苦參堿聯(lián)合Akt信號通路抑制劑影響腎癌細(xì)胞的活力與凋亡

郭曉玲，康麗霞，任美芳

(河北省中醫(yī)院腎病科，石家莊 050011)

腎癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，約占腎臟原發(fā)惡性腫瘤的90%[1]?？鄥A具有抗病毒、消炎、保肝、鎮(zhèn)痛等藥理學(xué)作用，是提取至苦參、苦豆子、山豆根中的生物堿，屬于喹諾里西啶類[2]。最近研究表明，苦參堿具有抗腫瘤的作用，對膽管癌、肺癌等癌細(xì)胞生長均具有抑制作用[3-4]。蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號通路在人類多種組織和器官中廣泛表達(dá)[5]。Akt信號通路在癌癥組織中過度激活，其Akt磷酸化水平異常升高，而用30 μmol/L Akt信號通路抑制劑LY294002阻斷Akt信號通路能夠抑制癌細(xì)胞中Akt的磷酸化，影響癌細(xì)胞的生長，其具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，暫時沒有在臨床上使用[6]。本研究以腎癌細(xì)胞為研究對象，分別用苦參堿或/和Akt信號通路抑制劑處理后，運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法檢測其對腎癌細(xì)胞增殖活力及凋亡的影響，以期為治療腎癌提供新思路

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

腎癌細(xì)胞ACHN和GRC-1購自于中科院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均為美國Gibco公司產(chǎn)品；苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品為西安天園生物制劑廠產(chǎn)品(規(guī)格：100 mg，純度≥98%，批號：160705)；p38單克隆抗體、p-p38單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶cleaved caspase-3單克隆抗體、Akt單克隆抗體、p-Akt單克隆抗體均為美國Cell Signaling公司產(chǎn)品；ROS水平檢測試劑盒為上海研拓生物科技有限公司產(chǎn)品;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苦參堿對細(xì)胞增殖活力影響

腎癌細(xì)胞ACHN和GRC-1培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將細(xì)胞培養(yǎng)液分別更換為含有苦參堿濃度為0、0.6、1.2、2.4 mg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，MTT方法測定細(xì)胞存活率。

1.3.2 細(xì)胞分組

腎癌細(xì)胞ACHN和GRC-1分別分為對照組(Control group)、苦參堿組(Matrine group)、抑制劑組(Inhibitor group)、聯(lián)合組(Combination group)4組，對照組正常培養(yǎng)，苦參堿組和抑制劑組細(xì)胞分別用半數(shù)抑制濃度的苦參堿和Akt信號通路抑制劑LY294002濃度為30 μmol/L 的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，聯(lián)合組細(xì)胞用同時含有1.3 mg/mL的苦參堿和30 μmol/L Akt信號通路抑制劑LY294002的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。ACHN細(xì)胞半數(shù)抑制濃度為1.3 mg/mL，GRC-1細(xì)胞半數(shù)抑制濃度為2.6 mg/mL。對照組、苦參堿組、抑制劑組、聯(lián)合組按照MTT方法測定細(xì)胞增殖活性。

1.3.3 苦參堿聯(lián)合Akt信號通路抑制劑對細(xì)胞凋亡影響

對照組、苦參堿組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后。用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞后，棄培養(yǎng)液上清，用PBS懸浮細(xì)胞，細(xì)胞濃度為106/mL，取1 mL細(xì)胞懸浮液，以Annexin V-FITC/PI 法檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.4 苦參堿聯(lián)合Akt信號通路抑制劑對細(xì)胞中ROS影響

對照組、苦參堿組、抑制劑組、聯(lián)合組以每孔104個細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，根據(jù)ROS水平檢測試劑盒用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示ROS水平，吸收波長為590 nm，激發(fā)波長為488 nm。

1.3.5 Western blot檢測p38、p-p38、cleaved caspase-3水平

對照組、苦參堿組、抑制劑組、聯(lián)合組培養(yǎng)48 h后，加入裂解液，放在冰上裂解30 min，常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳。4℃，90 V電壓將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上。經(jīng)5%牛血清白蛋白封閉以后，與一抗(p38、p-p38、cleaved caspase-3為1∶500倍稀釋，GAPDH為1∶1000倍稀釋，4℃，過夜)、二抗(1000倍稀釋，室溫，1 h)反應(yīng)后，滴加顯色液，用Bio-Rad成像分析軟件掃描后，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 苦參堿和Akt信號通路抑制劑LY294002對細(xì)胞增殖活力影響檢測結(jié)果

參堿能夠抑制腎癌細(xì)胞增殖活力，抑制作用隨著作用濃度的增加而增加。計算苦參堿半數(shù)抑制濃度，ACHN：(1.31±0.25)mg/mL，GRC-1：(2.63±0.15)mg/mL。后續(xù)選用1.3 mg/mL和2.6 mg/mL的苦參堿作用于腎癌細(xì)胞ACHN和GRC-1。見圖1。

注：A：ACHN細(xì)胞；B：GRC-1細(xì)胞。與0 mg/mL苦參堿作用后相比，a P<0.05；與0.6 mg/mL苦參堿作用后相比，b P<0.05；與1.2 mg/mL苦參堿作用后相比，cP<0.05。圖1 苦參堿對細(xì)胞增殖活力影響Note. A， ACHN cells. B， GRC-1 cells. Compared with 0 mg/mL matrine group, a P < 0.05. Compared with the 0.6 mg/mL matrine group, bP < 0.05. Compared with the 1.2 mg/mL matrine group, c P < 0.05.Figure 1 Effects of matrine on cell proliferation

2.2 Akt信號通路抑制劑作用后細(xì)胞中Akt、p-Akt表達(dá)水平及其聯(lián)合Akt信號通路抑制劑對細(xì)胞活力影響檢測結(jié)果

苦參堿組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞存活率低于對照組。聯(lián)合組細(xì)胞存活率明顯低于苦參堿組、抑制劑組?？鄥A和Akt信號通路均能夠抑制腎癌細(xì)胞增殖活力，且二者聯(lián)用抑制作用更強(qiáng)。 見圖2、圖3。

2.3 苦參堿聯(lián)合Akt信號通路抑制劑對細(xì)胞凋亡影響結(jié)果

苦參堿組、抑制劑組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于對照組。聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯高于苦參堿組、抑制劑組。 苦參堿和Akt信號通路均能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，且二者聯(lián)用效果更好。見圖4。

2.4 苦參堿聯(lián)合Akt信號通路抑制劑對ROS影響結(jié)果

苦參堿組、抑制劑組、聯(lián)合組ROS水平高于對照組。聯(lián)合組ROS水平明顯高于苦參堿組、抑制劑組。見圖5。

注：A：Western blot檢測ACHN細(xì)胞中Akt、p-Akt表達(dá)；B：以GAPDH為內(nèi)參，ACHN細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平；C：Western blot檢測GRC-1細(xì)胞中Akt、p-Akt表達(dá)；D：以GAPDH為內(nèi)參，GRC-1細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平。與對照組相比，a P<0.05。圖2 Akt信號通路抑制劑作用后細(xì)胞中Akt、p-Akt表達(dá)水平Note. A, Western blot was used to detect the expression of Akt and p-Akt in ACHN cells. B, Protein expression level in ACHN cells using GAPDH as an internal reference. C, Western blot was used to detect the expression of Akt and p-Akt in GRC-1 cells. D, Protein expression level in GRC-1 cells with GAPDH as internal reference. Compared with the control group, a P<0.05.Figure 2 Akt, p-Akt expression levels in the cells after Akt signaling pathway inhibitory treatment

注：A：ACHN細(xì)胞；B：GRC-1細(xì)胞。與對照組相比，aP<0.05；與苦參堿組、抑制劑組相比，bP<0.05。圖3 苦參堿聯(lián)合Akt信號通路抑制劑對細(xì)胞增殖活力影響Note. A， ACHN cells. B， GRC-1 cells. Compared with the control group, aP < 0.05. Compared with the matrine group, the inhibitor group, bP < 0.05.Figure 3 Effect of matrine combined with Akt signaling pathway inhibitor on cell proliferation

注：A：流式細(xì)胞儀檢測ACHN細(xì)胞凋亡；B：ACHN細(xì)胞凋亡率；C:流式細(xì)胞儀檢測GRC-1細(xì)胞凋亡；D：GRC-1細(xì)胞凋亡率。與對照組相比，a P<0.05；與苦參堿組、抑制劑組相比，bP<0.05。圖4 苦參堿聯(lián)合Akt信號通路抑制劑對細(xì)胞凋亡影響Note.A, Flow cytometry detection of apoptosis in the ACHN cells. B, ACHN cell apoptosis rate. C, Flow cytometry detection of apoptosis in GRC-1 cells. D, GRC-1 cell apoptosis rate. Compared with the control group, aP<0.05. Compared with the matrine and inhibitor group, bP<0.05.Figure 4 Effect of matrine combined with Akt signaling pathway inhibitor on the cell apoptosis

注：A：ACHN細(xì)胞；B：GRC-1細(xì)胞；與對照組相比，aP<0.05；與苦參堿組、抑制劑組相比，bP<0.05。圖5 細(xì)胞中ROS水平檢測結(jié)果Note. A， ACHN cells. B， GRC-1 cells. Compared with the control group, aP < 0.05. Compared with the matrine and inhibitor groups, bP < 0.05.Figure 5 ROS levels of the cells

2.5 p38、p-p38、cleaved caspase-3表達(dá)檢測結(jié)果

苦參堿組、抑制劑組、聯(lián)合組p-p38、cleaved caspase-3水平高于對照組。聯(lián)合組p-p38、cleaved caspase-3水平明顯高于苦參堿組、抑制劑組。見圖6。

注：A：Western blot檢測ACHN細(xì)胞中p38、p-p38、cleaved caspase-3表達(dá)水平；B：以GAPDH為內(nèi)參，ACHN細(xì)胞中p38、p-p38、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平；C：Western blot檢測GRC-1細(xì)胞中p38、p-p38、cleaved caspase-3表達(dá)水平；D：以GAPDH為內(nèi)參，GRC-1細(xì)胞中p38、p-p38、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平；與對照組相比，aP<0.05；與苦參堿組、抑制劑組相比，bP<0.05。圖6 Western blot檢測p38、p-p38、cleaved caspase-3表達(dá)Note. A, Western blot analysis. p38, p-p38, and cleaved caspase-3 expression in ACHN cells. B， GAPDH as internal reference, expression of p38, p-p38, and cleaved caspase-3 in ACHN cells. C, Western blot. The expression levels of p38, p-p38 and cleaved caspase-3 in GRC-1 cells. D, The expression levels of p38, p-p38 and cleaved caspase-3 in GRC-1 cells with GAPDH as the internal reference. Compared with the control group, aP < 0.05. Compared with the matrine and inhibitor groups, bP < 0.05.Figure 6 Western blot analysis of p38, p-p38, and cleaved caspase-3 expression in the cells

3 討論

苦參堿具有廣泛的抗腫瘤作用[7]。付婷婷等[8]用0.5～2.0 g/L的苦參堿作用于宮頸癌HeLa細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參堿能呈濃度依賴的抑制宮頸癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。楊昨非等[9]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能夠通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因抑制人胰腺癌細(xì)胞PC-3的增殖，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，0、0.6、1.2、2.4 mg/mL的苦參堿作用后，腎癌細(xì)胞的增殖活力降低。本研究結(jié)果與之前的研究報道相符，均說明苦參堿能夠抑制癌細(xì)胞的增殖活力。

Akt信號通路激活后發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，阻斷其激活能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在癌癥組織中，Akt磷酸化水平升高，Akt信號通路異常激活[10]。LY294002作為Akt信號通路抑制劑由于具有一定的毒性暫時沒有在臨床使用，其是治療腫瘤的潛在分子，LY294002目前已經(jīng)在細(xì)胞生物學(xué)研究中廣泛使用[11]。本研究結(jié)果顯示，Akt信號通路抑制劑作用后的腎癌細(xì)胞增殖活力降低，凋亡增加，苦參堿和Akt信號通路抑制劑聯(lián)合使用后腎癌細(xì)胞凋亡增加更多，細(xì)胞增殖活力下降更多，利用Akt信號通路抑制劑聯(lián)合苦參堿可能是治療腎癌的有效途徑，LY294002可能是腎癌治療的福音。

癌細(xì)胞的凋亡不僅受到多種基因的嚴(yán)格調(diào)控，也是一系列復(fù)雜反應(yīng)的最終結(jié)果[12]。caspase蛋白家族是目前研究較多的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白家族，當(dāng)細(xì)胞凋亡信號發(fā)出時，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)caspase-3活化形成cleaved caspase-3，使細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段[13]。有研究表明，苦參堿能夠提高癌細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤的作用[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用苦參堿或者是Akt信號通路抑制劑處理后腎癌細(xì)胞中ROS水平升高，聯(lián)合使用后細(xì)胞中ROS水平升高更多，這說明，苦參堿和Akt信號通路抑制劑能夠通過促進(jìn)細(xì)胞中ROS水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生除了與凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)外，還與細(xì)胞內(nèi)多種信號通路有關(guān)。p38信號通路激活后能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。有研究表明，在胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)p-p38表達(dá)水平下降，而激活p38信號通路后，癌細(xì)胞的凋亡增加，細(xì)胞生長受到抑制[16-17]。本研究結(jié)果顯示，苦參堿和Akt信號通路抑制劑單獨(dú)處理后腎癌細(xì)胞中p-p38水平升高，二者聯(lián)用后細(xì)胞中p-p38水平升高更多。

綜上所述，苦參堿和Akt信號通路抑制劑均能夠抑制腎癌細(xì)胞生長，促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)用抗腫瘤作用更好。本研究結(jié)果為提高腎癌的治愈率提供了新思路，為研究苦參堿的抗腫瘤機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。