流感疫苗的研究進展

秦添，黃鳳杰，顧覺奮

流感疫苗的研究進展

秦添，黃鳳杰，顧覺奮

流 感 病 毒 （ influenza virus） 是正 黏 病 毒 科（Orthomyxoviridae）的代表種，系 RNA 病毒，直徑 80 ～ 120 nm，呈球形或絲狀，其包膜上含有血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA），從而形成了不同的亞型。人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒的病原體［1］。其特點是容易發(fā)生變異，其中甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，可感染人和多種動物，為人類流感的主要病原，常引起大流行和中、小流行。例如，2009 年甲型 H1N1 流感在全球范圍內(nèi)的大流行造成了至少 1.2 萬人死亡［2］。乙型流感病毒一般不會引起全球范圍內(nèi)的大流行，但是它能夠引起地區(qū)性、季節(jié)性的流行。丙型流感病毒只會引起人類輕微的上呼吸道感染，極少造成流行。目前，預(yù)防人類流感致病和流行最有效的方法仍是接種疫苗。本文就近年來流感疫苗的研究進展作一概述。

1 流感病毒滅活疫苗

流感病毒滅活疫苗主要分為四類，包括全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗以及病毒原質(zhì)體疫苗（圖 1）。

1.1 全病毒疫苗

全病毒疫苗即完整的病毒粒子，其包含病毒全部抗原和脂質(zhì)外殼。將流感病毒接種于雞胚尿囊腔中，兩天后收獲尿囊液，加入福爾馬林使其滅活，然后采用離心或色譜的方法對尿囊液進行進一步的濃縮和純化，得到病毒原液，最后加入適當(dāng)?shù)淖魟┘礊榱鞲腥《緶缁钜呙?。滅活疫苗免疫原性高且具有相對較低的生產(chǎn)成本，是目前最常用的方法。但這種方法對流感病毒進行分離或傳代易引起其抗原性的改變，且批量化生產(chǎn)時易造成污染。近年來，使用非洲綠猴腎細胞（Vero 細胞）代替雞胚成為流感疫苗生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。Vero細胞已成功開發(fā)出了多種疫苗，研究表明，以低感染復(fù)數(shù)接種 Vero 細胞時，亦可獲得高產(chǎn)量的流感病毒，且當(dāng)細胞維持液中胰酶濃度為 12.5 ～ 15 μg/ml，pH 為 7.4 ～ 7.6 時，可得到最大產(chǎn)量［3］。

盡管如此，滅活疫苗仍存在許多缺陷，主要表現(xiàn)在：滅活疫苗是一種死疫苗，失去了病毒的自然感染能力，皮下接種只能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的 IgG 抗體，無法刺激呼吸道黏膜產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白 A（sIgA），故不能有效地阻止病毒在呼吸道內(nèi)繁殖；由于流感病毒具有很高的變異性，故需要每年接種，這無疑增加了接種的痛苦和潛在的感染風(fēng)險；其保護作用有限，交叉保護作用很弱；由于存在病毒膜脂質(zhì)成分，具有較強的反應(yīng)原性，在兒童中的發(fā)熱率高，故不適用于 12 歲以下的兒童。

1.2 裂解疫苗

裂解型流感病毒滅活疫苗是采用合適的裂解劑和裂解條件將流感病毒裂解，去除核酸和大分子蛋白，只保留其抗原有效成分 HA 和 NA 以及部分基質(zhì)蛋白（M 蛋白）和核蛋白（NP），然后進一步分離純化制備而成。

1.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是在裂解疫苗的基礎(chǔ)上開發(fā)出的一種新型疫苗，其只包含病毒的 HA 和 NA 抗原蛋白，其他基質(zhì)蛋白均被去除。這類疫苗大大降低了副反應(yīng)的發(fā)生，安全性較高，但相應(yīng)的，免疫原性也大大削弱，常不能引起有效的免疫應(yīng)答。

1.4 病毒原質(zhì)體疫苗

圖1 流感病毒滅活疫苗示意圖［1］

流感病毒中的基質(zhì)蛋白是由高度保守的氨基酸殘基組成的膜蛋白，與 HA 和 NA 的易變性形成了鮮明對比。Berthoud 等［4］設(shè)計制備出針對流感病毒 A 的核蛋白和基質(zhì)蛋白 1（MVA-NP+M1）的新型疫苗，并進行了 I 期臨床試驗。該疫苗具有良好的安全性和耐受性，誘導(dǎo)產(chǎn)生的T 細胞數(shù)遠高于目前市售的任何一種流感疫苗。

2 流感病毒減毒活疫苗

流感病毒減毒活疫苗（LAIV）是將病毒在人工培育的條件下，使其致病性大部分喪失，但仍保留其免疫原性，故仍可刺激機體免疫細胞產(chǎn)生抗體的一類疫苗。其和自然感染具有很大的相似性，克服了滅活疫苗對兒童和老人免疫原性低的不足，所以其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相比滅活疫苗更加迅速和強烈。與滅活疫苗相比，優(yōu)勢主要表現(xiàn)在：①能有效地控制流感病毒在呼吸道的繁殖；②可滴鼻或噴鼻途徑給藥；③對不同亞型的流感病毒具有一定的交叉保護作用。

LAIV 一般為經(jīng)鼻接種的三價季節(jié)性疫苗，包括兩種A 型（H1N1和 H3N2 亞型）和一種 B 型流感病毒［5］。LAIV在嬰幼兒、兒童和成人中均具有良好的耐受性。LAIV 相對于三價滅活流感疫苗（TIV）顯示出了更好的免疫效果，在許多國家 6 ～ 59 個月的嬰幼兒和兒童中已進入了 III 期臨床試驗。而在成人中，這種優(yōu)勢卻不明顯，故歐洲健康署還未批準其應(yīng)用于成人［6］。目前，應(yīng)用比較廣泛的 LAIV 為冷適應(yīng)性疫苗，通常由基因重組的方法獲得。Kiseleva 等［7］研究表明，重組病毒并不會具有更強的毒力或產(chǎn)生更強的損傷作用，這為 LAIV 的安全應(yīng)用提供了額外的依據(jù)。此外，一些單價 LAIV 可對多種病毒亞型起作用，如有研究表明，H7N3 減毒流感疫苗亦可預(yù)防 H7N9 禽流感病毒的感染［8］。

3 基因工程疫苗

流感病毒基因工程疫苗即使用 DNA 重組技術(shù)，將天然或人工合成的病毒遺傳物質(zhì)定向插入細菌、酵母菌或哺乳動物細胞中，使之充分表達，再經(jīng)純化而制得的疫苗。由于病毒主要的免疫學(xué)結(jié)構(gòu)為 HA，其含有大多數(shù)的抗原決定簇，所以采用基因工程的方法直接合成 HA 為制備流感疫苗提供了新思路。

長期以來，人們認為流感疫苗生產(chǎn)中血凝素分子必須在脊椎動物細胞中表達，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的折疊、糖基化和分泌。但隨著研究的深入，這種說法已經(jīng)不是很準確。美國疾控中心的一個實驗室通過敲除 HA 的 N 端糖基化位點制得的 DNA 疫苗，將其免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其免疫原性并沒有明顯的變化［8］。隨后，另外兩個團隊在 Escherichia coli 中也成功表達出了流感病毒 HA［9］。

美國蛋白質(zhì)科學(xué)公司通過昆蟲細胞病毒載體（桿狀病毒群）感染昆蟲（粘蟲、草地貪夜蛾）細胞，成功制得了流感血凝素—— FluBlok，使用昆蟲細胞表達外源基因越來越得到了人們的認可。一種上市的人類乳頭瘤融合蛋白病毒疫苗—— Cervarix?即是使用的這種表達系統(tǒng)。FluBlok 是一種新型的蛋白疫苗，其包含三種全長的重組 HA 蛋白，即甲型 H1N1 流感病毒 HA、甲型 H3N2 流感病毒 HA 和乙型流感病毒 HA。FluBlok 是首個采用 DNA 重組技術(shù)生產(chǎn)的三價流感疫苗，相比于傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)模式，其具有可大量制備、純度高等特性。臨床試驗顯示這種疫苗具有良好的耐受性和免疫原性。2013 年 1 月 16 日，美國 FDA 批準FluBlok 上市，用于預(yù)防 18 ～ 49 歲人群的季節(jié)性流感［10］。

美國 Novavax 公司采取與 FluBlok 相似的方法，通過桿狀病毒載體感染昆蟲細胞得到了一種病毒樣微粒（virus-like particles，VLPs）。該微粒含有 HA、NA 和流感病毒基質(zhì)蛋白?；|(zhì)蛋白可使 HA 和 NA 牢固地結(jié)合在其上，從而構(gòu)成一個 VLPs。這種微粒的優(yōu)點在于能夠利用樹突狀細胞微粒識別機制來攝取該粒子。

美國弗勞恩霍夫分子生物技術(shù)中心使用煙草花葉病毒載體在煙葉中表達出了 HA。將植株反向放置在容器中，然后向其中緩慢加入載體病毒 DNA 溶液，直到淹沒葉片為止。在真空的環(huán)境下，葉片底部的氣孔打開，將 DNA 吸入其中，從而得到表達。這種疫苗在 I 期臨床試驗中顯示出了免疫原性［11］。加拿大 Medicago 公司使用農(nóng)桿菌作為載體也取得了成功［12］。

4 核酸疫苗

4.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗即把一個或多個編碼抗原蛋白的基因克隆到真核表達載體上，再將此重組載體導(dǎo)入機體內(nèi)，從而表達得到抗原蛋白，激活機體的免疫反應(yīng)。相對于普通疫苗，DNA 疫苗有以下優(yōu)點：質(zhì)粒 DNA 穩(wěn)定性較高；生產(chǎn)工藝簡單，成本低；相對于減毒活疫苗，不具有感染的風(fēng)險；一個質(zhì)粒 DNA 可編碼多種抗原蛋白；可誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫雙重反應(yīng)［13］。

目前，DNA 疫苗的主要給藥方式仍是肌肉注射，這使得疫苗很難穿過細胞膜，僅有少量到達抗原呈遞細胞（APC）而引起免疫反應(yīng)，這無疑限制了 DNA 疫苗的應(yīng)用。Zhao等［14］使用乳化分散法，將豬流感病毒 DNA 疫苗封裝于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球中，測定了其免疫應(yīng)答強度，結(jié)果顯示，微球具有較高的封裝率和穩(wěn)定性，表達出的抗原蛋白具有良好的生物活性且表達持續(xù)時間長，明顯提高了 DNA 疫苗的免疫效率。隨后，其使用復(fù)合凝聚法將豬流感病毒 DNA 疫苗封裝于殼聚糖納米粒子中，亦取得了良好的效果［13］。

4.2 mRNA 疫苗

mRNA 疫苗作用機制與 DNA 疫苗相似，mRNA 疫苗經(jīng)接種后，不需要轉(zhuǎn)運到細胞核中而可以直接被翻譯，從而延長了其半衰期。相比于 DNA 疫苗，mRNA 疫苗具有更高的抗原蛋白表達量，給藥量可以得到更精確的控制，且可以降低整合到宿主基因組的風(fēng)險。Petsch 等［15］通過優(yōu)化mRNA 疫苗的 GC 含量和 UTR 序列，再將其整合到核酸精蛋白上，從而使 mRNA 免受 RNase 的降解，提高了其穩(wěn)定性。有研究表明，流感 mRNA 疫苗對流感病毒感染的小鼠、雪貂和豬模型均具有良好的免疫效果［16］。

表1 通用流感疫苗的病毒靶點

5 通用流感疫苗

通用流感疫苗所采用的抗原蛋白通常有 HA、M（M1 和 M2）、NP 和 NA 蛋白。各種抗原的靶向位點、靶向功能和可能的保護機制如表 1 所示。目前，研究最多的是基于 M2、NP 和 M1 的通用流感疫苗。

5.1 基于 M2 的通用流感疫苗

M2（M2e）是一種小膜本體蛋白質(zhì)，起到 pH 依賴的質(zhì)子通道作用，在 HA的成熟加工和病毒基因組釋放到細胞質(zhì)的過程中必不可少［17］。然而，基于 M2 蛋白的疫苗免疫原性較弱，因此人們采用了許多方法以克服此缺點，如將M2 肽段整合到免疫原性強的載體蛋白上，或通過桿狀病毒或哺乳動物細胞表達的蛋白質(zhì)而得的 VLPs 進行遞送［18］。

5.2 基于 NP 和 M1 蛋白的通用流感疫苗

甲型流感病毒中 NP 和 M1 蛋白的氨基酸序列相對保守，因為這些蛋白未暴露在病毒表面，主要引起細胞免疫應(yīng)答，尤其是 CTL 應(yīng)答［19］。在小鼠中，除了 CD8+CTLs外，NP 抗體還參與了基于 ADCC 的病毒清除作用［20］。然而，在人體中，抗 NP 抗體水平變化多樣且很少通過三價滅活疫苗而增加，因此，NP Ab 介導(dǎo)的 ADCC 在人體異源亞型免疫中的保護作用尚不明朗［21］。

目前，人們采用基于載體或基于直鏈肽段的抗原遞送方法來誘發(fā)人體有效的 CTL 應(yīng)答。臨床 I 期和 II 期試驗使用改良的安卡拉疫苗病毒（MVA）表達 NP 和 M1 蛋白，結(jié)果表明，盡管過高劑量仍會引起一些不適，如惡心、嘔吐等反應(yīng)，但總體上 MVA-NP+M1 疫苗安全性較高［4］。另有研究使用從甲型和乙型流感病毒中分離出的多種病毒蛋白（HA、NP、M1），制成含有多種線性表位的重組蛋白，這種疫苗即使在高劑量下亦具有良好的耐受性，其產(chǎn)生的抗體可誘導(dǎo) ADCC 作用，具體機制尚不清楚［22］。

6 流感疫苗佐劑

佐劑是一種非特異性免疫增強劑，與抗原共同使用時可增強機體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。

6.1 鋁膠佐劑

鋁膠佐劑是目前使用最廣泛且歷史最悠久的流感疫苗佐劑，主要有氧化鋁、氫氧化鋁和磷酸鋁三種形式。其中氫氧化鋁具有安全性較好、不良反應(yīng)少等特點，最為常用。Thueng-in 等［23］采用磷酸鋁佐劑制作了毒株 NIBRG-14 的全病毒滅活疫苗，用來預(yù)防甲型 H5N1 流感，試驗表明安全性較好且只需接種一劑即可產(chǎn)生免疫。

隨著納米科技的發(fā)展，納米 Al（OH）3佐劑慢慢引起了人們的關(guān)注，其具有粒徑小、比表面積大等特點，在增強佐劑活性的同時，又大大降低了副作用，不失為一個嶄新而有前景的研究方向。

6.2 表面活性劑

MF59 是一種水包油乳劑，瑞士諾華公司已將其應(yīng)用于TIV 中，其疫苗的凈劑量未增加，但免疫原性得到了大大提高。AS03 也是一種水包油型乳劑，英國葛蘭素史克公司將其用于 H1N1 流感疫苗 PandemrixTM中。GLA-SE 是一種穩(wěn)定的水包油型納米乳，作為 Toll 樣受體（TLR）激動劑，法國賽諾菲巴斯德將其用在 Fluzone?中，實驗表明它可以有效增強機體的保護性免疫［24］。

流感病毒滅活疫苗即使不加鋁膠佐劑亦具有效力。在許多 TLR7 敲除的小鼠中，流感病毒滅活疫苗具有更高的效力，表明這種現(xiàn)象依賴于 TLR7 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［25］。流感病毒滅活疫苗中殘留的病毒 RNA 可通過 TLR7 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到佐劑的作用。然而，此作用對于其他單鏈 RNA 病毒仍有很大爭議，因為 TLR7 和 TLR8 的多態(tài)性并不能影響麻疹死疫苗的免疫應(yīng)答［26］。

7 小結(jié)與展望

流感病毒是目前研究得最透徹的病毒之一，但因其具有極強的變異性，尤其是甲型流感病毒，給科研和治療帶來了極大的困難，至今仍沒有創(chuàng)造出可完全杜絕流感發(fā)生和流行的疫苗或方法。近年來流感疫苗的研究飛速發(fā)展，一些新型疫苗技術(shù)也在流感疫苗的生產(chǎn)中得到了成功應(yīng)用。新的疫苗給藥方式如微粒介導(dǎo)透皮輸送（PMED）系統(tǒng)等也顯示出了廣闊的應(yīng)用前景，各種優(yōu)化的疫苗組合方式，如佐劑在通用疫苗和 DNA 疫苗中的聯(lián)合應(yīng)用，成為了未來研究的主要趨勢。理想的流感疫苗應(yīng)該具有較大的溫度適用范圍，劑型簡單便于管理，單一劑量能保護多種亞型的流感和能夠起長期保護作用等特性。在新的形勢下我們需加快流感疫苗及相關(guān)技術(shù)的研發(fā)，以應(yīng)對未來更加復(fù)雜的流感疫情。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.013

210009 南京，中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

黃鳳杰，Email：hfj@cpu.edu.cn；顧覺奮，Email：yqyan1@ 126.com

2015-03-10