人工飼養(yǎng)背搖蚊幼蟲齡數(shù)和齡期的測定

王雪龍，陳再忠*，高建忠，黃志堅(jiān)，雷邦雄，王 磊

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306;2.共鱗實(shí)業(yè)(深圳)有限公司，深圳 518115)

背搖蚊Chironomus dorsalis 隸屬于雙翅目Diptera 長角亞目Nematocera 搖蚊科Chironomidae搖蚊屬Chironomus。搖蚊科為水生昆蟲中分布最為廣泛的一個(gè)科(Ferrington，2008)，在各類水體中均有廣泛分布，數(shù)量較大，其生物量約占底棲生物量的70%-80% (Armitage et al.，1995)，其幼蟲統(tǒng)稱搖蚊幼蟲，俗稱血蟲、紅蟲 (李明，2008)。搖蚊幼蟲營養(yǎng)豐富，其干物質(zhì)中，蛋白質(zhì)含量為41%-62%，脂肪為2%-8%，是多種經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)物如魚、蝦、蟹、龜、鱉等的優(yōu)良天然餌料(鐘詩群，1997)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，漁民常捕撈紅蟲來飼喂經(jīng)濟(jì)魚類，隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，紅蟲的需求量也越來越多，而且對品質(zhì)的要求越來越高。因此對紅蟲的基礎(chǔ)學(xué)研究，特別是對分類、形態(tài)和發(fā)育等研究領(lǐng)域具有重要意義。

日本、美國等自30年代起已對搖蚊生物學(xué)特性進(jìn)行研究，并在50年代開始了背搖蚊的人工繁殖及工廠化培養(yǎng)試驗(yàn)(代田昭彥，1968)。前蘇聯(lián)從1951年起，已有專門培養(yǎng)背搖蚊幼蟲的工廠，生產(chǎn)活餌喂養(yǎng)幼鱘魚(淡水生物學(xué)，1982)。1961年，日本的代田昭彥對背搖蚊幼蟲的培育及人工采卵等方面做了詳細(xì)研究，使其取得一定進(jìn)展。國內(nèi)相關(guān)研究中對搖蚊生物學(xué)基礎(chǔ)較缺乏，一個(gè)突出問題是難以準(zhǔn)確鑒定搖蚊種類 (吳昊等，2012)。而我國有關(guān)搖蚊的研究甚少，且集中在幼蟲的分類鑒定工作(歐陽怡然等，1984;謝祚渾，1988;齊鑫和王新華，2010;杜炫發(fā)等，2013)，毒理學(xué)研究(趙燕等，2012;張丹等，2014)，水系統(tǒng)的污染防治(孫興濱等，2005;莫文婷，2007;孫興濱和崔福義，2007)等方面。

搖蚊的生物學(xué)特征被利用在許多不同的領(lǐng)域中，比如種群動(dòng)態(tài)(Beaudouin et al.，2014)、生態(tài)作用(Frouz et al.，2009)、分類學(xué)(Trivinho-Strixino，2011)、影響環(huán)境的指示生物(Di Veroli et al.，2012)和毒性測定的試驗(yàn)生物 (U.S.Environmental Protection Agency，2000)。為了應(yīng)用于這些研究，確定種群的年齡組成很重要，而這取決于幼蟲齡期區(qū)分的能力 (Di Veroli et al.，2008)。形態(tài)學(xué)在昆蟲齡期鑒定中是一種廣泛的鑒定工具(Daly，1985)。鑒定幼蟲齡期最廣泛利用的尺寸就是腹面觀 (Mccauley，1974;Trivinho-Strixino and Strixino，1982)，頭殼的寬度(Ecole et al.，1999;Silva et al.，2008)和長度。本文通過8項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)，采用了合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對搖蚊幼蟲的齡數(shù)和齡期研究進(jìn)行規(guī)范，有比較重要的學(xué)術(shù)意義。

1 材料與方法

1.1 幼蟲的收集與飼養(yǎng)

2014年5月，試驗(yàn)組從上海浦東新區(qū)濱海養(yǎng)殖基地(31°00'N，121°53'E，海拔6 m)內(nèi)的池塘邊收集未孵化的背搖蚊卵袋1 枚，帶回實(shí)驗(yàn)室置于透明塑料框中飼養(yǎng)(尺寸大小:長×寬×高=30 cm×30 cm×5 cm)，塑料框置于28℃恒溫水浴鍋(HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造公司)內(nèi)，光照周期為L ∶D=12 ∶12。采集池塘底泥經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾后平鋪于塑料筐內(nèi)，底泥厚度5 mm 左右，水位2 cm 并加氣泵充氧。1 d 后可觀察到有幼蟲已經(jīng)孵出，從背搖蚊幼蟲孵化之日(2014年5月29 日)起，每天8 ∶00、20 ∶00 各取樣一次，每次隨機(jī)采集一定數(shù)量的背搖蚊幼蟲，投入75% 乙醇中保存 (Annelle and Constance，1982;王小藝等，2012)，貼上標(biāo)簽，注明采集日期，直至幼蟲全部化蛹(2014年6月20 日)為止。每次采集幼蟲之后滴喂數(shù)滴純牛奶供其補(bǔ)充營養(yǎng)。

將收集的幼蟲做成臨時(shí)標(biāo)本:從75%乙醇中取出幼蟲放在8% NaOH 溶液中，置于37℃搖床(THZ-92B 氣浴恒溫振蕩器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)振蕩5-8 h，然后用蒸餾水清洗數(shù)遍，將其身體腹部向上置于載玻片上，滴一滴Hoyer's 溶液(王俊才和王新華，2011)封片，并在顯微鏡(Nikon DS-Ri1)下觀察拍照，測量并記錄各形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)共收集不同齡期的幼蟲238 頭。

1.2 可量性狀的選擇及測量

背搖蚊幼蟲各形態(tài)特征描述參考王新華(2011)。通過觀察不同齡期的搖蚊幼蟲形態(tài)特征，選擇背搖蚊幼蟲身體骨化程度較高的8個(gè)部位(圖1)作為分齡形態(tài)指標(biāo)，這8 項(xiàng)形態(tài)結(jié)構(gòu)分別是:Y1-頭殼長，Y2-頦中齒頂端至冠突前緣間距離，Y3-頭殼寬，Y4-頦寬，Y5-頦中齒寬，Y6-觸角長，Y7-觸角基節(jié)長，Y8-觸角比(觸角基節(jié)與其余各節(jié)的長度之比)，然后通過比較分析得出背搖蚊幼蟲最佳分齡指標(biāo)。

圖1 背搖蚊幼蟲分齡的8個(gè)測量指標(biāo)Fig.1 Eight variables used for distinguishing instars of larval Chironomus dorsalis

將制作的臨時(shí)標(biāo)本放在顯微鏡下將幼蟲需測量的各個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)拍成JPG 格式圖片，配合圖像測量軟件(TSView Version 7.1)測量不同結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

根據(jù)測量數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件制作頻次分布表和頻次分布圖，數(shù)據(jù)頻次分布統(tǒng)計(jì)的最佳組數(shù)與組距確定方法參考李秀枝(1994)。齡數(shù)劃分后，再根據(jù)測定值計(jì)算各齡幼蟲測量指標(biāo)Y1-Y8的均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差及變異系數(shù)(王小藝等，2005)，根據(jù)Dyar 定律和Crosby 生長法則計(jì)算Brooks 值和Crosby 值。然后對分齡數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，從而得到用于背搖蚊幼蟲分齡的最佳形態(tài)指標(biāo)。

Dyar 定律認(rèn)為相鄰齡期的幼蟲，其骨化部位是以一定的幾何級數(shù)方式增長的 (Chapman，1998;彩萬志等，2001)。Crosby 生長法則認(rèn)為，Crosby 指數(shù)大于10%表明分齡指標(biāo)的分組不合理(Loerch，1983)。應(yīng)用Brooks 指數(shù)、Crosby 指數(shù)和線性回歸的方法驗(yàn)證分齡的合理性(孫艷娟等，2009)。

Brooks 指數(shù)=Xn/Xn-1(xn和xn-1分別表示n齡和n-1 齡幼蟲各個(gè)測量指標(biāo)的平均值)。

Crosby 指數(shù)=bn-bn-1/bb-1(bn和bn-1分別表示第n 和n-1個(gè)Brooks 指數(shù))。

幼蟲種群眾數(shù)齡期的計(jì)算方法參考戴志一(1980)，統(tǒng)計(jì)不同日期各齡幼蟲的數(shù)量，計(jì)算其相對應(yīng)的發(fā)育進(jìn)度(累計(jì)百分率)，將累計(jì)百分率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值，以機(jī)率值為縱坐標(biāo)，發(fā)育時(shí)間為橫坐標(biāo)，計(jì)算相鄰2個(gè)齡期間累計(jì)百分率為50%時(shí)日期差即為前一蟲齡的眾數(shù)齡期。

2 結(jié)果與分析

2.1 背搖蚊幼蟲齡數(shù)劃分

由于搖蚊一齡幼蟲在自然界很難獲取，再加上幼蟲種類鑒定的困難程度，故本實(shí)驗(yàn)選擇田間采集背搖蚊卵袋，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行孵化培養(yǎng)，定期收集并保存一定數(shù)量的搖蚊幼蟲，對骨化程度較高的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測量。將測量所得的8 組數(shù)據(jù)分別輸入SPSS Statistics 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)，在概率模板中制作頻次分布圖(圖2)。觀察頻次分布圖可看到頻次集中的幾個(gè)區(qū)域，一個(gè)集中區(qū)域就代表一個(gè)齡期 (張海濱等，2011)。

從圖1 可以看出，Y1-Y7 均明顯出現(xiàn)了相對集中的4個(gè)頻次分布集中區(qū)和4個(gè)高峰，分為4 齡;Y8 也出現(xiàn)了4個(gè)集中區(qū)域，但不明顯，分為4 齡。上述判斷僅為初步判斷，還需通過Crosby指數(shù)分析和回歸分析來驗(yàn)證其合理性。

2.2 Crosby 指數(shù)分析

針對8 種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，依次計(jì)算各個(gè)齡期的數(shù)值變幅、均值、樣本數(shù)、變異系數(shù)以及Brooks 指數(shù)和Crosby 指數(shù)(見表1)。

圖2 背搖蚊8 項(xiàng)形態(tài)參數(shù)測量值頻次分布圖Fig.2 Fruquency histograms of variable used of determining larval instars of Chironomus dorsalis

表1 背搖蚊幼蟲分齡的8 項(xiàng)指標(biāo)測量值的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Measurements and statistics of eight indicators of Chironomus dorsalis

從表1 發(fā)現(xiàn)，Y8的Crosby 指數(shù)顯著大于其他結(jié)構(gòu)，因此Y8 最先淘汰。其他7 組結(jié)構(gòu)在齡數(shù)劃分時(shí)，相鄰齡數(shù)的指標(biāo)測量值之間沒有發(fā)生重疊，是比較理想的分齡指標(biāo)。而且，這7 項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)在0.0285-0.1760，均小于20%。Y1-Y5、Y6的Brooks 指數(shù)在1.4-1.9，符合統(tǒng)計(jì)要求。其中Y1-Y4、Y6 等5 項(xiàng)指標(biāo)的Crosby 指數(shù)均小于10%，表明將背搖蚊幼蟲劃分為4 齡是合理的(王小藝等，2012)。

2.3 背搖蚊幼蟲各齡可量性狀與齡數(shù)關(guān)系擬合

對背搖蚊幼蟲各項(xiàng)分齡指標(biāo)實(shí)測平均值與相應(yīng)齡數(shù)之間關(guān)系進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明8 組數(shù)據(jù)的實(shí)測值與齡數(shù)之間符合Dyar 氏法則所描述的指數(shù)關(guān)系。經(jīng)檢驗(yàn)，回歸曲線均達(dá)到極顯著水平(見表2)。從表2 可以看出，除了Y7 和Y8 兩項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)較小，分別為0.9843 和0.9789，其他6 項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)均在0.99 以上，表現(xiàn)為極顯著相關(guān)。而且，Y1-Y6 在頻次分布中清晰的出現(xiàn)了4個(gè)峰，由此可知，將背搖蚊幼蟲劃分為4 齡更為合理。其中Y6 (觸角長)的Crosby 指數(shù)最小，變異系數(shù)最小，相關(guān)系數(shù)最大，因此Y6 是最佳分齡結(jié)構(gòu)。其次是Y2 (頦中齒頂端至冠突前緣間距離)和Y4 (頦寬)也可以作為分齡的輔助和驗(yàn)證指標(biāo)。

表2 背搖蚊幼蟲8 種可量性狀測量值回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 R2 and the linear formula of larval instars and eight morphological sructures of Chironomus dorsalis

表3 背搖蚊幼蟲各齡幼蟲的齡期Table 3 Stadia of Chironomus dorsalis larvae

2.4 背搖蚊幼蟲各齡的齡期

確定了背搖蚊幼蟲的齡數(shù)后，根據(jù)劃分幼蟲齡數(shù)最可靠的指標(biāo)Y6 (觸角長)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)不同日期各齡幼蟲的數(shù)量及其發(fā)育進(jìn)度 (累計(jì)百分率)，再將百分率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值(y)后與調(diào)查日期作線性回歸分析，卵孵化與幼蟲第一次蛻皮進(jìn)度的回歸直線機(jī)率值中值所對應(yīng)的調(diào)查日期之差即為1 齡的眾數(shù)齡期(邵景文等，2001)，以此類推，可以求得其他各齡幼蟲齡期 (見表3)。1-4 齡幼蟲齡期分別為1.32 d、2.00 d、7.51 d和8.39 d，幼蟲總歷期為19.22 d。

3 結(jié)論與討論

3.1 齡數(shù)確定和齡期判定

國外有關(guān)搖蚊幼蟲齡數(shù)和齡期的研究已見諸多報(bào)道，而國內(nèi)相關(guān)研究極少。Oliver (1971)和Mccauley (1974)提出搖蚊幼蟲普遍具有四齡，除了極少數(shù)種類。例如，Berg (1950)發(fā)現(xiàn)Cricoto flavipes Joh.、Glyptotendipes dreisbachi Joh.和耐垢多足搖蚊Polypedilum (pentapedilum)sordens (v.d.Wulp)等種類的幼蟲僅具有3 齡。Styczyński 和Rakusa-Suszczewski (1963) 報(bào) 道:Cricotopus humeralis Zett.和寄莼直突搖蚊 Orthocladius consobrinus Holmg 等種類的幼蟲具有5 齡。Peckman(1971)報(bào)道:Belgica antarctica Jacobs 種類的幼蟲具有6 齡。Kettisch (1936)提出三帶環(huán)足搖蚊Cricotopus trifasciatus (Panz.)種類的幼蟲具有7 齡。

本研究采用8 項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)，運(yùn)用Dyar 規(guī)律、Crosby 指數(shù)及回歸分析后均得出，背搖蚊幼蟲具有4 齡，并計(jì)算出了各齡幼蟲和整個(gè)幼蟲的眾數(shù)齡期。從齡期數(shù)據(jù)來看，1 齡幼蟲歷時(shí)最短(1.32 d)，3 齡幼蟲歷時(shí)稍長(7.41 d)，4 齡幼蟲歷時(shí)最長(8.39 d)，這與王俊才(2011)描述相一致。本研究中，各齡幼蟲測量指標(biāo)值與齡數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)關(guān)系，即背搖蚊幼蟲的生長發(fā)育呈幾何級數(shù)增長，符合Dyar 規(guī)律(Chapman，1998)。而且，相鄰齡期之間指標(biāo)測量值并沒有發(fā)生重疊，用來判定齡期非?？煽?。

3.2 可量性狀的選擇

由于幼蟲本身收縮、食物、環(huán)境條件等不同因素對其影響較大，故以幼蟲體長、體寬作為分齡依據(jù)，其準(zhǔn)確度較低(宗世祥等，2006)。Victor和Mccauley (1974)研究了頭殼長與頭殼寬來確定幼蟲齡期。Annelle 和Constance (1982)選取了觸角，下頜骨，頦中齒，頦和腹頦板等5個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)作為齡期區(qū)分的指標(biāo)。Vinicius 等(2013)研究了5 項(xiàng)用于形態(tài)分析的結(jié)構(gòu)，分別為:觸角，下頜骨，頦，腹頦板以及頦中齒頂端至冠突前緣間距離，并提出了將腹頦板條紋數(shù)目作為確定幼蟲齡期的替代方式。而本研究選取了容易測量且骨化程度較高的8 種形態(tài)結(jié)構(gòu)作為分齡指標(biāo)，有利于齡期判定。其中，頭殼長與頭殼寬是最常用的結(jié)構(gòu)，也已經(jīng)被許多學(xué)者所研究 (Victor and McCauley，1974)，然而在測量過程中，頭殼經(jīng)常破損或者壓扁(Annelle and Constance，1982)，給測量結(jié)果帶來較大偏差。背搖蚊幼蟲的觸角具有五節(jié)，每一小節(jié)連接處會有所彎曲，加上觸角顏色較透明，有時(shí)對測量部位的起止位置觀察不清，而影響測量;頦中齒與頦在測量過程中是最容易觀察清楚的。測量結(jié)果表明，觸角長是最佳分齡指標(biāo)，頦中齒頂端至冠突前緣間距離和頦寬的測量結(jié)果也足夠敏感去判定背搖蚊幼蟲的齡期，此3 種結(jié)構(gòu)分齡的可靠性高于其他幾項(xiàng)。

3.3 影響齡數(shù)的因素

許多因素比如溫度、光周期、高密度、食物數(shù)量和質(zhì)量都可以改變幼蟲發(fā)育和昆蟲的尺寸(Canteiro and Albertoni，2011)。暴露于化學(xué)污染物下也可能會導(dǎo)致齡數(shù)的變化或者影響幼蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)的尺寸 (Victor and McCauley，1974)。正如Hamilton 和S?ther (1971)發(fā)現(xiàn)在重污染地區(qū)收集的幼蟲會出現(xiàn)嚴(yán)重的畸形。Trivinho-Strixino 和Strixino (1982)在不同的實(shí)驗(yàn)室條件下，獲得同一種搖蚊幼蟲的結(jié)果相比較得出，幼蟲發(fā)育時(shí)間具有顯著差異，但是頭殼腹面觀的長度在每一齡期都是連續(xù)的。因此，非生物因素主要影響齡期的持續(xù)時(shí)間，但是不會明顯影響頭殼的尺寸，以至于不能區(qū)分齡期 (Vinicius et al.，2013)。Chironomus tepperi Skuse 幼蟲在野外和實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的溫度分別為17.5℃和25.0℃，但卻擁有相似尺寸的頭殼，即溫度變化尚不能引起齡期測量的不同。因此，實(shí)驗(yàn)室研究可以應(yīng)用于野外研究(Stevens，1993)。

本研究所需的背搖蚊幼蟲都是在一致的實(shí)驗(yàn)室條件下，采用粘土-牛奶培養(yǎng)基(代田昭彥，1968)飼養(yǎng)而得。以往分齡研究所采集的幼蟲大多來自野外(Styczyński and Rakusa-Suszczewski，1963;Peckman，1971;Victor and McCauley，1974;Annelle et al.，1982)，也有人工飼養(yǎng)而得到(Berg，1950;Vinicius et al.，2013)。野外環(huán)境下由于受到天敵及環(huán)境等復(fù)雜外界因素的影響，幼蟲的生長差異性大，不利于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。而相同條件下室內(nèi)人工飼養(yǎng)的幼蟲在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面具有高度的一致性，數(shù)據(jù)分析結(jié)果更為可靠(張海濱等，2011)。

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