福建白兔非特異性抗病特性研究

陳冬金，陳巖鋒，孫世坤，桑 雷，謝喜平，張丹青

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013）

福建白兔非特異性抗病特性研究

陳冬金，陳巖鋒，孫世坤，桑 雷，謝喜平，張丹青

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013）

取90日齡福建白兔24只（雌雄各半），測定其血清中的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量和補(bǔ)體C3、C4含量，以及外周血中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化力和中性粒細(xì)胞吞噬力。結(jié)果表明：福建白兔的免疫球蛋白IgG、IgM含量分別為2 208.75 mg/L和289.71 mg/L，補(bǔ)體C3、C4含量分別為87.46 mg/L和36.54 mg/L，淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)1.50，中性粒細(xì)胞吞噬率58.39%，中性粒細(xì)胞吞噬指數(shù)2.22，白細(xì)胞數(shù)4.23×109/L，紅細(xì)胞5.05×109/L，且雌雄兔差異不顯著（P＞0.05）。測定結(jié)果可為福建白兔非特異性抗病力的選擇以及非特異性抗病育種提供依據(jù)。

福建白兔；免疫球蛋白；補(bǔ)體；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；中性粒細(xì)胞吞噬率

據(jù)1985年出版的《福建省家畜家禽品種志和圖譜》調(diào)查顯示，福建地方家兔有黃色毛、黑色毛、白色毛3個(gè)種群［1］。福建黃兔和閩西南黑兔分別于2006年和2010年被列入國家畜禽遺傳資源目錄［2-3］。福建白兔屬小型肉用地方兔資源，全身被毛白色，頭部清秀，兩耳直立，眼虹膜紅色，身體結(jié)構(gòu)緊湊，于2014年通過了國家畜禽遺傳資源專家委員會(huì)認(rèn)定。福建白兔主要分布在福建省武平縣，是福建省地方優(yōu)良品種之一，該品種具有繁殖性能良好、耐粗飼、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)好、市場暢銷等特點(diǎn)。目前對福建白兔的研究主要是對其血液生理生化［4］、種質(zhì)特性和生產(chǎn)性能［5］、肌肉營養(yǎng)成分［6］的研究等，對其抗病特性的研究報(bào)道鮮見。

據(jù)養(yǎng)殖戶普遍反映，福建白兔具有抵抗力強(qiáng)、發(fā)病少的特點(diǎn)，有望成為抗病育種優(yōu)良的素材。抗病育種是當(dāng)前畜禽育種的研究熱點(diǎn)，對抗病力進(jìn)行度量和抗病力遺傳機(jī)制的研究是其中的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。據(jù)Axford等［7］和Bishop等［8］報(bào)道，家畜對普通和特殊傳染病的抗性都具有品種間的差異。但目前對動(dòng)物抗病力的測定較為困難，因此育種學(xué)家常常忽視對這類性狀的選擇。個(gè)體免疫力是衡量動(dòng)物抗病能力的重要指標(biāo)，由于免疫功能易于度量測定，因此免疫指標(biāo)可作為抗病力的間接指標(biāo)［9］。對家畜的免疫應(yīng)答選育研究已經(jīng)廣泛開展，尤其在豬和禽中研究較多［10-12］。筆者等通過測定福建白兔的體液免疫指標(biāo)和細(xì)胞免疫指標(biāo)，為福建白兔的抗病特性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 福建白兔，在武平縣武東鄉(xiāng)袁田村兔場隨機(jī)選擇90日齡育成兔24只（雌雄各半），自由采食、飲水，環(huán)境溫度18～25℃。

1.1.2 主要儀器 BECKMAN AU2700全自動(dòng)生化分析儀，Sysmex XT-1800i全自動(dòng)血液分析儀，三洋CO2培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，LEICA DM750生物顯微鏡，湖南湘儀TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，真空采血管（EDTA-K2抗凝管），普通采血管，96孔培養(yǎng)板，離心管，移液器，等等。

1.1.3 主要試劑 肝素，小牛血清、Hank’s液，兔淋巴細(xì)胞分離液，臺(tái)盼藍(lán)，PHA，CCK-8（Cell CountingKit 8，碧云天公司），等等。

1.2 方法

1.2.1 福建白兔血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM和補(bǔ)體C3、C4含量測定［13］空腹前腔靜脈采血2 mL于干凈的真空采血管中，靜置30 min，3 500 r/min離心15 min，吸取上清液于干凈的PE管中，然后封口置于-20℃低溫冰箱中保存，待測。通過BECKMAN COULTER AU2700大型全自動(dòng)生化分析儀、寧波康美生化試劑盒及采樣免疫透射比濁法對福建白兔血液免疫球蛋白IgM、IgG和補(bǔ)體C3、C4含量進(jìn)行測定。

1.2.2 福建白兔外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)［13］無菌取靜脈血2 mL，置于含有肝素的無菌試管中搖勻，加入2 mL Hanks溶液進(jìn)行對倍稀釋，混勻。用吸管吸取稀釋血液，沿試管壁緩緩加到含有2 mL淋巴細(xì)胞分離液的試管中（血液:Hanks液:淋巴細(xì)胞分離液的比例為1:1:1），沿管壁流下的稀釋血液疊加在分離液之上，并與分離液形成明顯的界面。試管以2 000 r/min水平式離心20 min后小心取出，管內(nèi)可分為4層：上層為血漿、血液稀釋液和絕大部分血小板，下層為紅細(xì)胞及粒細(xì)胞，中層為細(xì)胞分層液，分層液與血漿交界部位渾濁的灰白色層即為單核細(xì)胞層。用平口吸管小心吸取中層呈白色霧狀的淋巴細(xì)胞層，用Hanks溶液洗滌2次，每次以1 500 r/min離心10 min，棄上清，加RPMI-1640培養(yǎng)液1 mL混勻，取少許進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定。

CCK-8（Cell CountingKit-8）法：原理同MTT法。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板分別加入分離好的淋巴細(xì)胞懸液100 μL/孔（終濃度為3.5×106個(gè)/mL），試驗(yàn)孔加入PHA 16 μL/孔，對照孔加入1640培養(yǎng)液，每一血樣設(shè)3個(gè)重復(fù)，加蓋，于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h。每孔加入CCK-8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，于酶聯(lián)免疫測定儀上測定OD450值，以SI（刺激指數(shù)）值反映淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，SI計(jì)算公式如下。

SI=試驗(yàn)孔OD值均值/對照孔OD均值

1.2.3 福建白兔外周血中性粒細(xì)胞吞噬力測定［14］取肝素抗凝血2滴（約0.2 mL）于裝有葡萄球菌培養(yǎng)物（0.1 mL，12億/mL）的小管中，混勻，37℃作用10 min，取少量置于載玻片上，推成薄血片（每只兔3片），干燥。瑞氏染色，油鏡觀察。參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)中性粒細(xì)胞，分別記錄吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)和每個(gè)中性粒細(xì)胞吞入的細(xì)菌數(shù)，按下式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.2.4 福建白兔血液白細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 空腹耳緣靜脈采血1～2 mL至EDTA-K2抗凝的真空管（采血前試驗(yàn)動(dòng)物禁食12 h，同時(shí)讓其自由飲水，在清醒狀態(tài)下進(jìn)行耳靜脈采血），輕彈管底，使血液充分抗凝，并避免溶血。采用SysmexXT-1800i全自動(dòng)血液分析儀，用標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)方法對樣品中白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 將測定數(shù)據(jù)用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，并進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較福建白兔雌雄之間免疫指標(biāo)的差異。

農(nóng)民按照城鎮(zhèn)化規(guī)律集中居住是落實(shí)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的有效抓手，也是符合農(nóng)民意愿的實(shí)踐探索。因集中居住產(chǎn)生的新型農(nóng)村社區(qū)，既有傳統(tǒng)鄉(xiāng)土社會(huì)的傳承，也有現(xiàn)代城市社會(huì)的特點(diǎn)。加強(qiáng)新型農(nóng)村社區(qū)黨建工作，是適應(yīng)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、農(nóng)民集中居住、農(nóng)村發(fā)展變化的必然要求，也是完善農(nóng)村治理體系，鞏固黨在基層執(zhí)政根基的內(nèi)在要求，需要運(yùn)用好“融”理念，使基層黨組織始終在鄉(xiāng)村治理體系中處于核心地位，發(fā)揮引領(lǐng)作用。

2 結(jié)果

2.1 福建白兔血清中免疫球蛋白和補(bǔ)體含量測定

福建白兔免疫球蛋白IgG、IgM（由于IgA含量較低，未能檢測出）和補(bǔ)體C3、C4含量測定結(jié)果見表1，結(jié)果顯示，雌雄兔上述指標(biāo)差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 福建白兔血清中免疫球蛋白和補(bǔ)體含量mg/L

2.2 福建白兔外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和中性粒細(xì)胞吞噬力測定

從表2可知，雌雄兔淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)、中性粒細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)以及白細(xì)胞數(shù)等均無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 福建白兔外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和中性粒細(xì)胞吞噬力

2.3 福建白兔血液白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

從表3可以看出，雌雄兔紅細(xì)胞、白細(xì)胞以及白細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等均無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 福建白兔血液白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 測定年齡

一般認(rèn)為，動(dòng)物在一定的年齡階段各項(xiàng)免疫指標(biāo)的正常值基本恒定，在年齡、性別、飼養(yǎng)條件等基本相同的情況下，其在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，但幅度不大。卿柳庭等［15］報(bào)道了7～11周齡豬免疫指標(biāo)，其中在此階段豬的各項(xiàng)免疫指標(biāo)已經(jīng)穩(wěn)定在成年豬的正常范圍之內(nèi)，具備了較穩(wěn)定的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)福建白兔的生長特點(diǎn)，選擇90日齡的福建白兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

3.2 免疫指標(biāo)的選擇

機(jī)體免疫功能通過細(xì)胞免疫與體液免疫實(shí)現(xiàn)。體液免疫是由B淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體參與免疫應(yīng)答；細(xì)胞免疫是指由T淋巴細(xì)胞識別抗原引起的，并由效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答［16］。

本實(shí)驗(yàn)測定的體液免疫指標(biāo)包括免疫球蛋白IgG、IgM、IgA和補(bǔ)體C3、C4?？贵w是一種免疫球蛋白，其水平是反映動(dòng)物機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)［17］。根據(jù)免疫球蛋白的特性和抗原性將其分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中IgG、IgM、IgA是介導(dǎo)體液免疫的主要效應(yīng)分子。IgG由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞產(chǎn)生，存在于所有體液內(nèi)，是動(dòng)物自然感染和人工主動(dòng)免疫后機(jī)體所產(chǎn)生的主要抗體，發(fā)揮著抗病毒、抗菌、抗毒素的免疫學(xué)效應(yīng)，是人和動(dòng)物血清中含量最高的免疫球蛋白［18］。IgM由初次體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生，含量僅次于IgG，通常僅存在于血液內(nèi)，發(fā)揮抗原受體的作用［19］。IgA是外分泌液中的主要免疫球蛋白，在保護(hù)呼吸道、泌尿生殖道、腸道、乳腺和眼睛抵抗微生物入侵方面起關(guān)鍵作用，能凝集顆粒性抗原和中和病毒［20］。本實(shí)驗(yàn)中由于IgA含量太低，未檢測出來。補(bǔ)體系統(tǒng)是體內(nèi)重要的免疫效應(yīng)和免疫效應(yīng)放大系統(tǒng)，發(fā)揮機(jī)體特異性和非特異性的抗感染作用，除參與入侵病原體和循環(huán)免疫復(fù)合物的清除外，也可造成機(jī)體組織損傷，因而補(bǔ)體的含量相對穩(wěn)定，其活化和抑制通過多種補(bǔ)體分子嚴(yán)格控制［21］。

細(xì)胞免疫主要是通過測定白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、中性粒細(xì)胞吞噬率、中性粒細(xì)胞吞噬指數(shù)等。白細(xì)胞具有吞噬和破壞侵入機(jī)體病原體的功能，主要參與非特異性免疫活動(dòng)，當(dāng)白細(xì)胞總數(shù)減少時(shí)，可以引起機(jī)體對病原體抵抗力降低，因此，檢測白細(xì)胞總數(shù)可以反映機(jī)體抵抗力的變化［22］。紅細(xì)胞既有攜氧、運(yùn)輸氣體、調(diào)節(jié)體內(nèi)的酸堿平衡等功能，又具有識別抗原、消除免疫復(fù)合物的免疫調(diào)節(jié)功能［23］，紅細(xì)胞可以分化成為兩類干細(xì)胞，一類是髓系干細(xì)胞，另一類是淋巴干細(xì)胞，故其在機(jī)體免疫應(yīng)答中也起著十分重要的作用［21］。

機(jī)體的免疫狀況與血液中T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)，測定T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化可以了解機(jī)體的免疫狀況［24］。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率是評價(jià)細(xì)胞免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)。淋巴細(xì)胞的體外增殖測定方法很多，目前主要有形態(tài)觀察計(jì)數(shù)法、3H-胸腺嘧啶摻入法、MTT法和CCK-8法。本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8（Cell CountingKit-8）法原理同MTT法，重復(fù)性好，靈敏度高，對細(xì)胞的毒性低，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，取得了預(yù)期效果。

3.3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)所測福建白兔的指標(biāo)均在常規(guī)的飼養(yǎng)管理與免疫水平下，福建白兔的免疫球蛋白IgG、IgM含量分別為2 208.75 mg/L和289.71 mg/L，補(bǔ)體C3、C4含量分別為87.46 mg/L和36.54 mg/L，淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)1.50，中性粒細(xì)胞吞噬率58.39%，中性粒細(xì)胞吞噬指數(shù)2.22，白細(xì)胞數(shù)4.23×109/L，紅細(xì)胞5.05×109/L，且雌雄兔上述指標(biāo)均差異不顯著（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)初步建立了福建白兔免疫指標(biāo)的正常值，間接反映了福建白兔的抗病特性。

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Study on General Resistance Characteristics on Fujian White Rabbits

Chen Dongjin,Chen Yanfeng,Xie Xiping，et al
（Institute ofAnimal Husbandryand VeterinaryMedicine,Fujian AcademyofAgricultural Sciences,Fuzhou 350013,China）

In order to explore the resistance characteristics of Fujian white rabbit，twenty-four 90-day-old rabbits（half male，half female）were selected to determine the content of immunoglobulin IgG，IgM，IgA in serum,complement C3，C4and the peripheral blood lymphocyte transformation and thephagocytosis ability of neutrophil.The results showed that the content of immunoglobulin IgG，IgM were 2 208.75 mg/L，289.71 mg/L，complement C3，C4content were 87.46 mg/L，36.54 mg/L，lymphocyte stimulation index was 1.50 and neutrophil phagocytic rate was 58.39%，neutrophil phagocytic index was 2.22，white cell amount 4.23×109/L，red cell amount 5.50×109/L；no significant difference（P>0.05）were found between the male and the female.The results would be useful as a reference in the breeding selection.

Fujian white rabbit;immunoglobulin;complement;lymphocyte transformation rate;neutrophil phagocytic rate

S829.1

A

2095-3887（2015）06-0034-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.011

2015-07-10

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（兔）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-44E-11）；福建省公益類科研院所專項(xiàng)（2014R1101002-3）

陳冬金（1981-），女，助理研究員。

謝喜平（1966-），男，研究員。研究方向：草食動(dòng)物遺傳育種與飼養(yǎng)。