納米粒子對(duì)amyloid-β聚集的影響的研究進(jìn)展

李冰石，薛 山，宋國(guó)麗

1)深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，深圳518060;2)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳518060

蛋白質(zhì)是生命的基本物質(zhì)，參與生物體代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)，執(zhí)行多種生物化學(xué)功能.當(dāng)?shù)鞍状x異常，在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周?chē)l(fā)生聚集，甚至纖維化時(shí)，就會(huì)引發(fā)多種疾病［1］.例如，類淀粉蛋白的纖維化，會(huì)導(dǎo)致阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)、帕金森癥和亨廷頓癥等多種神經(jīng)性疾?。?］.其中，AD又稱原發(fā)性老年癡呆癥，是一種致死性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，折磨著全球數(shù)千萬(wàn)人，目前還沒(méi)有精確的診斷工具和有效的治療手段，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，并伴隨各種神經(jīng)性的癥狀和行為障礙［3-4］.導(dǎo)致這一疾病的主要因素是β-類淀粉蛋白(amyloid-β，Aβ)在大腦皮層發(fā)生錯(cuò)誤聚集，生成了難溶的類淀粉纖維，纖維進(jìn)而聚集成斑塊，引起一系列的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂［2］.其中，Aβ聚集形成的β-折疊狀中間體也可能具有神經(jīng)毒性［5］.

Aβ一般含有36～43個(gè)氨基酸殘基［6］，由它的前體蛋白——類淀粉前體蛋白(amyloid precursor protein)通過(guò)水解酶水解得到［7］.類淀粉蛋白的纖維化過(guò)程極為類似，即都包括成核和生長(zhǎng)延伸階段［8-9］，并且形成 β 片層折疊結(jié)構(gòu)［10］.兩個(gè) Aβ 肽鏈分子的疏水部分結(jié)合在一起，形成三明治狀的β-交叉結(jié)構(gòu)，多個(gè)三明治狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步通過(guò)疏水作用疊在一起，形成一個(gè)含有疏水核心及表面的膠束狀寡聚體［11-13］;寡聚體作為纖維核心，通過(guò)疏水作用、氫鍵和芳香基團(tuán)間的堆疊等相互作用［14-15］，進(jìn)一步聚集和延伸，形成較穩(wěn)定具有反向平行螺旋結(jié)構(gòu)的原纖維;原纖維進(jìn)而生長(zhǎng)和纏繞形成成熟的更粗的纖維［16-17］.Aβ1-40比 Aβ1-42更為常見(jiàn)，但 A-β1-42相對(duì) A-β1-40更容易纖維化，毒性更強(qiáng)［12，18-19］.

揭示Aβ在分子水平上的識(shí)別和自我組裝原理是有效控制Aβ聚集和纖維化的關(guān)鍵，而抑制Aβ的聚集，溶解已形成的Aβ聚集體則被認(rèn)為是一種治療AD的潛在方法.正因如此，對(duì)Aβ的纖維化聚集的影響因素研究日益引起關(guān)注.研究表明，Aβ的聚集除了受溶液pH值、蛋白濃度、培養(yǎng)時(shí)間和溫度變化等因素的影響外［17，20-21］，納米粒子也對(duì)Aβ的聚集具有重要影響.納米粒子因其獨(dú)特的物理、化學(xué)、電學(xué)和生物相容等性能，已成為生物和生物化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)不可或缺的工具［22-24］.本文綜述了金、金屬?gòu)?fù)合物、金屬氧化物及有機(jī)-無(wú)機(jī)等納米粒子對(duì)Aβ的聚集影響的最新研究進(jìn)展.

1 β-類淀粉蛋白聚集的影響因素

1.1 金納米粒子對(duì)Aβ聚集的影響

金納米粒子在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用廣泛［22，25］.Liao等［26］通過(guò)Aβ1-40單體和預(yù)先培育的Aβ纖維與不同濃度的金納米粒子共同培育，研究金納米粒子對(duì)Aβ聚集的影響.結(jié)果顯示，未經(jīng)修飾的金納米粒子能抑制Aβ纖維的形成，且改變?cè)w維的狀態(tài)，使其生成片狀纖維和球形寡聚體，如圖1(a)所示;金納米粒子還能影響已生成的Aβ成熟纖維，將其變成短的無(wú)定形狀態(tài)，并且金納米粒子會(huì)優(yōu)先結(jié)合Aβ纖維而不是無(wú)定形的聚集體，如圖1(b)所示.通過(guò)表面修飾共軛的羧基和氨基后金納米粒子分別帶負(fù)電荷和正電荷，只有未經(jīng)修飾和羧基修飾帶負(fù)電荷的金納米粒子才能抑制Aβ聚集，這說(shuō)明負(fù)電勢(shì)是影響Aβ聚集的關(guān)鍵.疏水金納米粒子與Aβ間的疏水作用只能影響纖維形成的成核階段，而隨后的延長(zhǎng)生長(zhǎng)階段則是通過(guò)帶電納米粒子的靜電作用來(lái)調(diào)節(jié).Majzik等［27］通過(guò)金納米粒子與Aβ1-42共同培育發(fā)現(xiàn)Aβ1-42分子能包裹在金納米粒子的表面，使金納米粒子無(wú)法團(tuán)聚成簇，這與Liao等［26］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.Lee等［28］利用大腦內(nèi)脂質(zhì)雙分子層作為基底，研究金納米粒子對(duì)Aβ聚集的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金納米粒子存在時(shí)，流動(dòng)的大腦脂質(zhì)雙分子層可以為金納米粒子和Aβ提供結(jié)合位點(diǎn)，金納米粒子能促進(jìn)大尺寸的Aβ聚集體快速形成，更奇特的是Aβ斑塊形成前并未形成Aβ纖維結(jié)構(gòu);當(dāng)沒(méi)有金納米粒子時(shí)，則沒(méi)有形成大尺寸的Aβ聚集體.這一結(jié)果說(shuō)明金納米粒子能夠改變?cè)谥|(zhì)雙分子層上的Aβ的2級(jí)結(jié)構(gòu)及組裝路徑.

圖1 不同形態(tài)下的Aβ在加入不同濃度未經(jīng)修飾的金納米粒子情況下培育后的TEM圖［26］Fig.1 Morphologies of the Aβ species respectively with different concentration AuNPs monitored by TEM［26］

有機(jī)分子姜黃素能在體外和體內(nèi)抑制Aβ的聚集［29］，且有效地抑制由金屬離子(如 Cu2+和Zn2+)誘導(dǎo)引起的Aβ的纖維化聚集［30］.Palmal等［31］用羧基修飾的姜黃素和伯胺封端的氧化硅包覆的金納米粒子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合得到了水溶性的姜黃素修飾的金納米粒子.研究發(fā)現(xiàn)該復(fù)合粒子不僅能有效抑制Aβ的纖維化，還能分解已聚集的Aβ纖維，其效果超過(guò)單獨(dú)作用的金納米粒子、姜黃素或兩者的混合物.這可能是因?yàn)榻?姜黃素復(fù)合納米粒子具有很好的水溶性及金納米粒子表面結(jié)合了更多的姜黃素基團(tuán).通過(guò)對(duì)小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞的毒性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，在姜黃素修飾后的金納米粒子的存在條件下，細(xì)胞的存活率由只有Aβ纖維存在時(shí)的50%提高到90%.實(shí)驗(yàn)顯示被分解后的Aβ纖維片段和寡聚體對(duì)小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞毒性很低，基本不影響其存活率.這一結(jié)果說(shuō)明，這種抑制Aβ纖維化和分解Aβ纖維的方法對(duì)治療AD癥極具潛力.

1.2 金屬?gòu)?fù)合物對(duì)Aβ聚集的影響

有研究表明，一些金屬離子如 Cu2+、Zn2+、Fe3+和Al3+能影響Aβ的聚集［32-41］，而且是老年斑形成過(guò)程中的生長(zhǎng)因子，在老年斑和AD病人的大腦皮質(zhì)組織中也發(fā)現(xiàn)了高濃度的上述金屬離子［42-43］.

在過(guò)渡金屬?gòu)?fù)合物中，2價(jià)的銅、鉑和釕的復(fù)合粒子能夠結(jié)合和抑制 Aβ的聚集［44-46］.Streltsov等［47］使用X射線吸收光譜、動(dòng)態(tài)光散射及密度泛函理論等手段研究了鉑金屬?gòu)?fù)合物與Aβ1-16和Aβ1-40蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)含有1，10-鄰二氮雜菲的2價(jià)鉑復(fù)合物(L-PtCl2)能與Aβ側(cè)鏈的組氨酸咪唑相互結(jié)合，改變蛋白的生化和生理性質(zhì).他們認(rèn)為芳香分子1，10-鄰二氮雜菲使鉑復(fù)合物能夠優(yōu)先與Aβ上的組氨酸結(jié)合.Man等［48］利用3組3價(jià)銥和3價(jià)銠的復(fù)合物(圖2)來(lái)抑制Aβ1-40蛋白的聚集，并研究了幾種不同的平面芳香性碳氮共配體對(duì)配合物抑制作用的影響.圖2顯示，可溶金屬配合物都有不穩(wěn)定的配體，可以被Aβ1-40蛋白中組氨酸的N端取代.通過(guò)熒光測(cè)試，當(dāng)配合物的中心金屬是銠，碳氮共配為2-苯基吡啶，配合物濃度為5 μmol/L時(shí)抑制效果最好，幾乎完全抑制，這一結(jié)果可能與大的平面碳氮共配體的空間效應(yīng)有關(guān).

圖2 三組承載不同金屬中心和碳氮共配體的可溶金屬?gòu)?fù)合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)［48］Fig.2 Chemical structures of the solvato complexes bearing different metal centers and C/N ligands［48］

金屬?gòu)?fù)合物結(jié)合了無(wú)機(jī)金屬和有機(jī)多功能性基團(tuán)的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)無(wú)機(jī)物的官能團(tuán)與Aβ中的氨基酸形成配體來(lái)抑制Aβ纖維的生成，這比選擇單一的無(wú)機(jī)金屬粒子或有機(jī)化合物作為抑制劑更有應(yīng)用前景.

1.3 金屬氧化物對(duì)Aβ聚集的影響

關(guān)于金屬氧化物對(duì)Aβ纖維化過(guò)程的影響研究，目前開(kāi)展得較少，已報(bào)道的研究主要是在金屬氧化物粒子表面包裹帶電的有機(jī)物，通過(guò)納米粒子的表面吸附，增大局部蛋白濃度及有機(jī)基團(tuán)與Aβ單體或者寡聚體之間的相互作用，從而影響Aβ的聚集纖維化過(guò)程.

Wu 等［49］研究了 TiO2、SiO2、ZrO2和CeO2等氧化物納米粒子對(duì) Aβ聚集的影響，研究發(fā)現(xiàn)，TiO2能縮短纖維生成的成核階段，促進(jìn)Aβ纖維的生成，而其他氧化物粒子對(duì)其幾乎沒(méi)有影響.Wu等認(rèn)為這一結(jié)果證明納米粒子對(duì)Aβ聚集的影響取決于粒子的表面吸附能，而不是粒徑大小.TiO2將Aβ吸附到表面，使其在溶液和粒子表面達(dá)到一個(gè)平衡，吸附到粒子表面的Aβ局部濃度升高，從而加快了低聚物的形成.

超順磁氧化鐵納米粒子具有較好的生物相容性和特有的磁性，是具有應(yīng)用前景的生物醫(yī)學(xué)材料［50］.Mahmoudi等［51］用氨基和羧基修飾、葡萄聚糖包裹的超順磁Fe2O3納米粒子，并研究了其包裹層的厚度和帶電情況對(duì)Aβ聚集的影響.他們發(fā)現(xiàn)帶正電的雙層包覆的磁性Fe2O3納米粒子對(duì)Aβ的聚集有雙重影響，如圖3，低粒子濃度時(shí)，抑制其聚集;而高濃度時(shí)，通過(guò)縮短其成核時(shí)間促進(jìn)其纖維化.Cabaleiro-Lago等［52］研究的由氨基修飾的聚苯乙烯納米粒子對(duì)Aβ的聚集影響實(shí)驗(yàn)中也有相似的發(fā)現(xiàn).納米粒子表面的正電荷可能與Aβ帶負(fù)電荷的部分相互作用，改變Aβ低聚物的構(gòu)象使其更容易聚集.但是由羧基修飾的葡萄聚糖包裹的帶負(fù)電的磁性Fe2O3納米粒子，不論單層還是雙層，在很低的粒子濃度條件下都會(huì)延遲或抑制Aβ的纖維化過(guò)程，其影響隨粒子濃度增大無(wú)明顯變化.一個(gè)可能的機(jī)理是，磁性Fe2O3納米粒子的表面負(fù)電荷和Aβ的疏水核心中的氨基骨架結(jié)構(gòu)相互作用，改變了疏水核心的結(jié)構(gòu)從而抑制蛋白聚集.另外，磁性Fe2O3的粒子尺寸也是重要的影響因素:當(dāng)減少葡萄聚糖包裹層的厚度而減少磁性Fe2O3粒子的尺寸時(shí)，粒子對(duì)Aβ纖維化過(guò)程的抑制更明顯.

圖3 Aβ單體(0.5 μmol/L)和雙層帶負(fù)電、不帶電、帶正電的由葡萄聚糖包裹的超順磁Fe2O3納米粒子(100 μg/mL)共同培育2 400 min后，兩種不同放大倍率的TEM圖［51］.當(dāng)帶正電的葡萄聚糖包裹的超順磁Fe2O3納米粒子存在時(shí)，只發(fā)現(xiàn)了很短的纖維(圖中箭頭標(biāo)出)Fig.3 (Color online)TEM images of Aβ fibrils after 2 400 min incubation of A β monomers(0.5 μmol/L)with double layer negative(left)，plain(middle)，and positive(right)dextran-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles(SPIONs)(100 μg/mL)［51］.only very small fibrils are observed in the case of the positively charged dextran-coated SPIONs(as arrows indicated)

1.4 有機(jī)-無(wú)機(jī)納米粒子對(duì)Aβ聚集的影響

有機(jī)聚合物因具有很大的表面積及有可作為反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)的多官能團(tuán)，對(duì)Aβ的聚集有顯著影響.Cabaleiro-Lago等［53］剛開(kāi)始發(fā)現(xiàn)異丙基丙烯酰胺納米粒子能與Aβ單體和寡聚體相互作用，抑制其成核過(guò)程進(jìn)而延長(zhǎng)其纖維化進(jìn)程.在不同濃度氨基改良的聚苯乙烯納米粒子存在下Aβ纖維化的動(dòng)力學(xué)顯示，蛋白濃度一定時(shí)，隨著納米粒子總表面積的變化會(huì)產(chǎn)生不同的效果:當(dāng)納米粒子單位表面積上蛋白濃度較大時(shí)，可促進(jìn)Aβ纖維化進(jìn)程;當(dāng)納米粒子單位表面積上蛋白濃度較小時(shí)，則抑制Aβ 纖維化［52］.Cabaleiro-Lago等［52］提出當(dāng)Aβ 和納米粒子共存時(shí)，至少存在兩個(gè)不同的聚集路徑.路徑1:Aβ單體在溶液中能自由聚集形成纖維，聚集速率v=vsolution;路徑2:Aβ單體吸附在粒子表面發(fā)生聚集，聚集速率v=vparticle(圖4).整個(gè)纖維化過(guò)程取決于這兩種不同路徑的貢獻(xiàn)作用大小.未加入顆粒時(shí)，Aβ單體在溶液中能自由結(jié)合形成纖維;當(dāng)加入納米顆粒且濃度較低時(shí)，除溶液中自由形成纖維外，顆粒表面也會(huì)吸附Aβ單體，形成纖維核心，并進(jìn)一步生成Aβ纖維.纖維生成的總速率大于未加入顆粒時(shí)的速率;當(dāng)顆粒濃度高到某一定值時(shí)，由于比表面積較大，溶液中的大部分Aβ單體被吸附到粒子表面，導(dǎo)致溶液中的Aβ濃度很小，溶液中形成纖維的速率大大降低，而單個(gè)粒子表面所吸附的Aβ單體也很少，粒子表面的Aβ纖維化也很難進(jìn)行，這樣粒子對(duì)纖維生成具有抑制作用，如圖4.

圖4 不同濃度的納米顆粒對(duì)Aβ聚集的不同影響效果示意圖，其中橢圓小顆粒代表Aβ單體，圓球代表納米粒子［52］Fig.4 (Color online)Schematic illustration of the effect of nanoparticles with different concentrations on Aβ aggregation.Ellipses representing Aβ monomers and circles representing nanoparticles［52］

丙炔苯丙胺是一種單胺氧化酶的抑制劑.有研究表明，單胺氧化酶抑制劑能夠減少神經(jīng)損害［54］，且可能抑制 Aβ 纖維的形成［55］.Baysal等［56］用水-油-水乳化液蒸發(fā)法制備了一種裝載了丙炔苯丙胺的聚乳酸-b-聚乙二醇有機(jī)納米聚合粒子，并研究了該納米粒子對(duì)Aβ纖維的去穩(wěn)定化影響.研究發(fā)現(xiàn)，隨著負(fù)載物丙炔苯丙胺量的增加，其對(duì)Aβ纖維生成的抑制效果越好，且在前6 h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)抑制效果也增加，6 h后達(dá)到最好效果.在前2 h內(nèi)，聚乳酸-b-聚乙二醇納米粒子上負(fù)載的丙炔苯丙胺的釋放率約為70%，這種井噴式的釋放是由于粒子上負(fù)載的丙炔苯丙胺快速溶解;丙炔苯丙胺的釋放在2～10 h達(dá)到平衡，可持續(xù)72 h.其對(duì)Aβ纖維形成的主要影響階段還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)確定.

已有文獻(xiàn)報(bào)道表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)能與Aβ相互作用，改變其聚集路徑，促進(jìn)其組裝成低毒的聚合結(jié)構(gòu)［57］.另外，硒蛋白具有抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用，能夠預(yù)防阿爾茨海默癥的發(fā)生［58］.Zhang等［59］合成了一種由多肽四環(huán)素-1(Tet-1)包裹的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯穩(wěn)定的硒納米粒子(Tet-1-EGCG@Se)并研究了該有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合納米粒子對(duì)Aβ聚集的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)該納米粒子對(duì)Aβ有很強(qiáng)的吸引.Tet-1-EGCG@Se和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯穩(wěn)定的硒納米粒子(EGCG@Se)都能有效抑制Aβ的聚集使其生成小的寡聚體，如圖5.其中，前者比后者抑制效果更好，可能原因是Tet-1-EGCG@Se粒子帶正電，且Tet-1能與Aβ發(fā)生疏水性相互作用.不僅如此，Tet-1-EGCG@Se復(fù)合粒子還能有效地將成熟的Aβ纖維分解，使其轉(zhuǎn)化成隨機(jī)盤(pán)繞的無(wú)定形結(jié)構(gòu).該有機(jī)/無(wú)機(jī)復(fù)合納米粒子在抑制和分解Aβ纖維方面作用顯著，是一種潛在的治療劑.但它與Aβ和纖維的具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究，并進(jìn)行更多的體外和體內(nèi)研究來(lái)驗(yàn)證其在治療阿爾茨海默癥方面的效果以及在其他蛋白類疾病上的應(yīng)用.

有機(jī)納米聚合物粒子具有獨(dú)特的尺寸效應(yīng)，可以穿透生物屏障(如腦-血屏障)，將藥物分子更準(zhǔn)確的運(yùn)送到目標(biāo)區(qū)域;并且能傳送不溶性藥物分子，運(yùn)送完成后在體內(nèi)被分解清除，具有低毒性等優(yōu)點(diǎn)，因而在新的藥物傳送系統(tǒng)中具有重要應(yīng)用前景［60-61］.這些優(yōu)點(diǎn)對(duì)于設(shè)計(jì)可作為Aβ纖維抗體載體的納米粒子用于治療阿爾茨海默癥具有重要意義.

圖5 Aβ聚集體形成的TEM圖［59］Fig.5 TEM images of Aβ aggregates［59］

結(jié) 語(yǔ)

Aβ的纖維化被認(rèn)為是導(dǎo)致AD的重要原因，纖維化速度的加快可能增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而抑制Aβ聚集和纖維的形成則被認(rèn)為是對(duì)AD極富潛力的治療方法.很多類淀粉蛋白可以吸附在不同基質(zhì)上，針對(duì)Zn2+、Cu2+及Cu+等金屬離子所引起的Aβ的無(wú)定形聚集，本課題組已開(kāi)展相關(guān)研究，試圖尋找抑制或逆轉(zhuǎn)Aβ聚集的方法.前期研究發(fā)現(xiàn):硒蛋白P的組氨酸富集區(qū)(His-rich domain of selenoprotein P，SelP-H)對(duì)Zn2+、Cu2+及Cu+具有較高的親和力，通過(guò)螯合Zn2+、Cu+及Cu2+，從而有效抑制Zn2+、Cu+及Cu2+誘導(dǎo)的Aβ的無(wú)定形聚集，及其引發(fā)的ROS的生成及神經(jīng)毒性.因此，SelP-H通過(guò)螯合金屬離子，從而調(diào)控金屬離子引發(fā)的Aβ的聚集，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，可能在延緩AD進(jìn)展方面具有一定的潛力.而具有小尺寸和高比表面積的納米粒子，對(duì)很多類淀粉蛋白的聚集過(guò)程具有重要的影響.雖然納米粒子和Aβ相互作用的研究及利用納米技術(shù)來(lái)治療AD已取得顯著進(jìn)展［62-63］，然而，納米粒子對(duì)各種 Aβ聚集體如Aβ斑塊的形成的影響及其作用機(jī)理，抑制Aβ聚集過(guò)程中所產(chǎn)生的寡聚體等中間物對(duì)細(xì)胞毒性大小等問(wèn)題仍有待進(jìn)一步深入研究.探索某種納米粒子與Aβ的相互作用，有助于了解Aβ的聚集機(jī)理及粒子對(duì)Aβ聚集的影響，設(shè)計(jì)和制備出特定的具有生物相容性、低毒性、副作用小和具有可降解性的納米粒子，抑制Aβ的聚集或破壞其Aβ纖維結(jié)構(gòu)，這將是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向.

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