促紅細(xì)胞生成素長(zhǎng)效化技術(shù)的研究與應(yīng)用

晏麗，白義，王浛

促紅細(xì)胞生成素長(zhǎng)效化技術(shù)的研究與應(yīng)用

晏麗，白義，王浛

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是最早通過(guò)基因工程技術(shù)研制的蛋白類(lèi)藥物之一（1989 年由 Amgen公司研制成功并上市的重組人 EPO），二十多年來(lái)一直是基因工程藥物中的常青樹(shù)。由于 EPO 應(yīng)用范圍廣、市場(chǎng)規(guī)模大，從而促使生物技術(shù)的革新不斷應(yīng)用于該品種，增強(qiáng)其生物學(xué)活性并延長(zhǎng)其體內(nèi)作用時(shí)間。本文將著重總結(jié)近年來(lái) EPO藥物長(zhǎng)效化的各種理論和實(shí)踐的成果，展望未來(lái)長(zhǎng)效 EPO藥物的發(fā)展趨勢(shì)。

1 促紅細(xì)胞生成素簡(jiǎn)介

1.1 促紅細(xì)胞生成素的結(jié)構(gòu)、信號(hào)通路和生物學(xué)作用

促紅細(xì)胞生成素是一種主要由腎臟皮質(zhì)管周?chē)g質(zhì)細(xì)胞合成并分泌（胎兒的肝臟亦可合成）的糖蛋白類(lèi)激素［1］。EPO 通過(guò)促進(jìn)骨髓中紅系祖細(xì)胞的存活、增殖和分化來(lái)控制紅細(xì)胞的生成。成熟 EPO 的多肽部分有 165 個(gè)氨基酸殘基，含四個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別位于第 24、38、83 和126 個(gè)氨基酸殘基的位置。前三個(gè)為 N 位糖鏈，最后一個(gè)為 O 位糖鏈［1］。其中，N-端糖鏈的倒數(shù)第二個(gè)糖殘基為唾液酸，它可以起到避免 EPO 被肝臟代謝，保護(hù) EPO 體內(nèi)生物活性的作用［2-4］。

EPO 的受體主要分布于紅系干細(xì)胞、巨核細(xì)胞干細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞表面［5-6］。人類(lèi) EPO 受體為一 508 個(gè)氨基酸殘基的跨膜蛋白，屬于造血生長(zhǎng)因子受體家族。EPO 與其受體結(jié)合后可激活與 EPO受體胞質(zhì)近膜區(qū)結(jié)合的 JAK-2，使其磷酸化，而磷酸化的JAK-2 可以進(jìn)一步磷酸化 STAT，啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)［5， 7］。EPO 受體活化涉及的信號(hào)通路還包括 SHC 途徑［8-9］和PI-3 激酶途徑［10］。

EPO 不僅可以作用于造血單能干細(xì)胞促進(jìn)未成熟紅細(xì)胞的增殖和成熟，最新發(fā)現(xiàn)還表明 EPO 可以阻斷紅系干細(xì)胞從紅細(xì)胞集落形成單位細(xì)胞（CFU-E）到早幼紅細(xì)胞階段的細(xì)胞凋亡，從而增加紅系干細(xì)胞的數(shù)量［11-12］。EPO 還能與血小板生成素一起促進(jìn)巨核細(xì)胞集落形成單位細(xì)胞（CSF-Meg）的增殖和成熟，并刺激胞質(zhì)與母體分離形成血小板［13］。還有發(fā)現(xiàn)表明，EPO 亦可作用于 B 細(xì)胞而提高其免疫球蛋白的合成［14］。

1.2 重組人促紅細(xì)胞生成素的研制與市場(chǎng)狀況

基于 EPO的這些生物學(xué)活性，其很早就被考慮用于貧血治療。早期 EPO 主要從尿液中提取。20世紀(jì) 80 年代，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人類(lèi) EPO 基因被從人類(lèi)基因庫(kù)中分離并測(cè)序，繼而實(shí)現(xiàn)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。1989 年，美國(guó) Amgen 公司首先研制成功重組人紅細(xì)胞生成素（rhEPO），在治療腎性貧血方面取得了令人矚目的成就［15］。但應(yīng)用其治療需要大劑量頻繁給藥，給患者的生活帶來(lái)不便，并造成較大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，人們開(kāi)始研制長(zhǎng)效 EPO 藥物。

2001 年，長(zhǎng)效 EPO Aranesp 獲 FDA 批準(zhǔn)，2002 年初正式上市，2003 年銷(xiāo)售額即達(dá)到 15.4 億美元，迅速搶占了 EPO 的市場(chǎng)。目前國(guó)際市場(chǎng)上主要的長(zhǎng)效 EPO 品種有安進(jìn)的 Epogen、Aranesp 以及強(qiáng)生的 Procrit/Eprex/Erypo。長(zhǎng)效 EPO 的市場(chǎng)前景十分廣闊，仍將是占據(jù)世界血液病治療中的主要品種。

我國(guó)自主研發(fā)的重組人 EPO 產(chǎn)品自 1997 年正式上市以來(lái)［16］，發(fā)展迅猛，目前國(guó)產(chǎn) EPO 已基本壟斷國(guó)內(nèi)市場(chǎng)。但我國(guó)企業(yè)在長(zhǎng)效 EPO 藥物研發(fā)方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國(guó)家。百泰生物藥業(yè)在國(guó)家“十二五重大專(zhuān)項(xiàng)”資助下研發(fā)的高糖基化 EPO 融合蛋白（與人 IgG 的 Fc 片段融合）在臨床前測(cè)試中表現(xiàn)出高生物活性與超長(zhǎng)半衰期（為傳統(tǒng)EPO 藥物 5.4 倍），達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，未來(lái)有望成為填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白的先進(jìn)品種。

1.3 EPO 基因的表達(dá)和臨床應(yīng)用

目前，重組人 EPO 主要在哺乳細(xì)胞中表達(dá)，包括猴腎細(xì)胞（COS 細(xì)胞）、地鼠腎細(xì)胞（BHK 細(xì)胞）、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO 細(xì)胞）和 Psi 細(xì)胞等［17］。研究表明，使用 EPO的基因組 DNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá) EPO，其表達(dá)水平明顯高于使用 EPO 的 cDNA 進(jìn)行表達(dá)。工業(yè)生產(chǎn)中重組人 EPO 蛋白主要在 CHO 細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，其 N 端糖鏈有雙末梢和四末梢兩種形式，后者是體內(nèi)生物學(xué)活性較高的形式，與天然人 EPO 相似［18］。

除腎性貧血外，重組人 EPO 藥物對(duì)再生障礙性貧血（AA）、單純紅細(xì)胞再生障礙性貧血（PRCA）、慢性髓系白血病（CML）、溶血性貧血以及由造血干細(xì)胞移植、艾滋病和癌癥引起的貧血也有一定療效，還可用于擇期手術(shù)的自身輸血血液儲(chǔ)備等方面。此外，EPO 還被用于治療寄生蟲(chóng)病患者的貧血和皮膚潰瘍［15］。

2 促紅細(xì)胞生成素長(zhǎng)效化技術(shù)

由于傳統(tǒng) EPO 藥物在體內(nèi)半衰期較短，在治療時(shí)需要大劑量頻繁給藥，給患者的身體和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)較大壓力，因此自重組人 EPO 藥物被應(yīng)用于臨床治療開(kāi)始，人們就開(kāi)始探索 EPO 的長(zhǎng)效化技術(shù)。重組人 EPO 藥物的首創(chuàng)者Amgen再次在長(zhǎng)效 EPO 研制中走在世界的前面。2001 年，Amgen研制的長(zhǎng)效 EPO 制劑新紅細(xì)胞生成刺激蛋白（NESP）率先獲得歐洲藥物評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)用于治療慢性腎衰（chronic renal failure，CRF）引起的貧血。NESP 在人體內(nèi)的半衰期為 36 h，4 倍于 rhEPO（4 ～ 8 h），可將給藥頻率降低為每周一次或隔周一次［19］。NESP 的成功推動(dòng)了其他長(zhǎng)效 EPO技術(shù)的開(kāi)發(fā)。

2.1 主要 EPO 藥物長(zhǎng)效化技術(shù)介紹

2.1.1 糖基化 作為一種糖蛋白類(lèi)激素，糖基化水平和形式對(duì) EPO 的體內(nèi)生物學(xué)活性和穩(wěn)定性扮演著至關(guān)重要的角色［20］。研究發(fā)現(xiàn)，糖基化可以增加蛋白質(zhì)在變性條件下（如變性劑、熱等）的穩(wěn)定性，防止蛋白質(zhì)分子聚集沉降［21］。

同時(shí)，糖鏈還可以占據(jù)蛋白質(zhì)表面的蛋白酶降解位點(diǎn)，從而降低蛋白質(zhì)被蛋白酶降解的可能性［22］。Amgen 的 NESP 即是受此啟發(fā)，在 33 和 88 位各增加了一個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，

以延長(zhǎng) NESP 在體內(nèi)的半衰期［19］。在國(guó)內(nèi)，沈陽(yáng)三生藥業(yè)正在研發(fā)的 NuPIAO 通過(guò)增加 N 糖基化位點(diǎn)和唾液酸延長(zhǎng)了 EPO 在體內(nèi)的半衰期，目前進(jìn)入 I 期臨床實(shí)驗(yàn)階段。目前，主要通過(guò)糖基化工程的手段對(duì)蛋白質(zhì)表面的糖基化進(jìn)行改良。這種改造可以通過(guò)氨基酸定點(diǎn)突變來(lái)增加或減少糖基化位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)［20］，也可以在體外通過(guò)化學(xué)法或酶法對(duì)糖鏈進(jìn)行修飾［23-24］。用基因工程手段改變蛋白發(fā)酵中宿主細(xì)胞內(nèi)糖基化代謝途徑中相關(guān)酶的表達(dá)與活性，也可以改變?cè)谠撓到y(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)的糖基化形式［25］。

2.1.2 EPO 二聚體 EPO 二聚體在 20世紀(jì) 90 年代開(kāi)始被研究［26］，研究發(fā)現(xiàn)其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與單體相似［27］，而其在體內(nèi)的半衰期（可達(dá) 24 h）明顯長(zhǎng)于單體［27-28］，并且具有高于單體數(shù)倍的促進(jìn)紅細(xì)胞再生能力［27］。這種生物學(xué)活性的增高可能是由于兩個(gè) EPO 分子融合可以提供兩個(gè)緊密連結(jié)的 EPO 受體高親和力結(jié)構(gòu)域，從而在與 EPO

受體結(jié)合時(shí)引發(fā)受體橋聯(lián)繼而構(gòu)象改變，增加其信號(hào)傳導(dǎo)效率［26］。目前，構(gòu)建 EPO 二聚體的方法主要是化學(xué)交聯(lián)和重組 DNA 介導(dǎo)的編碼區(qū)融合，均能獲得比天然單體更穩(wěn)定，

活性更高的蛋白［28-29］。在國(guó)內(nèi)，長(zhǎng)春博泰醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司曾研發(fā)過(guò)一種 EPO 二聯(lián)體融合蛋白，展示出良好的體外活性［30］，但未見(jiàn)后續(xù)研發(fā)進(jìn)展的報(bào)告。

2.1.3 EPO 的 Fc 融合蛋白 人 IgG 免疫球蛋白在體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)達(dá) 21 d。而將人 IgG 的 Fc 片段與其他蛋白結(jié)合形成融合蛋白，亦可大幅延長(zhǎng)融合蛋白的半衰期［31-32］。但是，F(xiàn)c 片段可以在人體內(nèi)活化 Fc 受體和補(bǔ)體途徑，因此會(huì)引起抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒作用（CDC）［32］。這種性質(zhì)對(duì)用作拮抗劑的蛋白藥物影響較小，但是如果將用作激動(dòng)劑的蛋白藥物（如EPO）與 Fc 片段融合則會(huì)對(duì)藥效產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。目前，主要通過(guò)基因工程方法突變或刪除 Fc 區(qū)域與受體和補(bǔ)體結(jié)合部位的關(guān)鍵氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)減少融合蛋白在體內(nèi)的 ADCC 和 CDC 作用。

最新的研究表明，使用由 IgD 的 CH2 區(qū)和 IgG4 的CH3 區(qū)融合而成的混合 Fc（hybrid Fc）片段，既可以擁有如 IgG 一樣的較長(zhǎng)的半衰期，又具有 IgD 那樣不激活補(bǔ)體途徑的性質(zhì)（高濃度的 IgD Fc 碎片可以激活補(bǔ)體旁路途徑），避免干擾藥效發(fā)揮的 CDC 作用［33］。另外，F(xiàn)c 片段可能因空間位阻問(wèn)題降低融合蛋白的生物學(xué)活性，因此在主體蛋白和 Fc 片段之間需要一個(gè)彈性非常好的鉸鏈區(qū)分隔［33］。目前國(guó)際上還沒(méi)有 EPO 的 Fc 融合蛋白藥物上市，但是其他 Fc 偶聯(lián)蛋白藥物已有成功上市的先例，如Enbrel（TNFR-Fc）、Orencia（CTLA4-Fc）等。在國(guó)內(nèi)，百泰生物藥業(yè)目前正在研發(fā)的 NESP/IgG2 融合蛋白在不降低 NESP 原有體內(nèi)活性的基礎(chǔ)上可將其半衰期進(jìn)一步延長(zhǎng)4.4 倍（大鼠）。

2.1.4 聚乙二醇化學(xué)修飾 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是環(huán)氧乙烷的寡聚物和聚合物的統(tǒng)稱(chēng)，用聚乙二醇鏈來(lái)修飾蛋白質(zhì)可以保護(hù)蛋白多肽結(jié)構(gòu)并減少腎對(duì)其的排泄作用，延長(zhǎng)其半衰期和降低其血漿清除率［34］。PEG 修飾的糖基化 rhEPO 在人體內(nèi)的半衰期是未經(jīng)修飾的糖基化rhEPO 的 6 倍［34-35］。另外，PEG 的免疫原性非常低，可以避免服藥后在體內(nèi)產(chǎn)生 PEG 的抗體［34］。PEG 鏈的大小對(duì)其修飾的蛋白的體內(nèi)半衰期和體外生物活性至關(guān)重要：鏈越大在體內(nèi)的清除率越低，半衰期也就越長(zhǎng)；但更長(zhǎng)的 PEG鏈也會(huì)導(dǎo)致修飾的蛋白生物學(xué)活性下降［34-35］。因此，在對(duì)目的蛋白藥物進(jìn)行修飾時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)?PEG 鏈長(zhǎng)度和分支形式。

目前唯一上市的 PEG 化 rhEPO 藥物是羅氏的Mircera（CERA?），它分別在羅氏原有藥物 Epogin 的 N 端52位和 45 位賴(lài)氨酸殘基上通過(guò)氨基偶聯(lián)了 30 kD 的甲氧基 PEG 鏈［36-37］。這種革命性的藥物是目前唯一一種每月只需打一針的持續(xù)紅血球生成素受體激動(dòng)藥。

2.1.5 EPO 的人絨毛膜促性腺激素亞基融合蛋白 人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）是一種糖蛋白類(lèi)激素，由一個(gè)含 92 個(gè)氨基酸殘基的 α 亞基和一個(gè)含 145 個(gè)氨基酸殘基 β 亞基構(gòu)成異源二聚體。其α 亞基與促黃體素（LH）、促濾泡素（FSH）和促甲狀腺激素（TSH）的 α 亞基相同，β 亞基則不同。其中，hCG 的 β 亞基（hCG）的羧基端帶有四個(gè) N-連接寡糖識(shí)別位點(diǎn)［38］。

研究表明，將 hCG 帶有四個(gè) N-連接寡糖鏈的羧基端與人促濾泡素（FSH）、促甲狀腺激素（TSH）組成融合蛋白，不會(huì)影響這些激素的富集、分泌和與受體的親和力，但是能夠顯著提高這些蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性和在血液循環(huán)中的半衰期［39-41］。隨后，將 hCG 與 EPO 形成融合蛋白以延長(zhǎng) EPO 在體內(nèi)半衰期的試驗(yàn)也取得了成功［42-43］。

另外，人促血小板生成素（human thrombopoietin，hTpo）的羧基端部分存在大量親水的氨基酸殘基和 6 個(gè) N 端糖基化位點(diǎn)，被認(rèn)為具有穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用［44-45］。與 EPO進(jìn)行的融合表達(dá)試驗(yàn)也證明，hTpo 的羧基端可以延長(zhǎng) EPO在體內(nèi)的半衰期［46］。以上的研究表明，用富含糖鏈的肽段與 EPO 融合表達(dá)，可以提高 EPO 的半衰期。上述研究尚未應(yīng)用于企業(yè)的藥物開(kāi)發(fā)中，但對(duì)未來(lái)嵌合 EPO 藥物的研發(fā)帶來(lái)啟示。

圖1 rhEPO-Fc 對(duì)體內(nèi)網(wǎng)織紅細(xì)胞生成的促進(jìn)作用

2.2 長(zhǎng)效 EPO 融合蛋白的藥理學(xué)研究

在新型 EPO 藥物中，高糖基化產(chǎn)品已經(jīng)上市應(yīng)用多年，其臨床藥理、藥代方面的研究已經(jīng)比較豐富，本文將著重介紹更新一代的長(zhǎng)效化 EPO 品種，主要是 EPO 的 Fc融合蛋白在藥理學(xué)研究方面的進(jìn)展情況。目前，抗體 Fc 融合蛋白技術(shù)的實(shí)用性已經(jīng)在商業(yè)化產(chǎn)品中得到認(rèn)可，如CTLA-4-Fc（Orencia、Apatacept），LFA3-Fc（Amevive）和TNFR-Fc（Enbrel）［47］。盡管促紅細(xì)胞生成素類(lèi)藥物尚沒(méi)有Fc 融合蛋白產(chǎn)品上市，但是企業(yè)界與學(xué)術(shù)界對(duì)其體內(nèi)外的藥理、藥效的研究熱情由來(lái)已久，并已經(jīng)顯示了積極的結(jié)果。

上海維亞生物技術(shù)公司曾聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)檢測(cè)了其研發(fā)的 EPO 的 IgG2 Fc 融合蛋白（Fc 片段經(jīng)改造去除了CDC 和 ADCC 活性［48-49］）在大鼠、小鼠和恒河猴中的體內(nèi)藥理和藥代。結(jié)果顯示，經(jīng)皮下注射給藥，該 rhEPO-Fc 融合蛋白在恒河猴血漿中峰濃度和 AUC（0 ～ 168 h）均與注射劑量正相關(guān)，而達(dá)峰時(shí)間、血漿清除率和半衰期則與劑量無(wú)關(guān)；其中，該藥血清中半衰期為 29.5 ～ 38.9 h。在大鼠模型中，該 rhEPO-Fc 融合蛋白表現(xiàn)出相似的藥代動(dòng)力學(xué)，其半衰期達(dá)到 35.5 ～ 43.5 h。而該藥物對(duì)射線(xiàn)照射誘導(dǎo)（小鼠）、部分腎切除誘導(dǎo)（大鼠）和環(huán)磷酰酯誘導(dǎo)（恒河猴）的貧血癥狀均有劑量依賴(lài)性的改善［50］。另外，百泰生物藥業(yè)研發(fā)的 NESP/IgG2 融合蛋白經(jīng)靜脈注射給藥，在近交系雌性 Balb/C 小鼠中表現(xiàn)出與 rhEPO 相同的促紅細(xì)胞生成活性（圖 1），而半衰期達(dá)到 53 h。

在國(guó)外，使用由 IgD 的 CH2 區(qū)和 IgG4 的 CH3 區(qū)融合而成的混合 Fc 片段制成的新型 EPO-Fc 融合蛋白GX-E2 已經(jīng)進(jìn)入 I 期臨床實(shí)驗(yàn)［51］。該蛋白在之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出比 Aranesp 更長(zhǎng)的血清半衰期（31.6 h vs 15.6 h）［52］。而在藥效方面，GX-E2 在注射后 10 ～ 40 d 提高血清中血紅蛋白水平的能力也顯著強(qiáng)于 Aranesp［52］。另外，在食蟹猴模型中，反復(fù) 9 次給藥后未檢測(cè)到受試動(dòng)物體內(nèi)有針對(duì) GX-E2 的抗體被誘導(dǎo)出來(lái)，說(shuō)明這種融合蛋白的免疫源性很低［52］。以上結(jié)果均顯示了 EPO-Fc 融合蛋白良好的成藥潛力，很可能成為 EPO 藥物市場(chǎng)未來(lái)的重要增長(zhǎng)點(diǎn)。

3 展望

綜上所述，近年來(lái) EPO 藥物長(zhǎng)效化技術(shù)有了長(zhǎng)足發(fā)展，其中比較成熟并已應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的方法主要是對(duì)rhEPO 進(jìn)行糖基化修飾、抗體 Fc 片段融合和 PEG 化（糖基化修飾經(jīng)常和 Fc 融合蛋白結(jié)合使用）。其中，EPO 的Fc 融合蛋白由于構(gòu)建和純化比較方便將成為未來(lái)長(zhǎng)效EPO 藥物的主流，而對(duì)融合的 Fc 片段進(jìn)行基因工程的突變改造以降低其體內(nèi) ADCC 和 CDC 活性將成為未來(lái)長(zhǎng)效 EPO 研發(fā)的主要目標(biāo)和創(chuàng)新點(diǎn)。另外，設(shè)計(jì)一個(gè)合適的具有彈性的鉸鏈區(qū)連結(jié) EPO 和 Fc 片段也是研發(fā)的一個(gè)重要課題。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.012

十二五“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX 09401002-006）

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王浛，Email：caroldman@163.com

2015-03-27