高效液相色譜法測定飼料中己烯雌酚含量的方法學(xué)考察

王東偉，陳建華，周 磊

（1.公安部警犬技術(shù)學(xué)校，遼寧沈陽 110034；2.遼寧省沈陽市獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽 110031；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

高效液相色譜法測定飼料中己烯雌酚含量的方法學(xué)考察

王東偉1，陳建華2，周 磊3

（1.公安部警犬技術(shù)學(xué)校，遼寧沈陽 110034；2.遼寧省沈陽市獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽 110031；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

己烯雌酚是一種人工合成的雌性激素，被禁止添加在畜禽飼料中，人們長期食用這種含有雌激素的畜禽、魚蝦等，可以在人體內(nèi)引起蓄積，引發(fā)一系列的健康問題。應(yīng)用BP028—2002高效液相色譜法可以快速檢測到飼料中己烯雌酚的微量含量。此方法經(jīng)過大量的試驗操作，方法摸索，方案優(yōu)化，具有靈敏度高、檢測時間短、回收率高等優(yōu)點。

高效液相；色譜柱；色譜峰；己烯雌酚；回收率

己烯雌酚（diethylstilbestol，DES）別名乙底酚，是人工合成的非甾體雌激素物質(zhì)，能產(chǎn)生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用。小劑量己烯雌酚可刺激垂體前葉促性腺激素，大劑量則抑制垂體前葉促性腺激素和促乳素的分泌，有抵消雄激素并抑制催產(chǎn)素酶而增強催產(chǎn)素的作用。己烯雌酚添加到飼料中主要發(fā)揮提高產(chǎn)崽率或催情作用，人食用含有己烯雌酚的動物制品后造成體內(nèi)激素失調(diào)，從而給健康帶來危害。2002年我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定己烯雌酚禁止在飼料中添加使用，2003年農(nóng)業(yè)部規(guī)定己烯雌酚在可食性動物組織中不得檢出。筆者等采用外標(biāo)法建立了飼料中己烯雌酚的高效液相色譜法檢測方法，適用于配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料中己烯雌酚的測定。

1 材料

1.1 儀器、試劑與藥品

高效液相相色譜儀，日本日立公司。己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品，含量99.9%，批號SZBA110X，SIGMA-ALORICH公司產(chǎn)品；甲醇為色譜純。提取液：80%甲醇溶液，水為屈臣氏純凈水?？箟难?，乙酸乙酯，三氯甲烷，1 mol/L氫氧化鈉溶液。

1.2 色譜條件

色譜柱為C18（6.2 mm×150 mm，5 μm）；流動相為0.043mol/L磷酸二氫鈉:甲醇=30:70（用磷酸調(diào)節(jié)pH=5），流動相過0.45 μm有機濾膜。流速1.0 mL/min；進樣體積20 μL；柱溫25℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

準(zhǔn)確稱取0.025 g己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分搖勻，配制成1 mg/mL儲備液，密封，-20℃保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)中間工作液的配制

用移液器取一定量的儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即為50 μg/mL己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)工作液，密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品前處理

取飼料10 g（準(zhǔn)確至0.001 g）和抗壞血酸2 g，置于50 mL離心管中，加乙酸乙酯適量，充分振蕩約1 min，再置于超聲儀中超聲提取2 min，期間用手回?fù)u2次，取出后以4000～5000 r/min離心，傾出上清液，再分別加適量乙酸乙酯提取2次，合并上清液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，68～72℃減壓蒸發(fā)至干。

將蒸發(fā)的乙酸乙酯提取物用三氯甲烷溶解，分3次定量轉(zhuǎn)移至150 mL的分液漏斗中，加少許抗壞血酸（0.3～0.5 g），用氫氧化鈉10 mL將DES萃取至水相?；匦鹗?0 s，并用三氯甲烷洗滌2～3次，每次20 mL，回旋振蕩10 s，然后用碳酸氫鈉溶液12～15 mL將pH值調(diào)至10.3～10.6，再用30、30、20 mL三氯甲烷萃取3次，將DBS回提至三氯甲烷中，并令三氯甲烷層通過無水碳酸鈉干燥。將干燥過的三氯甲烷溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，在55～57℃、減壓蒸發(fā)至干，以適量甲醇溶解后，上樣測定。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液（50 μg/mL），用流動相稀釋成0.3、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進樣20 μL，得到峰面積。以濃度和峰面積分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量。

2.2 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成濃度分別為0.00、0.3、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL的對照品溶液，按照“1.2”色譜條件進行高效液相色譜分析。檢測結(jié)果表明，己烯雌酚在0.3～16.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=31355x-186.89，相關(guān)系數(shù)R2=1.00，見圖1。

圖1 己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 回收率測定

根據(jù)BP028—2002、農(nóng)業(yè)部193號公告，制定飼料濃度點為20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg（每個濃度設(shè)5個重復(fù)），依次添加的目標(biāo)化合物分別為（稱樣量為10 g）200、400、800 μg，取適當(dāng)濃度的儲備液或工作溶液進行添加。測定結(jié)果見表1，回收率和變異系數(shù)表明本方法適用于飼料中己烯雌酚的測定。

表1 飼料中己烯雌酚回收率測定結(jié)果

2.4 空白試驗結(jié)果

按照“1.2”色譜條件分別進樣，進行高效液相色譜分析，所得空白樣品色譜圖、空白試驗色譜圖（不加樣品）、空白樣品加樣圖分別見圖2～4。

圖2 空白樣品HPLC色譜圖

圖3 空白實驗HPLC色譜圖

圖4 空白樣品加標(biāo)HPLC色譜圖

2.5 精密度試驗

選擇20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg濃度樣品，按照“1.2”色譜條件進行高效液相色譜分析，每個濃度設(shè)6組重復(fù)，測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，飼料中己烯雌酚在20～80 mg/kg濃度范圍內(nèi)，變異系數(shù)和精密度較好（RSD≤15%）。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.6 定量限、檢測限

按照本標(biāo)準(zhǔn)，檢測限0.25 mg/kg。標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低點0.3 μg/mL，甲醇溶液100 mL，稀釋倍數(shù)100倍，所以測定最低濃度點為0.3 μg/mL×100 mL/10 g=3 μg/g。

3 結(jié)論

該方案根據(jù)是BP028—2002、農(nóng)業(yè)部168號公告而設(shè)計的。檢測結(jié)果表明，該方法的前處理方法操作簡單、快速、準(zhǔn)確，回收率、重復(fù)性、檢測限均能滿足飼料中己烯雌酚殘留檢測的要求。

［1］ 吳紅軍，成強，臧素娟，等.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中己烯雌酚的殘留量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（14）：4447-4448.

［2］ 韓迪，張艷，周建于，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肉中5種雌激素殘留［J］.昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，35（7）：32-36.

［3］ 郭捷，花錦，王蓉珍，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定獸藥中3種違禁雌激素［J］.食品工程，2014（4）：48-52.

S816

A

2095-3887（2015）06-0074-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.024

2015-10-09

王東偉（1979-），男，助理研究員，碩士。

周磊（1979-），男，助理研究員，碩士，從事畜牧生產(chǎn)系統(tǒng)管理工作。