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    紫花苜蓿根響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析

    2015-11-26 01:05:27熊軍波楊青川蔡化田宏張鶴山劉洋
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年21期
    關(guān)鍵詞:紫花苜蓿鹽脅迫

    熊軍波 楊青川 蔡化 田宏 張鶴山 劉洋

    摘要:6 d齡紫花苜蓿(Medicago sativa L.)幼苗在0、200 mmol/L NaCl處理9 d后,采用雙向電泳分別分離了其根部蛋白組。最終每塊膠中有超過900個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被分離,采用MALDI-TOF-TOF/MS質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合MASCOT軟件在線檢索,成功鑒定21個(gè)表達(dá)量發(fā)生1.5倍以上變化的蛋白質(zhì)點(diǎn),為19種不同的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析表明,這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與脅迫防御、碳水化合物和能量代謝、次生代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等調(diào)控途徑。

    關(guān)鍵詞:紫花苜蓿(Medicago sativa L.);鹽脅迫;根;蛋白質(zhì)組

    中圖分類號(hào):S551+.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)21-5422-07

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.057

    Comparative Proteomic Analysis of Salt-stress Response of Alfalfa Proteins in Root

    XIONG Jun-bo1,YANG Qing-chuan2,CAI Hua1,TIAN Hong1,ZHANG He-shan1,LIU Yang1

    (1.Institute of Animal Science, Hubei Academy of Agricultural Science, Wuhan 431700, China;2.Institute of Animal Science of Beijing, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100194, China)

    Abstract: 6 day old alfalfa (Medicago sativa L.) seedlings were exposed to 0(control),and 200 mmol/L NaCl for 9 days. Proteins extracted from the root of alfalfa seedlings were separated by two-dimensional gel electrophoresis(2-DE). More than 900 protein spots were detected on each gel,and 21 spots at least one point five-fold differences in abundance were identified by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-TOF/MS) and MASCOT online. Bioinformatics analysis induced that these proteins were associated with a variety of functions,including stress defense,carbohydrate and energy metabolism,secondary metabolism,transcription and translation related,signaling and ion transport.

    Key words:alfalfa(Medicago sativa L.); salt-stress;root; proteomic

    根據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization)的估算,全世界約有3 400萬hm2(灌溉面積的11%)受到不同程度的鹽漬化影響[1]。據(jù)農(nóng)業(yè)部組織的第二次全國土壤普查資料統(tǒng)計(jì),我國現(xiàn)有鹽漬土的面積為0.35億hm2(不包括濱海灘涂),其中已開墾種植的為576.84萬hm2。鹽漬化土壤中高濃度的鹽離子會(huì)對(duì)植物的正常生理代謝產(chǎn)生影響,如水分缺失、離子毒害、營養(yǎng)失衡、氧化脅迫等,從而導(dǎo)致植物生長減緩,甚至死亡[2]。土壤鹽漬化大大限制了作物生產(chǎn),威脅到糧食安全,研究作物抗鹽機(jī)制,提高作物抗鹽能力,是全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向。

    紫花苜蓿(Medicago sativa L.)為豆科苜蓿屬多年生草本植物,是世界上栽培種植利用最為廣泛的人工牧草,素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱。紫花苜蓿屬于中等耐鹽堿植物,在電導(dǎo)率范圍為2.0 dS/m和滲透壓在1.5 bars內(nèi)的土壤中能正常生長,超過此范圍,電導(dǎo)率每上升一個(gè)單位,產(chǎn)量下降7%[3]。生理生化研究表明,紫花苜??梢酝ㄟ^改變外在形態(tài)、加強(qiáng)活性氧脅迫保護(hù)、合成滲透物、離子選擇吸收、隔離和外排、改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等措施以適應(yīng)鹽脅迫[4]。這些適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制與鹽脅迫下紫花苜?;蚓W(wǎng)絡(luò)的特異性表達(dá)密切相關(guān),采用各種高通量技術(shù),已鑒定出大量鹽脅迫響應(yīng)基因[5,6]。然而,這些研究都是基于轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)來尋找脅迫應(yīng)答基因,mRNA只是基因行使功能的中間載體,而蛋白質(zhì)才是執(zhí)行各種生命活動(dòng)的主體,且研究表明,蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和mRNA水平間相關(guān)性不強(qiáng),因此有必要從蛋白質(zhì)水平對(duì)紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究。近年來,國內(nèi)外研究者采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)超過34種植物的抗鹽脅迫蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究,并成功鑒定出大量鹽脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)[7]。根系是植物感受多種脅迫傷害的最初位點(diǎn),對(duì)根系響應(yīng)鹽脅迫的研究有助于更深入地了解鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究以紫花苜蓿根系為研究對(duì)象,對(duì)根響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析,以期更深入地揭示紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    紫花苜蓿“中苜一號(hào)”種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所牧草研究室提供。挑選籽粒飽滿、無病蟲害種子,用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min,然后用蒸餾水沖洗3次。清洗的種子用蒸餾水浸種12 h后,放置于濕潤的濾紙中培養(yǎng)3 d。之后將幼苗移入1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行水培,6 d后開始脅迫。將培養(yǎng)的幼苗分為兩組:一組在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng);另一組在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中添加50 mmol/L NaCl適應(yīng)生長24 h,其后放入終濃度為200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。每兩天更換一次培養(yǎng)液,期間不定時(shí)攪拌,培養(yǎng)9 d后同時(shí)收割兩組苜蓿根部,液氮保存。

    1.2 藥品與試劑

    固相pH 梯度干膠條(pH 4-7)、IPG buffer、2D clean-up試劑盒、2D-Quant試劑盒、尿素(Urea)、甘氨酸、CHAPS、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)、過硫酸銨(AP)、甘油(glycerol),干膠條覆蓋液,均購至Amersham Biosciences公司;碘乙酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、四甲基乙二胺(TEMED)購自Sigma公司;溴酚藍(lán)、蛋白Marker、碳酸鈉、乙酸鈉、硫代硫酸鈉、EDTA二鈉鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、低熔點(diǎn)瓊脂糖購自BBI(Bio Basic Inc,加拿大);其他試劑為國產(chǎn)分析純。所有溶液均用Milli-Q制備的純水配制。

    1.3 總蛋白質(zhì)的提取和定量

    蛋白質(zhì)提取方法參照文獻(xiàn)[8],部分進(jìn)行調(diào)整。稱取0.5 g樣品液氮研磨后,轉(zhuǎn)入離心管加入3 mL TRIzol (2% DTT), 振蕩混勻,添加0.6 mL氯仿,振蕩混勻,放置5 min;4 ℃,15 000 r/min離心10 min,去上清,添加0.9 mL無水乙醇,振蕩混勻,放置5 min;4 ℃,15 000 r/min,離心5 min,取上清,加入4.5 mL異丙醇,振蕩混勻,4 ℃放置5 min;此后4 ℃,15 000 r/min離心10 min,去溶液,用6 mL含300 mmol/L鹽酸胍的95%乙醇洗滌沉淀3次;4 ℃,15 000 r/min離心10 min,留沉淀,用6 mL無水乙醇洗滌一次,冷凍干燥。其后加入裂解液[8Murea, 2% CHAPS(W/V),1%DTT(W/V),0.5% IPG buffer(V/V)(pH 4~7) 和 0.002% Bromophenol blue(W/V)],超聲20 min促溶,4 ℃靜置4 h以上,離心沉淀(4 ℃,40 000 r/min,1 h),吸取上清備用。使用Amersham公司2D-Quant試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析,步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

    1.4 等電聚焦電泳和SDS-PAGE電泳

    使用水化液[8Murea,2% CHAPS(W/V),1%DTT(W/V),0.5%IPG buffe(V/V)(pH 4~7)和0.002% Bromophenol blue(W/V)]稀釋蛋白質(zhì)溶液,最終將120 mg/450 mL蛋白質(zhì)溶液上樣到24 cm pH 4~7 IPG膠條上。等電聚焦在Ettan IPGphor II (GE Healthcare)儀器上進(jìn)行,溫度設(shè)置為20 ℃,程序?yàn)椋?0 V,12 h;150 V,1 h;500 V,1 h;1 000 V,1 h;8 000 V,2 h;8 000 Vh 到 40 000 Vh。等電聚焦后膠條立即平衡,首先在含有平衡液[6 mol/L urea, 30% glycerol(W/V),2%SDS(W/V),50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.8,1% DTT(W/V)]的平衡液管中水平放置15 min,其后換入含有平衡液的管中水平放置15 min。平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到12%的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行二向分離,首先在電泳液[250 mmol/L Tris-base,1.92 mol/L glycine和1% SDS(W/V)]中0.2 W/strip運(yùn)行1 h,其后相同環(huán)境中使用15 W/strip運(yùn)行到結(jié)束。每組試驗(yàn)設(shè)置4次組內(nèi)重復(fù)。

    1.5 蛋白染色和圖像分析

    凝膠選用銀染,方法參照GE handbook 做適當(dāng)修改。凝膠首先在含有40%乙醇,10%乙酸的水溶液中固定1 h,其后使用含有30%乙醇,0.2%硫代硫酸鈉(W/V)和6.8%乙酸鈉溶液中敏化30 min。經(jīng)超純水漂洗3次,每次5 min;后轉(zhuǎn)入含有2.5 g/L的硝酸銀溶液中銀染20 min,其后使用超純水漂洗2次,每次1 min;轉(zhuǎn)入顯色液(25 g/L 碳酸鈉,240 ml/L 甲醛)中顯色2次,第1次1 min,第2次4 min。反應(yīng)完后轉(zhuǎn)入含有1.46%的EDTA溶液中10 min終止反應(yīng),最后使用純水漂洗3次,每次5 min。染色完成的膠用Powerlook 2100XL掃描儀掃描,并使用ImageMasterTM 2D Platinum 6.0軟件分析,包括凝膠圖像的背景消除、點(diǎn)確認(rèn)、定量和點(diǎn)的匹配等,選取蛋白質(zhì)差異達(dá)1.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

    1.6 蛋白質(zhì)譜鑒定和分類分析

    根據(jù)ImageMaste分析軟件結(jié)果挖取差異蛋白質(zhì)點(diǎn),委托北京華大基因公司進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF/MS)分析。將所得到的肽片段質(zhì)量數(shù)據(jù)運(yùn)用MASCOT軟件進(jìn)行在線檢索(http://www.matrixscience.com),選取NCBI數(shù)據(jù)庫作為檢索數(shù)據(jù)庫。鑒定成功的蛋白質(zhì)點(diǎn)根據(jù)aimGo數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)功能注釋進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 雙向電泳凝膠圖譜分析和質(zhì)譜鑒定

    分別提取對(duì)照組和處理組紫花苜蓿根部蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳,經(jīng)銀染后最終電泳圖譜見圖1?;贗mageMaster圖像軟件分析表明,對(duì)照組凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn)有(957±35)個(gè),而處理組(200 mmol/L NaCl處理)凝膠上蛋白質(zhì)有(935±27)個(gè),兩個(gè)試驗(yàn)組內(nèi)變異系數(shù)都在5%以內(nèi)。軟件匹配和手工匹配相結(jié)合,最終處理組和對(duì)照組間有725個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)成功匹配。選取相對(duì)豐度(vol%)發(fā)生1.5倍改變的點(diǎn)為差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn),結(jié)合 MALDI-TOF-TOF/MS 分析,Mascot 軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫Green Plants, 最終成功鑒定出21個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),為19種不同的蛋白質(zhì)(表1)。

    2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分類

    基于質(zhì)譜結(jié)果, 將這些蛋白的功能分為以下五大類。

    Ⅰ類:脅迫防御類蛋白,共有4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,spot 3)、2個(gè)抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,spot 8,18)、病原相關(guān)蛋白2(Pathogenesis-related protein 2,spot 12)。

    Ⅱ類:碳水化合物和能量代謝,共4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。線粒體蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase mitochondrial,spot 6)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases,spot 14)、線粒體ATP合酶β支鏈2(ATP synthase bate china 2 mitochondrial,spot 1)、核苷二磷酸激酶1(Nucleoside diphosphate kinase 1,spot 21)。

    Ⅲ類:次級(jí)代謝,共5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。異甘草黃苷2′-甲基轉(zhuǎn)移酶(Isoliquiritigenin 2′-O-methyltransferase,spot 7)、查爾酮還原酶(Chalcone reductase, spot 13)、3-異丙基蘋果酸脫氫酶(3-Isopropylmalate dehydrogenase,spot 16)、異黃酮還原酶(Isoflavone reductase,spot 11);乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase,spot 17)。

    Ⅳ類:轉(zhuǎn)錄、翻譯和調(diào)節(jié)類蛋白,共4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。真核轉(zhuǎn)錄起始因子5A-2(Eukaryotic translation initiation factor 5A-2,spot 4)、熱激蛋白70 (Heat shock protein 70,spot 5)、RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein,spot 9)、mRNA結(jié)合蛋白前體(mRNA binding protein precursor,spot10)。

    Ⅴ類:信號(hào)傳導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白,共3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。液泡膜聯(lián)蛋白VCaB42(Vacuole-associated annexin VCaB42,spot 15)、膜聯(lián)蛋白(Annexin,spot 19)、細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATP酶(Plasma membrane H+-ATPase,spot 2)。

    3 討論

    3.1 脅迫防御類蛋白

    生物正常的生理代謝過程,如光合成、光呼吸、脂肪酸氧化和衰老等都會(huì)產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species,ROS),但當(dāng)生物和非生物產(chǎn)生脅迫時(shí),將引發(fā)ROS的迸發(fā)。ROS具有多種功能,一方面,低水平的ROS可作為信號(hào)傳導(dǎo)分子,調(diào)控植物生長發(fā)育、細(xì)胞周期以及細(xì)胞程序化死亡、激素合成、生物或非生物的脅迫應(yīng)答等;另一方面,過量ROS可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂和其他細(xì)胞組分的損傷,對(duì)植物的生長產(chǎn)生危害[9]。植物體內(nèi)有多種ROS清除機(jī)制,以維持體內(nèi)正常的ROS水平。在本研究中,3個(gè)過氧化物類酶表達(dá)量上調(diào),其中包括2個(gè)抗壞血酸過氧化物酶(APX,8、18號(hào))和1個(gè)谷胱甘肽過氧化物酶(GPX,3號(hào))。APX和GPX分別以抗壞血酸和谷胱甘肽作為底物,與H2O2的親合力較強(qiáng),是植物體H2O2重要的清除劑。APX催化H2O2還原反應(yīng)中產(chǎn)生的單脫氫抗壞血酸,通過谷胱甘肽還原酶途徑被還原為抗壞血酸,而還原型谷胱甘肽作為還原劑參與抗壞血酸的再生,產(chǎn)生的氧化型谷胱甘肽可以通過谷胱甘肽還原酶得到還原,形成抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(Ascorbate-glutathione cycle),是植物清除H2O2的最主要途徑。有研究認(rèn)為,活性氧清除機(jī)制是植物抗鹽堿機(jī)制的重要組成部分[10]。在本研究中活性氧清除蛋白質(zhì)在鹽脅迫下表達(dá)量均上升,這有利于清除鹽脅迫引起的活性氧迸發(fā),維持苜蓿細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定。

    在本研究中還發(fā)現(xiàn)了病原相關(guān)蛋白2(Pathogenesis-related protein 2,PR2)在鹽脅迫下表達(dá)量上升。病原相關(guān)蛋白是一類由真菌、細(xì)菌和病毒等病原體入侵誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗逆性蛋白質(zhì),根據(jù)作用和功能的不同將其分為17個(gè)家族,本研究中鑒定的差異表達(dá)蛋白PR2屬于β-1,3-葡聚糖酶家族,其以探明的功能包括水解真菌性病原菌的細(xì)胞壁,參與植物生長發(fā)育的各個(gè)階段的調(diào)控[11]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下PR5蛋白質(zhì)表達(dá)量下降,而在抗鹽堿能力相對(duì)較強(qiáng)的鹽芥(Thellungiella halophila)中,鹽脅迫下PR5蛋白質(zhì)表達(dá)量下降[12],這表明部分PR蛋白質(zhì)也參與到鹽脅迫調(diào)節(jié)。在此前的研究中還未發(fā)現(xiàn)PR2與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān),其功能還有待深入研究。

    3.2 參與碳水化合物和能量代謝的相關(guān)蛋白

    植物生長發(fā)育過程中需要大量的能量以維持體內(nèi)正常的生理代謝,這些能量主要通過碳水化合物代謝,如糖酵解(Embden-Meyerhof-Parnas pathway,EMP)和三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)產(chǎn)生。在本研究中,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,14號(hào))在鹽脅迫下表達(dá)量上升。GAPDH是糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶,催化甘油醛-3-磷酸形成1,3-二磷酸甘油酸的可逆反應(yīng),是糖酵解(糖異生)中惟一的氧化(還原)反應(yīng)。此前對(duì)水稻的研究表明,抗鹽堿性水稻的材料中GAPDH蛋白表達(dá)量顯著高于敏鹽性材料,表明GAPDH的高表達(dá)可能與水稻抗鹽堿相關(guān)[13]。另有研究表明,非磷酸化GAPDH(NP-GAPDH)可催化糖酵解“旁路”反應(yīng),催化依賴于NADP+,將3-磷酸甘油醛氧化為3-磷酸甘油酸,同時(shí)伴有NADPH生成的不可逆反應(yīng)[14]。鹽脅迫下,GAPDH的表達(dá)量上升一方面可為機(jī)體合成代謝提供還原力NADPH,維持胞質(zhì)中NADPH的水平,另一方面在磷饑餓或ADP水平低下而無法合成ATP時(shí),可以使碳源順利流經(jīng)糖酵解途徑,保證逆境條件下碳源流的通暢[15]。本研究中,GAPDH在鹽脅迫下表達(dá)量上升可能是苜蓿適應(yīng)鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。

    線粒體是植物生成能量的主要細(xì)胞器,在本研究中鑒定出2個(gè)線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生改變。線粒體蘋果酸脫氫酶屬于NAD-依賴性MDH,其為三羧酸循環(huán)循環(huán)中的關(guān)鍵酶,催化蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換,生產(chǎn)ATP,為機(jī)體提供能量[16]。線粒體ATP合成酶參與氧化磷酸化和光合磷酸化,在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢的推動(dòng)下合成ATP,將能量用于合成生物中的能量通貨-ATP的能量轉(zhuǎn)換。這2個(gè)蛋白表達(dá)量的下降從一個(gè)側(cè)面表明了鹽脅迫下,紫花苜蓿能量代謝減緩,這與鹽脅迫下光合作用受阻而導(dǎo)致碳水化學(xué)物合成減少相關(guān)。此外研究還鑒定出1個(gè)核苷二磷酸激酶1(NDPK1)在鹽脅迫下表達(dá)量降低。NDPK被稱為ATP的管家酶,維持細(xì)胞中CTP、GTP、UTP的水平。在植物中NDPK已被證明參與干旱、寒害、熱和鹽脅迫的抗逆中,在水稻小穗期響應(yīng)鹽脅迫的蛋白質(zhì)研究中鑒定出該蛋白表達(dá)量下調(diào)[17]。

    3.3 次生代謝相關(guān)蛋白質(zhì)

    植物在多條代謝途徑中都會(huì)產(chǎn)生乙醇,但當(dāng)特定外界脅迫時(shí)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)乙醇積累,過量乙醇聚合成高活性的有毒分子,攻擊細(xì)胞內(nèi)親核物質(zhì)如核酸、蛋白和碳水化合物等,最終危害到植物的正常生長[18]。乙醇脫氫酶(ADH,17號(hào))是植物體內(nèi)主要短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶,生理學(xué)功能為催化伯醇和醛之間的可逆反應(yīng)。有研究表明,ADH的表達(dá)與干旱、低溫、病原菌入侵等生物逆境的應(yīng)答相關(guān)[19]。在本研究中,ADH在鹽脅迫下表達(dá)量下降,這與此前在水稻中的研究觀察到的結(jié)果相反[20],這可能與脅迫濃度和植物自身的抗鹽堿差異性相關(guān)。

    類黃酮化合物是植物合成的一類重要次生代謝產(chǎn)物,目前已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的有6 000多種,在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[21]。近期研究表明,類黃酮化合物還參與植物的脅迫防御中,如植物受微生物侵染時(shí)其作為植保素在植物體內(nèi)積累,或作為植物體內(nèi)活性氧的脫毒系統(tǒng)[22,23]。在鑒定的差異表達(dá)蛋白中有2個(gè)蛋白質(zhì)與類黃酮代謝途徑相關(guān),其中包括查爾酮還原酶(13號(hào))和查爾酮還原酶(11號(hào))。查爾酮還原酶是查爾酮合成類黃酮代謝分支的第一步催化酶。查爾酮還原酶是合成植物抗毒素類異黃酮的重要酶。本研究中,這2個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量都呈現(xiàn)出下降的趨勢,這表明鹽脅迫下,類黃酮合成代謝減緩。

    在鑒定的蛋白質(zhì)中,3-異丙基蘋果酸脫氫酶(16號(hào))表達(dá)量下升,該蛋白質(zhì)為異亮氨酸合成蛋氨酸過程中的催化蛋白酶。已有研究表明,異亮氨酸也是苜蓿抗?jié)B透脅迫的因子[24]。本研究中該蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào),有利于異亮氨酸的積累,可能是紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)機(jī)制之一。

    3.4 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控,蛋白質(zhì)合成和代謝類的蛋白質(zhì)

    植物感受到外界環(huán)境刺激,通過特定的受體將這一信號(hào)傳遞到細(xì)胞核,并誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)來適應(yīng)外界環(huán)境,在這過程中,受到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄、翻譯和剪切修飾等調(diào)控。在鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中,有3個(gè)蛋白質(zhì)參與到轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄調(diào)控,其中包括1個(gè)真核轉(zhuǎn)錄起始因子5A-2(eIF-5A-2,4號(hào))和2個(gè)RNA結(jié)合蛋白質(zhì)。eIF-5A是普遍存在于真核生物和原始細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄啟始因子。已有研究表明,eIF-5A與細(xì)胞中的許多生命活動(dòng)有關(guān),如細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)翻譯、mRNA降解、細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化及細(xì)胞衰老與凋亡等[25]。對(duì)擬南芥eIF-5A家族成員的分析表明,不同的家族成員參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與植物不同的生理防御相關(guān),其中eIF-5A-2參與擬南芥受到病毒感染和傷害后的信號(hào)傳導(dǎo),以及通過細(xì)胞分裂素信號(hào)通路調(diào)控?cái)M南芥根木質(zhì)部的發(fā)育,在細(xì)胞的分裂、生長和死亡中發(fā)揮著重要作用[24]。在本研究中,eIF-5A-2在鹽脅迫下表達(dá)量上升,表明其表達(dá)與鹽誘導(dǎo)相關(guān)。

    基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中每一步都需要大量的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)和RNA相互作用來起穩(wěn)定、保護(hù)、組裝和轉(zhuǎn)移等作用。近年來的研究表明,一些RNA結(jié)合蛋白質(zhì)參與動(dòng)植物各種脅迫調(diào)控并發(fā)揮著重要生理功能,如富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白質(zhì)調(diào)控植物逆境誘導(dǎo)反應(yīng),許多逆境因子,包括冷害、致傷、干旱、過敏和水逆境等均能誘導(dǎo)其表達(dá)量發(fā)生變化[26]。在本研究中mRNA結(jié)合蛋白質(zhì)(10號(hào))在鹽脅迫下表達(dá)量下降,而RNA結(jié)合蛋白質(zhì)(9號(hào))表達(dá)量則上升,表明鹽脅迫下紫花苜蓿在轉(zhuǎn)錄水平存在差異性調(diào)節(jié)機(jī)制。

    鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊增加,重新建立正常的蛋白質(zhì)折疊、構(gòu)象對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)尤為重要。熱激蛋白70(Hsp70)是重要的分子伴侶,在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象、阻止蛋白質(zhì)聚合、重折疊變性蛋白質(zhì)以及協(xié)助錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解等方面發(fā)揮著重要作用[27,28]。在本研究中,Hsp70(5號(hào))在鹽脅迫下表達(dá)量上升,這對(duì)維持體內(nèi)蛋白質(zhì)正常的生理功能有重要意義。

    3.5 信號(hào)傳導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白

    Ca2+是植物體內(nèi)重要的信號(hào)分子,在受到多種脅迫時(shí)都會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)中Δ[Ca2+]cyt,特定的膜聯(lián)蛋白質(zhì)(Annexins)通過結(jié)合Δ[Ca2+]cyt而進(jìn)行信息傳遞[29]。Annexins是一個(gè)多基因蛋白質(zhì),屬于Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白質(zhì)家族成員,通過與磷脂的結(jié)合以及與鈣離子的相互作用參與到各種膜有關(guān)的過程,其中包括信號(hào)傳導(dǎo)、自由基清除、DNA復(fù)制和細(xì)胞凋亡等過程。目前,最少有3條線支持這一結(jié)論的證據(jù):各種生物脅迫都會(huì)誘導(dǎo)Annexins表達(dá)量發(fā)生改變;改變某些Annexins的表達(dá)量將改變植物對(duì)非生物脅迫的耐受性;Annexins可能直接參與調(diào)節(jié)脅迫激活信號(hào)通路[30]。在本研究中,鑒定出2個(gè)膜聯(lián)蛋白質(zhì)表達(dá)量上升,分別為膜聯(lián)蛋白質(zhì)和液泡膜聯(lián)蛋白VCaB42,這表明鹽脅迫下紫花苜蓿信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生改變。

    將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡,減少細(xì)胞質(zhì)中Na+離子濃度是植物抗鹽脅迫的重要機(jī)制之一。在本研究中細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATP酶(15號(hào))表達(dá)量上升。質(zhì)膜H+-ATPase主要作用是形成跨膜的質(zhì)子梯度,驅(qū)動(dòng)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)主動(dòng)運(yùn)輸,進(jìn)而將Na+區(qū)隔在液泡中,減少對(duì)細(xì)胞器的毒害[31]。鹽脅迫下,該蛋白質(zhì)表達(dá)量上升有助于降低細(xì)胞基質(zhì)中鹽離子的濃度,從而減小鹽離子對(duì)植物的危害。

    4 結(jié)論

    根是植物感受多種脅迫傷害的最初位點(diǎn),根對(duì)脅迫的敏感程度直接關(guān)系到植物的生長,對(duì)根系響應(yīng)鹽脅迫的研究有助于更深入了解鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制。在本研究中,鑒定出19個(gè)不同的蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生改變,其中包括14個(gè)表達(dá)上調(diào)蛋白質(zhì),5個(gè)表達(dá)下降蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中大部分蛋白質(zhì)都是功能已知的蛋白質(zhì),此前在其他物種抗鹽堿脅迫中也鑒定出,部分蛋白質(zhì)在此前研究中未見報(bào)道,其具體功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為深入揭示紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為挖掘紫花苜蓿潛在抗鹽堿基因提供了數(shù)據(jù)。

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