桔梗高效離體再生體系的建立

張江麗 李培飛 苑雄雄 劉雪 周凌霞 楊爍爍

摘要：分析了消毒時間、6-BA濃度、外植體放置方式、葉齡對桔梗[Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.] 叢生芽形成過程的影響。結果表明，0.1%升汞消毒5 min的桔梗種子成活率最高；誘導桔梗叢生芽的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA；葉片是最佳外植體；葉片近軸面貼近培養(yǎng)基時，出芽快；葉齡越短，脫分化所需時間越短。

關鍵詞：桔梗[Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC] ；高效；再生體系

中圖分類號：Q949.783.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5436-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.060

Establishment of A Highly Efficient in Vitro Regeneration System for

Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.

ZHANG Jiang-li1，2，LI Pei-fei1，YUAN Xiong-xiong1，LIU Xue1，ZHOU Ling-xia1，YANG Shuo-shuo1

（1. School of Life Science， Langfang Teachers University，Langfang 065000， Hebei，China；

2. Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities， Langfang 065000， Hebei， China）

Abstract：The effects of disinfection time，6-BA level，explant orientation and leaf ages on formation of multiple shoots of Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC. were examined. The results showed that the survival rate of seeds was highest under 0.1% HgCl2 disinfection for 5 minutes. The best medium for multiple shoots induction was MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA and the best explant was leaf. When it contact the medium， the adaxial surface of leaf explant was better for shoot induction. The younger a leaf age was， the sooner the leaf dedifferentiated.

Key words：Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.；highly efficient；regeneration system

桔梗[Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.] 為桔?？啤⒔酃俣嗄晟p子葉草本植物，其根為著名的中藥材，具有宣肺、祛痰、散寒、鎮(zhèn)咳、消腫、排膿等功效[1]，其嫩苗、根均可食用，在中國東北地區(qū)以及日、韓、朝等東亞國家是一種常見蔬菜，具有很高的營養(yǎng)價值。桔梗是一種藥、食、賞兼用植物，在中國分布廣泛，產地有安徽、河南、湖北、遼寧、吉林、河北、內蒙古等地。

桔梗的市場需求量很大，除野生資源外，人工栽培是滿足市場需要的一個重要保障。由于桔梗種子發(fā)芽率較低，制約了其生產和發(fā)展。近年來，研究者對桔梗的組織培養(yǎng)進行了研究[2-6]。本試驗利用生物技術對桔梗細胞全能性的實現(xiàn)進行了初探，考察了外植體種類、年齡、放置方式、消毒方式等因素對桔梗離體培養(yǎng)的影響，獲得了桔梗高效離體再生體系，為桔梗的組織培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

桔梗種子：市售一年新種，購于河北省安國市勝利秧苗種子供應站。

外植體：萌發(fā)15、20、25、30、35、40 d的桔梗無菌苗葉片和莖段。

誘導培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加植物生長調節(jié)物質、3%蔗糖、0.7%瓊脂，pH調至5.8，121 ℃高溫滅菌20 min。①MS + 0.5 mg/L NAA；②MS + 0.5 mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA；③MS +0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA；④MS + 0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA。

1.2 叢生芽的誘導

1.2.1 無菌苗的獲得 挑選色澤鮮亮、粒大、飽滿、種皮無破損、無霉病斑的桔梗種子，置于超凈臺上，用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次。再用0.1%升汞分別消毒3、4、5、6、7 min，無菌水沖洗4～5次，接種于MS基本培養(yǎng)基中，（25±1） ℃暗培養(yǎng)3 d。待種子萌發(fā)后，轉入溫度（25±1）℃、光強3 000 lx、光照時間16 h/d的條件下培養(yǎng)，獲得無菌苗[7]。

1.2.2 外植體的選擇 分別取萌發(fā)15、20、25、30、35、40 d的無菌苗葉片和莖段為外植體，幼葉切成0.5 cm×0.5 cm小塊，莖段剪成長約1 cm的小段。

1.2.3 誘導培養(yǎng) 將外植體接種到誘導培養(yǎng)基中，（25±1） ℃暗培養(yǎng)3 d，轉入（25±1） ℃、3 000 lx、16 h/d條件下培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

出芽率=誘導出叢生芽的外植體塊數(shù)/接種的外植體塊數(shù)×100%

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學觀察

從圖1可以看出，桔梗莖段接種后第5～6天，切口處開始膨大，顏色逐漸變綠，10 d后開始長出芽點，逐漸變成幼芽，12～21 d時幼芽叢生化程度高，高度可達2～3 cm，呈嫩黃綠色，30 d觀察時，芽高可達4～6 cm。桔梗葉片接種后第5～10天，逐漸膨大卷曲，邊緣下翹或中部隆起，葉色變淺。培養(yǎng)10～16 d，開始形成幼芽，顏色淺綠，繼續(xù)培養(yǎng)，綠色逐漸加深。25 d后，芽顏色變?yōu)樯罹G色且逐漸形成叢生芽。培養(yǎng)16 d時，有的叢生芽基部開始長出氣生根，隨6-BA濃度的增加，幼芽數(shù)量逐漸增多，但氣生根量逐漸減少。

2.2 不同消毒時間對桔梗種子污染率和發(fā)芽時間的影響

由表1可見，桔梗種子用70%乙醇消毒30 s后，分別用0.1%升汞消毒3、4、5、6、7 min，培養(yǎng)18 d后，種子開始萌發(fā)。隨著消毒時間的增加污染率逐漸下降，但出芽時間逐漸延長。結果表明，消毒5 min的桔梗種子污染率較低且出芽快。因此，對于桔梗種子，經70%乙醇浸洗30 s后，再用0.1%升汞消毒5 min效果最好。

2.3 不同濃度6-BA對桔梗莖段離體培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)30 d時進行觀察，不同濃度6-BA誘導桔梗莖段產生叢生芽詳見表2。結果表明，當6-BA濃度不同時，以桔梗莖段為外植體誘導的叢生芽形態(tài)和長勢差異明顯。

當培養(yǎng)基中6-BA濃度不同時，對桔梗莖段的誘導率明顯不同。①號培養(yǎng)基啟動較快，能形成少量從生芽，大部分形成愈傷。②號培養(yǎng)基不能形成叢生芽也不能很好地形成愈傷，實際觀察中出愈較慢，大約需要21 d。①號、②號培養(yǎng)基均不適宜桔梗莖段叢生芽的誘導。③號培養(yǎng)基啟動較快，雖有叢生芽產生，但長勢一般，部分也形成愈傷。④號培養(yǎng)基在6 d時莖段切口處有所膨大，顏色逐漸變綠，10 d左右時長出幼小葉片，逐漸變成幼芽；20 d時幼芽充滿整個培養(yǎng)基，高度可達2～3 cm，呈嫩黃綠色；30 d觀察時，芽高可達4～6 cm。整個培養(yǎng)過程中長勢很好，基本全部形成叢生芽，說明添加了1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基適宜桔梗莖段叢生芽的誘導。

2.4 不同濃度6-BA對桔梗葉片離體培養(yǎng)的影響

由表3可知，在4種培養(yǎng)基上，以桔梗葉片為外植體的誘導率均為100%。隨著6-BA濃度的增加，叢生芽的生根情況和叢生化程度不同。①號培養(yǎng)基啟動偏慢，開始幼葉基部長出小芽，小芽數(shù)量逐漸增多并形成叢生芽，在此過程有氣生根生成；16 d時已經生成了大量的氣生根且貫穿在整個培養(yǎng)基；25 d時，幼葉直接長成了小植株；②號培養(yǎng)基也是先在基部生成小芽并生根，但根的數(shù)量相對①號培養(yǎng)基少，氣生根貫穿于整個培養(yǎng)基中，但②號培養(yǎng)基在一定程度上叢生化，有許多叢生芽形成；③號培養(yǎng)基啟動相對較快，6 d時長出小芽，繼續(xù)培養(yǎng)，迅速生成大量叢生芽，在出芽的過程中有少量氣生根生成，15 d時生成大量叢生芽，芽高可達2～4 cm，長勢良好；④號培養(yǎng)基啟動最快，5 d時出芽，10 d時叢生化程度較高，但④號培養(yǎng)基沒有氣生根形成，15 d后觀察，芽高可達4～6 cm。整個培養(yǎng)過程中長勢良好，全部生成叢生芽，適宜桔梗幼葉叢生芽的誘導。①～④培養(yǎng)基誘導率均為100%，其中④培養(yǎng)基為誘導桔梗叢生芽的最佳培養(yǎng)基。

2.5 外植體放置方式對叢生芽誘導的影響

以桔梗幼葉做為外植體，分別以近軸面、遠軸面朝下接種在④號培養(yǎng)基中，結果（表4）表明，外植體在培養(yǎng)基中的放置方式對誘導時間有影響，但對誘導率無影響。葉片無論近軸面還是遠軸面貼近培養(yǎng)基，誘導率都相同，達到100%，但近軸面貼近培養(yǎng)基出芽更快。

2.6 不同日齡桔梗無菌苗葉片對脫分化時間的影響

選取萌發(fā)15、20、25、30、35、40 d的桔梗無菌苗葉片分別接種到④號培養(yǎng)基，觀察其脫分化所需要的時間，結果（表5）表明，葉齡越短，脫分化所需時間越短。

3 討論

細胞分裂素和生長素是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的植物生長調節(jié)物質，左艇等[8]的研究表明6-BA為誘導叢生芽的主要影響因素，由本試驗可以看出，6-BA的濃度對桔梗叢生芽的誘導率影響較大，在NAA濃度為0.5 mg/L時，6-BA在0～1.0 mg/L范圍內時，隨著6-BA濃度的升高桔梗叢生芽誘導率先下降后上升，當6-BA濃度為0.1 mg/L時出芽率最低，但隨著6-BA濃度的進一步升高，桔梗的出芽率逐漸上升。在對桔梗叢生芽誘導的分析中可以看出，NAA的用量對叢生芽誘導率也有一定影響。當 NAA濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度為1.0 mg/L時，其誘導效果最好，這與左艇等[8]的報道一致。

本試驗結果表明，桔梗葉片近軸面貼近培養(yǎng)基誘導叢生芽時，出芽快，這可能是因為葉片近軸面氣孔多，容易吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質和植物激素，所以出芽快。但近軸面、遠軸面貼近培養(yǎng)基的出芽率相同，均為100%，說明葉片放置方式只影響桔梗的脫分化速度，與楊莉[9]對金柑的研究略有不同。

桔梗葉齡越短，脫分化所需時間越短，這可能是因為葉片日齡短，自身分化程度低，更易于脫分化，再分化成芽或植株，與林超[10]對白木香組織培養(yǎng)的研究報道一致。

桔梗植株表面密生絨毛，在自然條件下生長很容易吸附雜菌，有些雜菌甚至能夠侵入組織內部，再對其消毒也很難除去這些雜菌，因此組織培養(yǎng)中外植體極易污染。本試驗采用了無菌播種的方法先獲得無菌苗，再進行叢生芽的誘導，這樣就避免了自然條件下雜菌對植株的影響，降低了污染的發(fā)生，大大提高了試驗效率。

4 小結

1）70%乙醇30 s、0.1%升汞消毒5 min的桔梗種子，污染率最低且出芽最快。

2）桔梗的葉片和莖段在叢生芽誘導過程中，葉片是最佳外植體。

3）誘導桔梗叢生芽形成的最適培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。

4）葉片近軸面朝下貼近培養(yǎng)基誘導叢生芽時，出芽快，但對誘導率無影響。

5）葉齡越短，脫分化所需時間越短。

參考文獻：

[1] 劉德軍，馬維希.桔梗[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2001.

[2] 吳京姬，吳基日，嚴一字，等.提高桔梗組織培養(yǎng)效率的研究[J].安徽農業(yè)科學，2007，35（12）：3565，3572.

[3] 舒 孌，高山林.桔梗的組織培養(yǎng)[J].植物資源與環(huán)境學報，2001，10（3）：63-64.

[4] 楊耀文，錢子剛，李保軍，等.藥用植物桔梗的組織培養(yǎng)初步研究[J].云南中醫(yī)學院學報，2002，25（4）：9-10.

[5] 張風生，姜 淼，李建紅，等.桔梗的組織培養(yǎng)及快速繁殖[J].2007（1）：165.

[6] 向鄧云.桔梗愈傷組織誘導及不定芽形成研究[J].重慶師范學院學報（自然科學版），2001，23（4）：866-869.

[7] 李鐵軍，張孝衛(wèi)，王 兵，等.桔梗無菌苗的誘導與快速繁殖[J].中國現(xiàn)代中藥，2007，9（3）：39，48.

[8] 左 艇.桔梗離體培養(yǎng)和快速繁殖方法研究[J].河南中醫(yī)學院學報，2008，23（138）：40-41.

[9] 楊 莉.金柑遺傳轉化體系的建立與應用[D].杭州：浙江大學，2006.

[10] 林 超.白木香組織培養(yǎng)及多倍體誘導研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2013.