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所合成室

劉宗英，Email：liuzy@cde.org.cn

2015-07-16