紅曲霉發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)品過程中多酶特性的初步研究

蔣 汶,湯文晶,鄭天柱,譚 勝,張慶慶(安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

紅曲霉發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)品過程中多酶特性的初步研究

蔣 汶,湯文晶,鄭天柱,譚 勝,張慶慶?
(安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

以大米粉、麩皮、豆渣等常見的農(nóng)副產(chǎn)品作為主要的營養(yǎng)基質(zhì),通過正交實驗確定了最佳培養(yǎng)基配比.紅曲霉菌株ZL307淀粉酶酶活在2 d時達到其最高值163.327 5 U/m L;蛋白酶酶活在3 d時達到其最高值92.2498 U/m L;酯化酶酶活在7 d時達到最高值16.672 5 U/m L;纖維素酶酶活在8 d時達到最高值,濾紙酶酶活可達0.132 2 U/m L,內(nèi)切酶酶活可達0.333 1 U/m L,外切酶酶活可達0.134 7 U/m L,β-葡萄糖苷酶酶活可達0.153 8 U/m L.4種酶對溫度的耐受性為纖維素酶＞淀粉酶＞蛋白酶＞酯化酶.4種酶對p H的耐受性為纖維素酶＞蛋白酶＞淀粉酶＞酯化酶.

紅曲霉;液態(tài)發(fā)酵;多酶特性;正交優(yōu)化

紅曲霉在我國具有悠久的生產(chǎn)和使用歷史[1],具有較高的藥用價值,同時也可用于釀酒、制醋[2].紅曲霉能產(chǎn)生多種酶類,主要包括淀粉酶、蛋白酶、酯化酶[3]以及纖維素酶等,產(chǎn)酶的類型及產(chǎn)量會因菌株種類不同而具有較大的差異[4].麩皮作為面粉加工副產(chǎn)物,綜合利用率還不到20%,未能進行廣泛的深加工,極少部分用于發(fā)酵輔料[5].豆渣是豆制品生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物,由于纖維含量高、纖維顆粒大、口感粗糙、豆腥味很濃[6]等因素,對其作為飼料利用造成了一定影響.而目前關(guān)于以紅曲霉為農(nóng)副產(chǎn)品的主要發(fā)酵基質(zhì),并對其多酶特性的研究較少.

以安徽工程大學實驗室保存的一株紅曲霉菌株ZL307為實驗菌種,利用大米粉、麩皮、豆渣等常見的農(nóng)副產(chǎn)品作為主要的液態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)基質(zhì),對紅曲霉產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、纖維素酶的產(chǎn)酶條件以及4種酶對溫度、p H的耐受性進行了研究.

1 材料與方法

1.1 菌種

紅曲霉ZL307(Monascus ZL307),由安徽工程大學307實驗室保藏.

1.2 試劑

麩皮、豆渣、大米粉,市售.

福林試劑(Folin試劑);磷酸鹽緩沖液(p H 7.2);2%酪蛋白溶液;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(p H 5.0); 2%可溶性淀粉溶液;3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑(農(nóng)業(yè)部標準);磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(p H 4.6、p H 5.0);1%羧甲基纖維素鈉CMC-Na鹽溶液(p H 4.8);1%水楊素溶液(p H 4.8);1%微晶纖維素溶液.其他試劑均為國藥分析純.

1.3 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,蔗糖20,水1 000 m L,瓊脂5-20,p H自然,30℃恒溫培養(yǎng)7 d.

(2)種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖6,蛋白胨0.5,硫酸鎂0.1,磷酸二氫鉀0.25,硝酸鈉0.3,水100 m L, p H 6.0,在30℃,180 r/min條件下培養(yǎng)3 d.

(3)初始發(fā)酵培養(yǎng)基:大米粉45 g,麩皮35 g,豆渣10 g,硫酸鎂0.5 g,磷酸氫二鉀1 g,吐溫80 1 m L,水1 000 m L,p H 6.0,在30℃,180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)14 d.

1.4 儀器

BS-IEA振蕩培養(yǎng)箱(國華電器有限公司);TD5Z臺式低速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司);L5紫外分光光度計(上海精科儀器有限公司);FC104電子天平(上海精科儀器有限公司).

1.5 生物量的測定

取10 m L發(fā)酵液,用多層紗布過濾,再用蒸餾水洗滌2～3次,擰干水分,在60℃烘箱中烘干至恒重,即為菌絲干重.

1.6 培養(yǎng)基的優(yōu)化

通過單因素實驗,在初始發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上確定最佳培養(yǎng)基配方.在前述單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取大米粉添加量、麩皮添加量、豆渣添加量3個因素進行正交實驗,正交因素水平如表1所示.

表1 3因素3水平L9(33)正交試驗因素表

1.7 粗酶液制備

從搖瓶中取發(fā)酵液,3 800 r/min條件下離心20 min,上清液即為粗酶液.

1.8 淀粉酶的測定[7]

將2%可溶性淀粉溶液1.0 m L加入25 m L具塞比色管中,添加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(p H 5.0) 2 m L,40℃預熱10 min,加入1.0 m L適當稀釋的粗酶液,在40℃恒溫振蕩(160 r/min)反應1 h后,加入DNS試劑2 m L終止反應.搖勻,置沸水浴中煮沸5 min,立即冷卻,加蒸餾水定容至10 m L.以加入經(jīng)過高溫滅活的酶液管作為調(diào)零點,在波長540 nm處比色測定吸光度值.與標準曲線對照計算得到酶活.每24 h測定一次酶活,平行測定3次取平均值.1 m L粗酶液在40℃、p H 5.0條件下,1 h內(nèi)酶解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖定義為一個酶活力單位U/m L.

1.9 蛋白酶的測定[8]

在25 m L具塞比色管內(nèi)加入適當稀釋的粗酶液1 m L,置于40℃水浴中預熱2 min,再加入經(jīng)同樣預熱的2%的酪蛋白溶液1 m L,精確保溫10 min,加入0.4 mol/L三氯乙酸2 m L以終止反應,繼續(xù)置于水浴中保溫20 min,使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過濾.取上清液1 m L,加0.4 mol/L的碳酸鈉溶液5 m L,1 m L福林酚試劑,放入40℃恒溫水浴中保溫發(fā)色20 min后進行OD值測定.空白對照管試驗測定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 m L,使酶失活,再加入酪蛋白.在波長660 nm處測吸光度,根據(jù)標準曲線推算出蛋白酶的酶活.每24 h測量一次酶活,平行測定3次取平均值.37℃下每m L發(fā)酵液在1 min內(nèi)水解酪蛋白生成1 ug酪氨酸所需的酶量為1個酶活力單位U/m L.

1.10 酯化酶的測定[9]

在50m L的錐形瓶加入10 m L環(huán)己烷,4 m L無水乙醇,2 m L己酸,0.96 g無水NaSO4以及0.2 m L粗酶液,取上清液0.5 m L于100 m L的錐形瓶中,加入5 m L水,2滴酚酞指示劑,用0.05 mol/L的NaOH滴定至終點,記錄NaOH的消耗量V1,35℃的恒溫反應24 h后,再取上清液0.5 m L測定NaOH的消耗量V2,進而推算出酯化酶酶活.35℃下1 h消耗1 umol己酸所需的酶量為一個酶活力單位U/m L.每隔24 h測定一次酶活,平行測定3次取平均值.

1.11 纖維素酶的測定

1 m L粗酶液在溫度為50℃、p H為4.8條件下反應1 min,產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位U/m L.

(1)濾紙酶活力(FPA)的測定[10-11].在比色管底部加入一張(約1×3 cm,50±1.0 mg)烘干至恒重的M狀新華濾紙和0.5 m L酶液,加入p H 4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.5 m L,在50℃水浴保溫60 min,冷卻至室溫,加入DNS試劑3.0 m L,于沸水浴中顯色5 min.取出,冷卻至室溫后,加水定容至20 m L,于520 nm處測吸光值,折算成酶活單位U/m L.

(2)纖維素內(nèi)切酶活力(CMC酶)的測定[10-11].在比色管中加入0.5 m L酶液和羧甲基纖維素鈉(CMCNa)溶液1.5 m L,在50℃水浴保溫30 min,加入10%氫氧化鈉溶液2 m L,冷卻至室溫.加入DNS試劑3.0 m L,再于沸水浴中顯色5 min.取出,冷卻至室溫后,加水定容至20 m L,于520 nm處測吸光值,折算成酶活單位U/m L.

(3)纖維素外切酶活力的測定[11-12].在比色管中加入1%的微晶纖維素溶液0.5 m L和0.5 m L酶液,置于溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的震蕩培養(yǎng)箱中反應20 h,冷卻至室溫,加入DNS試劑3.0 m L,于沸水浴中顯色5 min.冷卻至室溫后,加水定容至20 m L,于520 nm處測吸光值,折算成酶活單位U/m L.

(4)β-葡萄糖苷酶活力的測定[11-12].在比色管中加入1%的水楊素溶液1.0 m L和1.0 m L適當稀釋的酶液,置于溫度為50℃的水浴保溫30 min,冷卻至室溫,加入DNS試劑3.0 m L,于沸水浴中顯色5 min.取出,冷卻至室溫后,用水定容至20 m L,于520 nm處測吸光值,折算成酶活單位U/m L.

1.12 溫度對紅曲霉產(chǎn)酶的影響

改變紅曲霉的培養(yǎng)溫度,分別設(shè)定為29℃、31℃、33℃、35℃、37℃下培養(yǎng),其他條件不變,培養(yǎng)8 d時測定4種酶的酶活,其中纖維素酶測定內(nèi)切酶酶活.

1.13 溫度對紅曲霉產(chǎn)酶的影響

改變紅曲霉的培養(yǎng)基初始p H,分別設(shè)定為4.5、5、6、6.5、7,其他條件不變,培養(yǎng)8 d時測定4種酶的酶活,其中纖維素酶測定內(nèi)切酶酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,采用單因素實驗方法,根據(jù)生物量為主要指標,以大米粉、麩皮為碳源因素,以豆渣為氮源因素,確定了紅曲霉ZL307最佳培養(yǎng)基配比.

(1)大米粉添加量對生物量的影響.改變大米粉添加量,其他條件依照初始發(fā)酵培養(yǎng)基,測定發(fā)酵第8 d的生物量.大米粉添加量對生物量的影響如圖1所示.由圖1可知,當大米粉的添加量由50 g/L升高至55 g/L時,生物量由30.297 4 g/L變?yōu)?0.298 8 g/L,僅增加了0.004 6%,大米粉添加量繼續(xù)增加并不能促進紅曲霉的生長,結(jié)合經(jīng)濟節(jié)約的原則,確定大米粉最佳的添加量為50 g/L.

(2)麩皮添加量對生物量的影響.選取大米粉添加量為50 g/L,改變麩皮的添加量,其他條件依照初始發(fā)酵培養(yǎng)基,測定發(fā)酵第8 d的生物量.麩皮添加量對生物量的影響如圖2所示.由圖2可知,當麩皮的添加量由35 g/L逐漸增加至50 g/L時,生物量由27.986 7 g/L增加至32.566 4 g/L,繼續(xù)增加麩皮會抑制紅曲霉的生長,因此,確定麩皮最佳的添加量為50 g/L.

(3)豆渣添加量對生物量的影響.選取大米粉添加量為50 g/L,麩皮添加量45 g/L,改變豆渣的添加量,其他條件依照初始發(fā)酵培養(yǎng)基,測定發(fā)酵第8 d的生物量.豆渣添加量對生物量的影響如圖3所示.由圖3可知,當豆渣的添加量由5 g/L逐漸增加至15 g/L時,生物量由29.289 3 g/L增加至33.697 5 g/L,繼續(xù)增加豆渣對紅曲霉的生長影響不大,因此,確定豆渣最佳的添加量為15 g/L.

(4)培養(yǎng)基的正交優(yōu)化.按表1設(shè)計的實驗結(jié)果進行實驗,實驗結(jié)果如表2所示.由表2可知,表中各因素對紅曲霉生物量影響程度的大小依次為:A＞C＞B,即大米粉添加量＞豆渣添加量＞麩皮添加量,直觀分析得出最佳培養(yǎng)條件為:A2B2C2,即大米粉添加量50 g/L,麩皮添加量50 g/L,豆渣添加量15 g/L.方差分析如表3所示.由表3可知,3種因素對紅曲霉生物量影響的顯著性由大到小依次為:大米粉添加量影響極顯著,豆渣添加量影響顯著,麩皮添加量影響不顯著.

表2 正交實驗數(shù)據(jù)

表3 方差分析表

2.2 紅曲霉生長曲線與殘?zhí)乔€的測定與分析

紅曲霉生長曲線與殘?zhí)乔€如圖4所示.由圖4可知,紅曲霉的生長曲線呈S型.0～1 d,紅曲霉處于遲滯期,生物量增加緩慢,紅曲霉產(chǎn)生的大量酶系使得殘?zhí)橇垦杆偕?1～4 d,紅曲霉處于對數(shù)生長期,生物量迅速增加,培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇恳查_始迅速下降;4～8 d,紅曲霉增長速度放緩,但仍然有所增加,同時殘?zhí)橇啃》然厣?至8 d后,紅曲霉處于穩(wěn)定期,生物量保持基本穩(wěn)定,培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇块_始緩慢下降,生物量達33.697 5 g/L.由于培養(yǎng)基中含有兩種碳源,即大米粉和麩皮,紅曲霉優(yōu)先利用大米粉生長,待大米粉消耗完畢,紅曲霉開始大量產(chǎn)生分解麩皮的酶系以滿足自身生長的需要,這與生長曲線與殘?zhí)乔€所反映的信息相符合.

2.3 紅曲霉發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)品過程中桔霉素的檢測

桔霉素標準品與紅曲霉發(fā)酵樣品液相色譜圖如圖5所示.圖5a為紅曲樣品中桔霉素標準的液相色譜圖,圖5b為紅曲霉發(fā)酵樣品液相色譜圖.對照譜圖分析可知,紅曲霉ZL307在發(fā)酵培養(yǎng)過程中不產(chǎn)生桔霉素.同時,前期的研究表明,該紅曲霉菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生紅曲色素[13]、Monacolin K[14]、γ-氨基丁酸[15]等活性物質(zhì),對于實際生產(chǎn)應用具有一定的價值.

2.4 紅曲霉產(chǎn)淀粉酶與纖維素酶的測定與分析

紅曲霉產(chǎn)淀粉酶與纖維素酶酶活曲線如圖6所示.由圖6可知,發(fā)酵初期0～2 d,由于培養(yǎng)基中存在著大米粉,紅曲霉大量合成淀粉酶,酶活迅速升高;發(fā)酵中期2～5 d,淀粉酶活在2 d達到最高值163.327 5 U/m L后,由于培養(yǎng)基的淀粉被迅速消耗,酶活開始出現(xiàn)波動,緩慢下降,直至第8 d降至最低值;發(fā)酵后期9～14 d,培養(yǎng)基中的淀粉已經(jīng)基本消耗殆盡,紅曲霉的淀粉酶活維持在最低點保持穩(wěn)定.

由圖6還可以看出,在3 d時才開始測得極為微弱的4種纖維素酶活;3～5 d時,酶活開始迅速增長,此時紅曲霉處于穩(wěn)定期;5～6 d時,培養(yǎng)基中的淀粉逐漸消耗殆盡,酶活增長速度放緩;6～8 d時紅曲霉開始大量產(chǎn)生纖維素酶以充分利用培養(yǎng)基中的麩皮,酶活在第8 d時達到最高值;8～11 d時產(chǎn)酶趨于穩(wěn)定; 11 d后由于培養(yǎng)基中碳源的逐漸消耗,酶活呈直線下降.同時可以得出,紅曲霉ZL307可以產(chǎn)生3種纖維素酶,即內(nèi)切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶.

通過上述的結(jié)果,對比紅曲霉生長曲線與培養(yǎng)基中的殘?zhí)乔€可以看出,在紅曲霉生長前3 d,其生長所需要的碳源主要由其產(chǎn)生的淀粉酶分解大米粉得到,至3～5 d由于大米粉逐漸消耗,紅曲霉開始產(chǎn)生纖維素酶分解麩皮以滿足生長的需要,因此培養(yǎng)基中的殘?zhí)橇砍霈F(xiàn)小幅波動,但紅曲霉所產(chǎn)生的纖維素酶酶活較低,降解麩皮所產(chǎn)生的糖不能滿足其生長需要,殘?zhí)呛恐饾u降低,至8 d后紅曲霉生長處于穩(wěn)定期,因此殘?zhí)橇勘３址€(wěn)定.綜上所述,紅曲霉的生長曲線、培養(yǎng)基的殘?zhí)乔€、淀粉酶酶活曲線與纖維素酶活曲線所表現(xiàn)出來的趨勢是一致的.

2.5 紅曲霉產(chǎn)蛋白酶的測定與分析

紅曲霉產(chǎn)蛋白酶酶活曲線如圖7所示.由圖7可以看出,發(fā)酵初期0～3 d,紅曲霉為了適應新的培養(yǎng)環(huán)境,大量合成蛋白酶,酶活迅速升高,于3 d達到最高值92.249 8 U/m L;發(fā)酵中期3～11 d,隨著培養(yǎng)基中的氮源迅速消耗,酶活呈快速直線下降的趨勢,于10 d降至最低點;發(fā)酵后期11～14 d,紅曲霉的生長狀態(tài)保持穩(wěn)定,由于氮源的緩慢消耗,蛋白酶活基本保持穩(wěn)定.由此可知,紅曲霉產(chǎn)蛋白酶酶活曲線與紅曲霉的生長曲線所表現(xiàn)出來的趨勢是基本一致的.

2.6 紅曲霉產(chǎn)酯化酶的測定與分析

紅曲霉產(chǎn)酯化酶酶活曲線如圖8所示.由圖8可以看出,發(fā)酵初期0～3 d,紅曲霉酯化酶產(chǎn)生的很少;發(fā)酵中期3～7 d,為了適應新的培養(yǎng)環(huán)境,紅曲霉快速大量合成酯化酶,第7 d時達到最大值16.672 5 U/m L;7～11 d,酯化酶酶活保持相對穩(wěn)定;隨著發(fā)酵周期的延長,11～14 d,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少,酶活穩(wěn)定下降.

2.7 溫度對紅曲霉產(chǎn)酶的影響

溫度對紅曲霉產(chǎn)酶的影響如圖9所示.由圖9可知,4種酶的最適產(chǎn)酶溫度有一定不同,且其對溫度的耐受性也有所區(qū)別.紅曲霉淀粉酶的產(chǎn)酶最適溫度為33℃,37℃時其酶活下降44.58%.纖維素酶最適產(chǎn)酶溫度為31℃,37℃時其酶活下降37.73%.蛋白酶對溫度十分敏感,產(chǎn)酶最適溫度為33℃,溫度升高至37℃時,其酶活下降78.99%.酯化酶產(chǎn)酶最適溫度為31℃,其對溫度也特別敏感,37℃時其酶活下降81.08%.由此可知,4種酶對溫度的耐受性為纖維素酶＞淀粉酶＞蛋白酶＞酯化酶.

2.8 p H對紅曲霉產(chǎn)酶的影響

p H對紅曲霉產(chǎn)酶的影響如圖10所示.由圖10可知,4種酶的最適產(chǎn)酶p H有一定不同,且其對p H的耐受性也有所區(qū)別.紅曲霉淀粉酶的最適產(chǎn)酶p H為6.5, p H為4.5時酶活最低,其酶活下降48.87%.纖維素酶最適產(chǎn)酶p H為5.5,p H為7時酶活最低,其酶活下降38.44%.蛋白酶產(chǎn)酶最適p H為6,p H為4.5時酶活最低,其酶活下降40.66%.酯化酶產(chǎn)酶最適溫度p H為5.5,p H為4.5時酶活最低,其酶活下降57.12%.由此可知,4種酶對p H的耐受性為纖維素酶＞蛋白酶＞淀粉酶＞酯化酶.

3 結(jié)論

紅曲霉菌株ZL307在含有大米粉、麩皮、豆渣等農(nóng)副產(chǎn)品的發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)時,其最佳培養(yǎng)基配方為大米粉50 g/L、麩皮50 g/L、豆渣15 g/L,生物量在發(fā)酵8 d時達到最高,可以達到33.697 5 g/L.在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)時,紅曲霉ZL307可以產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、纖維素酶.其中,淀粉酶酶活在發(fā)酵2 d時達到最大值163.327 5 U/m L;蛋白酶酶活在發(fā)酵3 d時達到最大值92.249 8 U/m L;酯化酶酶活在發(fā)酵7 d時達到最大值16.672 5 U/m L.紅曲霉ZL307可以產(chǎn)生3種纖維素酶,即內(nèi)切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶,酶活在發(fā)酵8 d時達到最大值,其中,濾紙酶活可以達到0.132 2 U/m L,內(nèi)切酶酶活可以達到0.333 1 U/m L,外切酶活酶活可以達到0.134 7 U/m L,β-葡萄糖苷酶酶活可以達到0.153 8 U/m L.4種酶對溫度的耐受性為纖維素酶＞淀粉酶＞蛋白酶＞酯化酶.4種酶對p H的耐受性為纖維素酶＞蛋白酶＞淀粉酶＞酯化酶.

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Preliminary study on multi enzyme properties of Monascus in agricultural products fermentation process

JIANG Wen,TANG Wen-jing,ZHENG Tian-zhu,TAN Sheng,ZHANG Qing-qing?
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Agricultural and sideline products as rice flour,bran,bean dregs were used as the main nutrient medium with the strain of Monascus ZL307.The conditions had been optimized by orthogonal experimental design.The results showed that amylase activity peaked at 163.327 5 U/m L in 2 days.Protease activity peaked at 92.249 8 U/m L in 3 days.Esterifying enzyme activity peaked at 16.672 5 U/m L in 7 days.Filter paper activity peaked at 0.132 2 U/m L,endonuclease activty peaked at 0.333 1 U/m L,exonuclease activity peaked at 0.134 7 U/m L andβ-glucosidase activity peaked at 0.153 8 U/m L in 8 days.Tolerance to temperature of four enzymes were cellulase＞amylase＞proteinase＞esterase.Tolerance to p H were cellulase＞protease＞amylase＞esterase.

Monascus;liquid fermentation;multi-enzyme properties;orthogonal optimization

Q93.33

A

1672-2477(2015)05-0001-07

2015-08-31

國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃基金資助項目(201310363021)

蔣 汶(1991-),男,安徽潛山人,碩士研究生.

張慶慶(1954-),女,安徽懷寧人,教授,碩導.

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