蘿卜硫素預處理對大鼠心肌缺血再灌注保護作用的研究

王 策

(南陽醫(yī)學高等?？茖W校 基礎醫(yī)學部，河南 南陽473000)

心肌缺血再灌注損傷是臨床心血管科常見病理現(xiàn)象，常發(fā)生于溶栓治療、冠狀動脈介入治療、冠狀動脈支架植入、冠狀動脈搭橋術等疾病過程中。心肌缺血再灌注發(fā)生后會產生缺氧復氧再損傷。蘿卜硫素(Sulforaphane)，又稱“萊菔硫烷”，在西蘭花、芥藍、北方圓紅蘿卜等十字花科植物中含量較豐富，是常見的抗氧化劑。現(xiàn)代藥理研究表明蘿卜硫素具有良好的抗氧化、抗腫瘤作用［1］。曲震理［2］報道了蘿卜硫素具有良好的抗體外培養(yǎng)心肌細胞凋亡的作用。關于蘿卜硫素對在體大鼠心肌缺血再灌注氧化損傷的影響，國內外文獻少見報道。本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，以心肌酶學、心肌細胞凋亡及凋亡基因表達為觀察指標，研究蘿卜硫素對心肌缺血再灌注損傷的影響，以期為心肌缺血再灌注損傷干預開辟新的途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 27 只SDF 級雄性SD 大鼠購自河南省動物試驗中心，6 ～7 周齡，重量0.225 ～0.260 kg，證書編號SCXC(豫)2012 -0003。

1.2 藥物和試劑 蘿卜硫素(購自上海百士凱科技公司，純度＞95%);TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)、抗熒光淬滅封片液(購自北京中杉科技有限公司);Bcl-2、Bax 試劑盒(購自大連寶生物工程有限公司)等。

1.3 實驗儀器 BL -420E + 生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);OLYMPUS 熒光顯微鏡(日本OLYMPUS 公司);7020 全自動生化分析儀(日本日立公司)等。

1.4 實驗分組及造模 27 只SD 大鼠以普通飼料分籠喂養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)3 d 后，隨機分為假手術組、對照組、蘿卜硫素組，每組9 只。在冠狀動脈左室支結扎前2 h，蘿卜硫素組自尾靜脈注射蘿卜硫素(5 mg/kg)，假手術組和對照組術前2 h 自尾靜脈注射等量生理鹽水。參照文獻方法制作大鼠心肌缺血再灌注模型［3］。稱重，以5%水合氯醛(200 mg/kg)進行腹腔麻醉后仰臥位固定于小動物解剖臺上，常規(guī)氣管插管及開胸，完全暴露心臟，以5 -0 號手術線結扎冠狀動脈左室支，結扎后心肌顏色先變白而后變紫紺提示結扎成功。假手術組冠狀動脈左室支只穿線不結扎，其余2 組行缺血再灌注。結扎20 min后松解結扎線，再灌注1 h。再灌注1 h 后采血并處死大鼠，迅速取出心臟。血液以3 000 r/min 離心10 min 取血清，分離血清用于檢測LDH、CK-MB、SOD活性及MDA 含量;同時取部分心肌組織常規(guī)固定、包埋和制片，用于檢測心肌細胞凋亡和Bcl -2、Bax表達。

1.5 檢測指標 ①心肌抗氧化指標檢測 用7020全自動生化分析儀檢測LDH、CK-MB、SOD 活性及MDA 含量。②心肌凋亡細胞檢測 操作步驟按照TUNEL 試劑盒說明書進行，DAB 顯色，用熒光顯微鏡觀察:未凋亡心肌細胞發(fā)出藍色熒光，凋亡心肌細胞核發(fā)出綠色熒光。在200 倍視野下，隨機選擇缺血區(qū)5 個無重疊視野，計數陽性凋亡細胞，計算心肌細胞凋亡指數(AI)，AI =陽性凋亡細胞/總細胞數×100%。③心肌組織Bcl-2、Bax 表達檢測 按照Bcl-2、Bax 試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學方法 測量數據用SPSS 13.0 軟件包處理，計量資料用均數±標準差(x ±s)表示，采用t檢驗，P ＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 抗氧化指標檢測 與假手術組比較，對照組大鼠血清LDH、CK-MB 及MDA 含量顯著升高，SOD活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);相比對照組，蘿卜硫素干預可以顯著降低血清中LDH、CK-MB 活性及MDA 含量(P ＜0.05)，顯著升高血清中SOD 活性(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清抗氧化指標及心肌凋亡指數比較(n=9， ±s)

表1 各組大鼠血清抗氧化指標及心肌凋亡指數比較(n=9， ±s)

注:與假手術組比，1)P ＜0.05;與對照組比，2)P ＜0.05。

組別 SOD(U/mL) LDH(U/mL) CK-MB(U/mL) MDA(c/nmol·mL -1)AI/%假手術組 146.35 ±7.16 2.15 ±1.02 0.76 ±0.28 2.26 ±0.82 2.35 ±0.96對照組 87.21 ±3.861) 7.71 ±1.261) 6.28 ±1.191) 4.81 ±0.151) 20.05 ±1.161)蘿卜硫素組 118.19 ±6.612) 5.38 ±1.172) 2.27 ±1.212) 3.15 ±1.082) 15.76 ±2.152)

2.2 心肌細胞凋亡檢測 心肌組織切片經熒光染色處理后，在熒光顯微鏡下可看到正常心肌細胞核呈藍色熒光，著色淺而均勻;凋亡細胞核固縮，或碎為不規(guī)則狀，呈現(xiàn)綠色明亮的強熒光反應。見圖1。假手術組可見有少量散在的綠色熒光染色細胞核，對照組綠色熒光染色細胞數量明顯增多，蘿卜硫素干預組綠色熒光染色細胞較對照組明顯減少，提示大鼠經蘿卜硫素干預后心肌凋亡細胞明顯減少。與假手術組比較，對照組大鼠凋亡指數顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);與對照組比，蘿卜硫素干預組凋亡指數顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠心肌細胞凋亡熒光染色結果×200 白色箭頭所示為凋亡細胞。

2.3 心肌Bcl -2、Bax 表達檢測 與假手術組比，對照組Bcl-2 表達下降，Bax 表達上升，Bcl-2/Bax比值下降，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);與對照組比較，蘿卜硫素干預組Bcl -2 表達上升，Bax 表達下降，Bcl -2/Bax 比值上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2

表2 各組大鼠心肌凋亡蛋白Bcl-2、Bax mRNA表達比較(n=9， ±s)

表2 各組大鼠心肌凋亡蛋白Bcl-2、Bax mRNA表達比較(n=9， ±s)

注:與假手術組比，1)P ＜0.05;與對照組比，2)P ＜0.05。

組別Bcl-2mRNA BaxmRNA Bcl-2/Bax假手術組1.58 ±0.02 0.45 ±0.03 3.41 ±0.02對照組 0.69 ±0.051) 0.93 ±0.051) 0.67 ±0.061)蘿卜硫素組 0.87 ±0.022) 0.76 ±0.032) 1.21 ±0.042)

3 討論

缺血再灌注損傷的發(fā)生機制尚未清楚。國內外許多學者［4-5］認為再灌注損傷伴隨出現(xiàn)炎癥反應，由于細胞浸潤，釋放炎癥因子，最終導致血管的內皮細胞損傷，并伴隨鈣超載等。心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時，氧自由基和內源性氧自由基清除酶之間失去平衡，前者大量出現(xiàn)，攻擊細胞，引發(fā)脂質超氧化反應，導致細胞損傷，隨之使MDA 釋放，血清含量增加，因此MDA 含量可以體現(xiàn)超氧化反應的程度，也是對細胞受損程度的一種間接體現(xiàn)。該研究顯示，對照組血清MDA 含量明顯增加(P ＜0.05)，說明再灌注導致細胞損傷。同時蘿卜硫素干預組血清MDA、LDH 及CK - MB 活性 均 顯 著降 低(P ＜0.05)，血清中SOD 活性顯著升高(P ＜0.05)，提示蘿卜硫素預處理具有明顯的抗脂質氧化作用。

缺血再灌注后心肌損傷主要表現(xiàn)形式是細胞凋亡。該實驗結果顯示，蘿卜硫素組可降低心肌細胞凋亡指數(P ＜0.05)，上調凋亡基因Bcl -2 的表達，降低Bax 的表達，使Bcl-2/Bax 比值上升，提示蘿卜硫素提前干預對缺血再灌注所致大鼠心肌細胞凋亡具有保護作用，與伊雪［6］等的結果一致。

綜上所述，蘿卜硫素能通過抗脂質過氧作用減少心肌細胞凋亡，對心肌缺血再灌注損傷產生保護作用。

［1］Dandawate P，Padhye S，Ahmad A，et al.Novel strategies targeting cancer stem cells through phytochemical and their analogs［J］.Drug Deliv Transl Res，2013，3(2):165 -182.

［2］曲震理.蘿卜硫素對阿霉素所致體外培養(yǎng)心肌細胞凋亡的影響［J］.社區(qū)醫(yī)學雜志，2014，12(2):47 -48.

［3］Yang J，Chen L，Yang J，et al.MicroRNA-22 targeting CBP protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through anti-apoptosis in rats［J］.Mol Biol Rep，2014，41(1):555-561.

［4］Skovsted GF，Kruse LS，Larsen R，et al.Heart ischaemia-reperfusion induces local up-regulation of vasoconstrictor endothelin ETB receptors in ratcoronary arteries downstream of occlusion［J］.Br J Pharmacol，2014，171(11):2726 -2738.

［5］Song X，Chen A，Liu Y，et al.Carvacrol pretreatment attenuates myocardial oxidative stress and apoptosis following myocardial ischemia-reperfusion in mice［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2013，33(11):1624 -1627.

［6］伊 雪，王 帥，鄔鵬宇，等.萊菔硫烷預處理對大鼠移植心臟冷缺血再灌注損傷的影響［J］.實用醫(yī)學雜志，2013，29(23):3850 -3852.