菌株YGL-B-0轉(zhuǎn)化甘草酸過(guò)程中甘草次酸含量的測(cè)定*

周艷艷，張 琳，劉 沛，劉翠哲

（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

菌株YGL-B-0轉(zhuǎn)化甘草酸過(guò)程中甘草次酸含量的測(cè)定*

周艷艷，張 琳，劉 沛，劉翠哲△

（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

目的：高效液相色譜法測(cè)定菌株YGL-B-0轉(zhuǎn)化甘草酸過(guò)程中甘草次酸的含量。方法：采用ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1×150mm，3.5μm），預(yù)柱ZORBAX SB-CB（2.1×12.5mm，5μm），柱溫28℃，流動(dòng)相為甲醇：乙腈：0.5%甲酸水=20：40：40（V/V），流速為0.2ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。結(jié)果：甘草次酸在0.1-1.6μ g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1.0000），甘草次酸的平均回收率為99.6 %-101.9%，RSD分別為1.21%、2.13%和1.70%（n=3）。菌株YGL-B-0發(fā)酵培養(yǎng)72h甘草次酸的含量為11.70mg/ml。結(jié)論：本研究建立的方法簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可用于測(cè)定菌株YGL-B-0轉(zhuǎn)化甘草酸過(guò)程中甘草次酸的含量。

菌株YGL-B-0；含量測(cè)定；甘草次酸；最佳發(fā)酵條件

甘草次酸在體內(nèi)外的活性均強(qiáng)于甘草酸，在食品、美容和醫(yī)藥等方面具有多種藥理作用［1-2］。目前，甘草次酸生產(chǎn)工藝多為酸水解法，效率不高且污染環(huán)境，因此急需探尋一種高效環(huán)保的甘草次酸生產(chǎn)工藝。本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得酵母菌菌株YGL-B-0，該菌株可將甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸。酵母菌具有兼性厭氧特性、發(fā)酵過(guò)程中毒副產(chǎn)品少、易培養(yǎng)和傳代時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的生產(chǎn)中，比目前發(fā)現(xiàn)的可將甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸的霉菌更加經(jīng)濟(jì)安全。本研究擬建立酵母菌菌株YGL-B-0轉(zhuǎn)化甘草酸過(guò)程中甘草次酸含量測(cè)定的方法，為后期菌株YGL-B-0最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)，旨在使其有更高的轉(zhuǎn)化效率，達(dá)到高效性、環(huán)保性等特點(diǎn)，能更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品

菌株YGL-B-0（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所藥劑室分離純化）；甘草酸粗品（甘草酸濃度為60%，南通飛宇生物科技有限公司）；甘草酸對(duì)照品，甘草次酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：100551-200501、110723-200612）；甲醇，乙腈，甲酸（色譜級(jí)）；鏈霉素，虎紅鈉鹽，蔗糖（分析純）；馬鈴薯。

種子液培養(yǎng)基［3-4］：200ml蒸餾水中加入40.00g去皮切塊的馬鈴薯，煮沸30min左右，4-6層紗布過(guò)濾，濾液中加入4.00g蔗糖，加蒸餾水定容至200ml。121℃滅菌30min，溫度降至50℃左右時(shí)加入10.0mg鏈霉素以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，用以培養(yǎng)真菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子液培養(yǎng)基，另加入甘草酸粗品1.40g。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱ZORBAX SB-C18（2.1×150mm，

3.5μm），預(yù)柱ZORBAX SB-CB（2.1×12.5mm，5μm）；柱溫28℃；流動(dòng)相甲醇：乙腈：0.5%甲酸水（20：40：40）；流速0.2ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取甘草次酸對(duì)照品2.50mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.1mg/ml對(duì)照品溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備：種子液的制備：將YGL-B-0菌株從4℃冰箱取出，室溫放置0.5h左右，無(wú)菌條件下接種于裝有種子液培養(yǎng)基的50ml錐形瓶中（裝樣量為40%），置于30℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/ min，監(jiān)測(cè)菌液OD505nm。當(dāng)OD505nm為0.38-0.42時(shí)，即得種子液。

實(shí)驗(yàn)組：取種子液200 μ l，接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的50ml錐形瓶中（裝樣量為40%），于30℃恒溫振蕩器中發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min。72h后取樣200μl，加入1200 μl甲醇，超聲破壁5min后［5-6］，15000r/min離心15min，取上清液700 μl，50℃水浴下用N2吹干，加入700μl的純凈水，渦旋2min后加入700μl的乙酸乙酯，渦旋2min后靜置2h，再次渦旋2min、靜置12h，取離心管中上層的乙酸乙酯相350μl，50℃水浴下用N2吹干，加入700μl甲醇超聲復(fù)溶1min，15000r/min離心15min，取上清液即為供試品溶液。

空白對(duì)照組：吸取200μl種子液培養(yǎng)基（無(wú)YGL-B-0菌株），接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的50ml錐形瓶中（裝樣量為40%），處理方法同實(shí)驗(yàn)組，即得空白對(duì)照組樣品。

陰性對(duì)照組：取種子液200μl，接種于裝有種子液培養(yǎng)基的50ml錐形瓶中（裝樣量為40%，無(wú)甘草酸粗品），處理方法同實(shí)驗(yàn)組，即得陰性對(duì)照組樣品。

2.3 線性關(guān)系考察 取適量2.2.1制備的對(duì)照品溶液，按2.1的色譜條件進(jìn)樣，依次進(jìn)樣1、2、4、8、16μl。以甘草次酸色譜峰面積對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=2.0E+7X+24763，r=1.0000。結(jié)果表明，甘草次酸在0.1-1.6μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn) 取2.2.1制備的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量5μl，測(cè)得甘草次酸的峰面積RSD為2.12%，結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取5份實(shí)驗(yàn)組供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣后，計(jì)算含量，測(cè)定甘草次酸的RSD為2.86%，表明重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)組供試品溶液，分別于0、4、8、16、32、72h按2.1的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)甘草次酸峰面積的RSD為2.46%，表明供試品溶液在4℃冷藏條件下，72h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 專屬性考察 取陰性對(duì)照組供試品溶液，按2.1的色譜條件進(jìn)樣5μl，未出現(xiàn)甘草次酸峰，說(shuō)明該方法專屬性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一實(shí)驗(yàn)組供試品溶液，加入一定量甘草次酸對(duì)照品溶液，測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)附表：

附表 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.9 樣品測(cè)定 分別取實(shí)驗(yàn)組供試品溶液、空白對(duì)照組供試品溶液各5份，5 μl進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得甘草次酸的平均含量為11.70mg/ml，RSD為2.32%。

3 討論

經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描，確定甘草次酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；本研究選擇的流動(dòng)相為甲醇：乙腈：0.5%甲酸水=20：40：40（V/V），在此條件下甘草次酸峰型對(duì)稱，應(yīng)用的甲酸能夠改善拖尾現(xiàn)象且減少對(duì)色譜柱的損害。甘草酸粗品滅菌后含量降低9.2%，因降低量在可允許的范圍內(nèi)，因此，甘草酸粗品可以直接加入培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。

本研究建立的高效液相色譜測(cè)定方法測(cè)得菌株YGL-B-0發(fā)酵培養(yǎng)72h后甘草次酸的含量為11.70mg/ ml，該方法簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性好，專屬性較強(qiáng)，切實(shí)可行，可用于后期確定菌株YGL-B-0轉(zhuǎn)化甘草酸為甘草次酸的最佳發(fā)酵條件，旨在使其有更高的轉(zhuǎn)化效率，達(dá)到高效性、環(huán)保性等特點(diǎn)，并使其適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］宋麗，徐璐揚(yáng)，張寧.大鼠腸內(nèi)微生物對(duì)甘草酸代謝的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2006，42（9）：70-72.

［2］李娜，韓超.淺談微生物發(fā)酵制藥［J］.中國(guó)科技博覽，2012，（24）：426.

［3］楊勇，張鳳英，陳岑.PDA培養(yǎng)基改良配方的研究［J］.釀酒科技，2012，（4）：29-31.

［4］馮世江.定向合成GAMG的菌株篩選及其催化特性研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2006.

［5］謝輝.18-β甘草次酸的研究進(jìn)展［J］.中成藥，2002，24（9）：712-713.

［6］張怡紅.離體培養(yǎng)的腸道菌群對(duì)黃山藥總皂苷的代謝研究［D］.廣州：廣東藥學(xué)院，2008.

DETERMINATION OF GLCYRRHETINIC ACID CONTENT IN THE PROCESS OF YEAST STRAIN YGL-B-0 TRANSFORMING GLYCYRRHIZIC ACID

ZHOU Yan-yan， ZHANG Lin， LIU Pei， et al

(Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective： To determine the glcyrrhetinic acid content in the process of yeast strain YGL-B-0 transforming glycyrrhizic acid by HPLC.Methods： ZORBAX SB-C18column （2.1×150mm， 3.5μm） and ZORBAX SB-CB pre-column （2.1×12.5mm， 5μm） were used in this study： column temperature was 28℃， mobile phase was methanol： acetonitrile：0.5% formic acid=20：40：40（V/V）， fl ow rate was 0.2ml/min， detection wavelength was 250nm.Results：The linearity range of glycyrrhetinic acid was 0.1-1.6μg （r=1.0000）.The average recovery rate of glycyrrhetinic acid was 99.6 %-101.9%； RSD was respectively 1.21%， 2.13% and 1.70%（n=3）. The average content of glycyrrhetinic acid was 11.70mg/ml after the yeast strain YGL-B-0 culture fermentation for 72h.Conclusions：The method in this study was simple and feasible， with good reproducibility and strong specifi city. It can be used for determination of glycyrrhetinic acid in the process of yeast strain YGL-B-0 transforming glycyrrhizic acid.

Yeast strain YGL-B-0； Content determination； Glycyrrhetinic acid； Best fermentation conditions

R927.2

A

1004-6879（2015）01-0003-03

2014-07-26）

* 河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2014406036），河北省高校重點(diǎn)學(xué)科“中藥學(xué)”資助△ 通訊作者