TRIM28對肺鱗癌SK-MES-1細胞生長的影響*

馬春虎，許 倩，沈榮飛，肖鑠洋，李冰清，任 祎（.承德醫(yī)學院，河北承德 067000；.承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院0級臨本0班）

TRIM28對肺鱗癌SK-MES-1細胞生長的影響*

馬春虎1，許 倩1，沈榮飛2，肖鑠洋2，李冰清2，任 祎2
（1.承德醫(yī)學院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院2012級臨本10班）

目的：探討TRIM28基因?qū)Ψ西[癌細胞系SK-MES-1細胞生長的影響。方法：采用RNA干擾技術(shù)抑制肺鱗癌SK-MES-1細胞TRIM28基因的表達，通過RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測抑制效果，應(yīng)用克隆形成實驗和MTT實驗觀察TRIM28基因被抑制后SK-MES-1細胞的增殖和活性。結(jié)果：RNA干擾技術(shù)能有效抑制TRIM28基因在肺鱗癌SK-MES-1細胞中的表達。TRIM28基因被抑制后，肺鱗癌SK-MES-1細胞的活性和生長受了到明顯抑制。結(jié)論：TRIM28對肺鱗癌SK-MES-1細胞的生長具有促進作用。

肺鱗癌；TRIM28；RNA干擾

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中80%以上為非小細胞肺癌，鱗狀細胞癌是其中最主要的類型［1］。肺癌5年存活率僅為15%，大部分患者確診時已到晚期［2］。因此，尋找新的治療靶點迫在眉睫。最新研究發(fā)現(xiàn)，TRIM28是腫瘤發(fā)生中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子［3］。作為一種核共抑制因子，TRIM28與細胞DNA損傷后染色質(zhì)介導的轉(zhuǎn)錄抑制和DNA修復有關(guān)。TRIM28能通過抑制p53的活性從而增強細胞對DNA損傷的敏感性并抑制細胞凋亡；另外，當TRIM28異常表達時，可抑制E2F1的轉(zhuǎn)錄及促凋亡功能。但有關(guān)TRIM28基因在肺癌中生物學作用的報道較少。本研究采用RNA干擾技術(shù)觀察了TRIM28基因?qū)Ψ西[癌SK-MES-1細胞生長的影響，初步探討TRIM28在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺鱗癌細胞系SK-MES-1為承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國GIBICO公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq酶，日本TaKaRa公司；兔抗人TRIM28多克隆抗體，美國Proteintech公司。

1.2 細胞培養(yǎng) SK-MES-1細胞采用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于CO2培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）靜置培養(yǎng)。當細胞生長狀態(tài)良好并且融合度達到80%左右時，用2.5g/L的胰蛋白酶消化進行細胞傳代。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染SK-MES-1細胞 TRIM28-siRNA：5'-GATGA TCCCTACTCAAGTGTT-3'，對照siRNA（scrambled）：5'-GTTC TCCGAACGTGTCACGT-3’（上海吉瑪生物試劑公司）。

SK-MES-1細胞至對數(shù)生長期后以2×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板，隨機分為實驗組和對照組，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染TRIM28-siRNA和對照siRNA，終濃度為40nM，每組設(shè)3個復孔。轉(zhuǎn)染6h后更換成DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)染后SK-MES-1細胞TRIM28 mRNA和蛋白表達的檢測 轉(zhuǎn)染48h時收集細胞，分別檢測SK-MES-1細胞TRIM28 mRNA和蛋白的表達。

1.4.1 RT-PCR法檢測TRIM28 mRNA：提取SK-MES-1細胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系為：2.5μl cDNA模板，20μmol/L引物（TRIM28上游引物：5'-ATGTGAGCGTGTACTGCTGG-3’、下游引物：5'-ACGTCTGCCTTGTCCTCAGT-3'），0.2mM dNTP，50mM Tris-HCl（pH 8.3），10mM KCl，5mM （NH4）2SO4，2mM MgCl2，0.75U Taq酶，總體積為25μl。反應(yīng)條件：95℃變性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，30個循環(huán)后，72℃延伸7min。

1.4.2 Western-blot法檢測TRIM28蛋白：收集SK-MES-1細胞蛋白，常規(guī)BCA方法進行定量。制備15%聚丙烯酰胺凝膠，進行SDS-PAGE電泳（2-3h），轉(zhuǎn)移到PVDF膜（50min），室溫5% BSA封閉1h，稀釋兔抗人TRIM28多克隆抗體（稀釋度1：1000）4℃孵育過夜，ECL發(fā)光液顯色曝光。

1.5 平板克隆形成實驗 TRIM28-siRNA轉(zhuǎn)染細胞24h后，胰酶消化細胞，以200個/孔接種于6孔板，加DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）2ml/孔繼續(xù)培養(yǎng)10d，常規(guī)固定染色，顯微鏡下計數(shù)集落，以≥50個細胞作為一個集落，并計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。

1.6 MTT法 胰酶消化對數(shù)生長期細胞，以1×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染TRIM28-siRNA，終體積為100μl/孔，每組設(shè)4個復孔；6h后每孔加入含20%小牛血清、無抗生素的DMEM細胞培養(yǎng)液，100μl/孔，孵育48h后，棄去培養(yǎng)液，加入MTT溶液（20μl/孔）培養(yǎng)4h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后加入DMSO液（150μl/孔），采用酶標儀于550nm處檢測吸光度值。

1.7 統(tǒng)計分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理，兩組間計量資料的比較行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA干擾后SK-MES-1細胞TRIM28 mRNA和蛋白的表達 與對照siRNA［mRNA（0.91±0.09）、蛋白（0.90± 0.06）］比較，TRIM28-siRNA能明顯抑制肺鱗癌SKMES-1細胞TRIM28 mRNA（0.19±0.08）和蛋白（0.28± 0.09）的表達水平（P＜0.05）。見圖1-2。

圖1 肺鱗癌SK-MES-1細胞TRIM28 mRNA的表達（1.對照siRNA，2.TRIM28 siRNA）

2.2 siRNA干擾后SK-MES-1細胞克隆形成數(shù) TRIM28-siRNA組細胞克隆形成數(shù)顯著低于對照組克隆形成數(shù)，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，附表、圖3）。說明TRIM28 siRNA干擾可明顯抑制SK-MES-1細胞增殖。

圖2 肺鱗癌SK-MES-1細胞TRIM28蛋白的表達（1.對照siRNA，2.TRIM28-siRNA）

圖3 肺鱗癌SK-MES-1細胞克隆形成數(shù)（1.對照siRNA，2.TRIM28-siRNA）

2.3 siRNA干擾后SK-MES-1細胞的活性 轉(zhuǎn)染48h，實驗組SK-MES-1細胞的活性明顯低于對照組（P＜0.05）。見附表：

附表 TRIM28 siRNA干擾對SK-MES-1細胞增殖和活性的影響（±s，n=4）

附表 TRIM28 siRNA干擾對SK-MES-1細胞增殖和活性的影響（±s，n=4）

組別 SK-MES-1細胞克隆形成數(shù) SK-MES-1細胞活性實驗組 299±12 0.88±0.22對照組 725±24 2.29±0.08 P ＜0.05 ＜0.05

3 討論

TRIM蛋白是RING型E3泛素配體亞家族成員，在人類和小鼠中有70多種，廣泛參與各種生物進程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞生長、凋亡、發(fā)育和腫瘤形成等。多種TRIM蛋白能夠參與核受體的調(diào)節(jié)過程，如TRIM19定位于細胞核PML核體中，調(diào)節(jié)多種反應(yīng)過程，如細胞應(yīng)激、DNA修復和病毒感染等［4］；TRIM24調(diào)節(jié)維甲酸受體α、甲狀腺受體等核受體，并能增強維甲酸受體α介導的轉(zhuǎn)錄［5］；TRIM13過表達能引起p53表達增強，進而促進凋亡；TRIM29通過與TIP60相互作用調(diào)節(jié)p53蛋白，過表達預(yù)示胃癌的臨床預(yù)后較差［6］。另有研究發(fā)現(xiàn)，其它的TRIM蛋白，如TRIM32、TRIM8和TRIM40，與特異性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

TRIM28（又名KAP1），由Friedman在1996年最早鑒定，是核磷脂酰肌醇-3激酶（PIKK）家族的新成員，是必需的表觀遺傳穩(wěn)定基因［7］。TRIM28在DNA損傷后迅速被PIKK其它家族成員磷酸化，磷酸化的TRIM28快速定位于核內(nèi)DNA鏈上，說明其與細胞DNA損傷后染色質(zhì)介導的轉(zhuǎn)錄抑制和DNA修復具有重要的關(guān)聯(lián)。已經(jīng)證實，TRIM28可通過α螺旋區(qū)與MDM2的中心酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合并協(xié)同作用，使p53去乙酰化和抑制P53活性［8］。研究中可通過RNA干擾抑制非小細胞肺癌內(nèi)源性TRIM28的表達，進而增強p53的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進細胞凋亡。另外，Chen等發(fā)現(xiàn)［9］，TRIM28能夠促進E2F1-HDAC1復合物的形成并抑制E2F1乙?；敭惓１磉_TRIM28時，具有抑制E2F1的轉(zhuǎn)錄及促凋亡功能。以上研究均提示，TRIM28可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

本研究設(shè)計了針對TRIM28基因的siRNA序列，并轉(zhuǎn)染到肺鱗癌細胞系SK-MES-1細胞中，證實該siRNA能夠較好地抑制TRIM28的表達。同時研究發(fā)現(xiàn)，有效抑制肺鱗癌SK-MES-1細胞的TRIM28基因后，SK-MES-1細胞的增殖和活性受到了明顯抑制。因此提示，作為通用的核抑制物，TRIM28對非小細胞肺癌細胞生長具有明顯促進作用，可能在非小細胞肺癌進展中發(fā)揮重要作用。但關(guān)于TRIM28基因促進非小細胞肺癌生長的作用機制還有待深入研究。

［1］Dalton WS， Friend SH. Cancer biomarkers--an invitation to the table［J］. Science， 2006， 312（5777）： 1165- 1168.

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［3］Hatakeyama S. TRIM proteins and cancer［J］. Nat Rev Cancer，2011， 11（11）： 792-804.

［4］El Bougrini J， Dianoux L， Chelbi-Alix MK. PML positively regulates interferon gamma signaling［J］. Biochimie， 2011， 93（3）：389-398.

［5］Tisserand J， Khetchoumian K， Thibault C， et al. Tripartite motif 24 （Trim24/Tif1α） tumor suppressor protein is a novel negative regulator of interferon （IFN）/signal transducers and activators of transcription （STAT） signaling pathway acting through retinoic acid receptor α （Rarα） inhibition［J］. J Biol Chem， 2011， 286（38）：33369-33379.

［6］Yuan Z， Villagra A， Peng L， et al. The ATDC （TRIM29） protein binds p53 and antagonizes p53-mediated functions［J］. Mol CellBiol， 2010， 30（12）： 3004-3015.

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［9］Chen L， Chen DT， Kurtyka C， et al. Tripartite motif containing 28 （Trim28） can regulate cell proliferation by bridging HDAC1/E2F interactions［J］. J Biol Chem， 2012， 287（48）： 40106-40118.

INFLUENCES OF TRIM28 ON GROWTH OF LUNG SQUAMOUS CELL CARCINOMA SK-MES-1 CELLS

MA Chunhu， XU Qian， SHEN Rong-fei， et al

(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective：To study the influences of TRIM28 gene on growth of lung squamous cell carcinoma SKMES-1 cells.Methods：TRIM28 gene was inhibited by RNA interference assay， RT-PCR and Western-blot was used to detect the inhibitory effects. After the TRIM28 gene was inhibited， the proliferation and activity of SK-MES-1 cells were detected respectively by clone formation assay and MTT cell proliferation assay.Results：Expression of TRIM28 in SK-MES-1 cells was inhibited significantly by RNA interference. The activity and growth of SK-MES-1 cells decreased obviously after the TRIM28 gene was inhibited.Conclusions：TRIM28 can promote the growth of lung squamous cell carcinoma SK-MES-1 cells.

Lung squamous cell carcinoma； TRIM28； RNA interference

R734.2

A

1004-6879（2015）01-0005-04

2014-06-03）

* 河北省自然科學基金項目（C2010001353），河北省教育廳資助項目（QN20131010）