黃芪提取物對大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的作用

劉暖，毛秉豫，楊雷，徐國昌，葉松山，張培華，張瓅芳

黃芪提取物對大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的作用

劉暖，毛秉豫，楊雷△，徐國昌，葉松山，張培華，張瓅芳

目的探討黃芪提取物對大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞（EPCs）黏附、遷移、活力、血管形成能力及內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表達的影響。方法體外培養(yǎng)、分離和鑒定EPCs，設(shè)10-4、10-3、10-2g/L黃芪提取物組和對照組。倒置顯微鏡下觀察并比較各組EPCs黏附、遷移、血管形成能力的差異；MTT法檢測EPCs的活力變化；RT-PCR法檢測EPCs中eNOS mRNA的表達；Western blot檢測EPCs中eNOS蛋白的表達。結(jié)果與對照組相比，不同濃度黃芪提取物組促EPCs黏附、遷移、血管形成能力均顯著增強，且呈濃度依賴性（F值分別為15.256、13.633、97.549，均P＜0.05）；EPCs的活力顯著增加，呈時間（F時間=9.755）和濃度依賴性（F組間=10.018）；且EPCs中eNOS mRNA和蛋白的表達水平均明顯升高，呈濃度依賴性（F值分別為56.356、77.125，均P＜0.05）。結(jié)論黃芪提取物具有調(diào)控EPCs促血管新生的作用，該作用可能與上調(diào)eNOS的表達水平密切相關(guān)。

黃芪；骨髓祖代細胞；細胞黏附；細胞運動；內(nèi)皮祖細胞；血管新生；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶

骨髓源性內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells,EPCs）在缺氧、生長因子、炎癥因子及趨化因子的作用下，可以從骨髓中動員進入循環(huán)，進而進入損傷部位分化為成熟的內(nèi)皮細胞，并通過旁分泌的方式調(diào)控現(xiàn)存的內(nèi)皮細胞，以一種和胚胎時期血管形成相似的方式分化成為血管內(nèi)皮細胞，進一步形成血管，參與缺血性心血管系統(tǒng)疾病損傷的修復(fù)進程，是當(dāng)前促血管新生療法的研究熱點之一［1］。本課題組前期研究證實，黃芪可明顯改善大鼠心肌梗死后異常的血液流變學(xué)指標、組織病變，并具有促血管新生的作用［2］。有研究表明黃芪可明顯促進外周血EPCs的黏附、遷移［3-4］。但有關(guān)黃芪對大鼠骨髓源性

EPCs的作用，及黃芪促血管新生的作用是否和其對EPCs的作用密切相關(guān)尚少見報道。本研究旨在探討黃芪提取物對大鼠骨髓源性EPCs黏附、遷移、活力和血管形成的作用，并分析其對內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）表達的影響，為黃芪調(diào)控EPCs誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細胞，促缺血損傷心肌組織中血管的新生提供體外實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康雄性SD大鼠12只，購自河南省實驗動物中心，清潔級，8周齡，體質(zhì)量約200～240 g，平均（212± 6）g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2010-0002，動物質(zhì)量合格證號：1000142。

1.1.2 藥物與試劑黃芪由南陽理工學(xué)院方藥研究所黃顯章副教授鑒定，為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus mongholicus Bge.）的干燥根；黃芪提取物由南陽理工學(xué)院方藥研究所提供，系經(jīng)水提、大孔吸附樹脂純化所得純化后的黃芪提取物（astragalus extract，AE）；黃芪總苷的含量為66.9%，批號：2012021。DNA酶Ⅰ、Dulbecco's PBS、FBS、膠原酶Ⅰ購自上海寶曼生物科技有限公司（生產(chǎn)批號分別為LS002004、28374、SH30077、LS004194）；內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（endothe?lial basal medium-2,EBM-2）購自北京達科為生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號為CC-3156）；CD133、CD34、eNOS、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor recep?tor 2,VEGFR-2）抗體購自天津恒業(yè)生物科技有限公司（生產(chǎn)批號為EL910835、EL162014、EL163112和EL171852）；羊抗兔IgG、二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine,DAB）顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司（生產(chǎn)批號為TC1378和DD1660）；纖連蛋白（Fibronectin,FN）、異硫氰酸熒光素（fluo?rescein isothiocyanate,FITC）和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′, 6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）購自北京碧橙藍生物科技有限責(zé)任公司（生產(chǎn)批號為PA127507、PA185438和62247）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器A2-1389型生物安全柜（美國Thermo Sci?entific公司）；164-5052型PowerPac HC電泳儀及FACSCan?toⅡ型流式細胞儀（美國BIO-RAD公司）；Bullet Blender Storm組織細胞破碎儀（美國Next Advance公司）；Nikon Tis型熒光顯微鏡及Nikon NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定取SD大鼠，頸椎脫臼處死后，75%乙醇浸泡10 min，無菌操作環(huán)境下取出脛腓骨，用含肝素及DNA酶Ⅰ的Dulbecco's PBS反復(fù)沖洗骨髓，收集骨髓液，小心置入等量的淋巴細胞分離液中，1 700 r/min離心30 min，無菌毛細吸管吸取分離液中間白膜層，5×PBS重懸細胞，離心后再用含2%FBS的EBM-2培養(yǎng)基重懸，按105個/cm2標準接種于培養(yǎng)板中，24 h后將未貼壁的細胞懸液轉(zhuǎn)入預(yù)先用FN（50 mg/L）包被的6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察。7～10 d后，待細胞融合80%后，采用膠原酶Ⅰ消化后傳代培養(yǎng)。對培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞觀察其生長狀態(tài)，分別在4、7、10、14 d照相并記錄。對新分離的骨髓單核細胞進行滴片，于第4、7、10、14天取生長良好的原代細胞，重懸于PBS中，分別與EPCs細胞表面標志物CD133、CD34、VEGFR-2結(jié)合，再行FITC染色，DAPI復(fù)染，檢測上述標志物陽性表達的細胞。

1.2.2 黃芪提取物對EPCs黏附的影響提前用FN（50 mg/L）包被細胞培養(yǎng)板，每孔接種5×104個EPCs，培養(yǎng)過夜，形成單皮層后轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h，用鈣黃綠素標記EPCs后制備單細胞懸液，37℃下孵育30 min。實驗設(shè)4組：對照組和不同濃度（10-4、10-3、10-2g/L）黃芪提取物組。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。各組干預(yù)后，在37℃、5%CO2孵箱中孵育30 min，用PBS輕輕沖洗細胞，去除未黏附細胞，倒置顯微鏡（×100）下，隨機取6個視野拍照，計數(shù)黏附細胞個數(shù)，取平均值。

1.2.3 黃芪提取物對EPCs遷移的影響用8 μm孔徑的24孔transwell進行遷移實驗，先分別在細胞小室的上、下室加入50 mg/L的FN包被液，再注入含2%FBS的EBM-2培養(yǎng)基。然后在上室按照2×104個/孔的密度接種EPCs，在下層分別加入10-4、10-3、10-2g/L黃芪提取物，對照組加入等量EBM-2；每組設(shè)置3個重復(fù)。培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，2%多聚甲醛固定，Giemsa染色，倒置顯微鏡（×100）下隨機取6個視野，計數(shù)遷移過膜的細胞數(shù)量，取平均值。

1.2.4 MTT法檢測黃芪提取物對EPCs活力的影響將EPCs用含2%FBS的EBM-2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，104個/孔加入96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用MTT法檢測EPCs的活力。具體如下：各組細胞分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入5 g/L的MTT孵育4 h后，棄去上清，加入DMSO，震蕩10 min后，490 nm處讀取光密度（OD）值，每組設(shè)8個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 黃芪提取物對EPCs血管形成能力的影響將EPCs用含2%FBS的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，5×104個/孔加入Matrigel-Matrix預(yù)處理的48孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。培養(yǎng)72 h后，倒置顯微鏡（×40）下觀察各組管狀結(jié)構(gòu)，隨機取6個視野照相，用Nikon NIS-Elements Software BR分析軟件測量血管長度（mm），取其平均值。

1.2.6 RT-PCR法檢測EPCs中eNOS mRNA的表達將EPCs用含2%FBS的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，105個/孔加入6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，Trizol法提取EPCs總RNA，根據(jù)Genebank序列，分別設(shè)計eNOS的上下游引物為5′-CTGCTGCCCCA?GATATCTTC-3′和5′-CAGGTACTGCAGTCCCTCCT-3′，產(chǎn)物長度為230 bp。采用RT-PCR法檢測EPCs中eNOS mRNA的表達。具體如下：每組細胞取2 μg總RNA，根據(jù)試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取2 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行普通PCR，94℃1 min；95℃30 s，54℃1 min，72℃1 min，30個循環(huán)，72℃延伸2 min。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。取反應(yīng)產(chǎn)物10 μg進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后Alpha View SA軟件攝圖，并分析eNOS與β-actin基因的灰度比值。

1.2.7 Western blot法檢測EPCs中eNOS蛋白的表達細胞培養(yǎng)實驗設(shè)計同1.2.6，采用Western blot法檢測EPCs中eNOS蛋白的表達。具體如下：應(yīng)用Next Advance Bullet Blender Storm組織細胞破碎儀將EPCs打碎，勻漿，4℃下12 000×g離心2 min，提取組織總蛋白后Bradford法測定蛋白濃度，取其中20 μg蛋白進行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后洗膜，標記1∶250稀釋的eNOS一抗，4℃過夜，洗膜，與辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋）孵育1 h后TBST洗膜，沖洗后暗室曝光顯影。同時以β-actin蛋白表達水平作為內(nèi)參對照。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。膠片經(jīng)成像分析系統(tǒng)掃描，并應(yīng)用AlphaView SA軟件分析各樣本與β-actin蛋白灰度的比值，記錄蛋白相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以表示，同一時點多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；不同時點多組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的鑒定EPCs結(jié)合FITC后呈現(xiàn)綠色，DAPI復(fù)染后胞核呈藍色。EPCs呈卵圓形、紡錘形或者不規(guī)則狀，CD133、CD34、VEGFR-2表達陽性，見圖1。

2.2 黃芪提取物對EPCs黏附、遷移能力的影響與對照組相比，不同濃度黃芪提取物組促EPCs黏附、遷移的能力均顯著增強，且呈濃度依賴性（F黏附= 15.256，F(xiàn)遷移=13.633，均P＜0.05），見圖2。

Fig.2Effect of astragalus extracts on migration and adherence in EPCs圖2 黃芪提取物對EPCs黏附、遷移能力的影響

2.3 黃芪提取物對EPCs活力的影響（1）組內(nèi)不同時點比較。各組不同時點OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F時間=9.755）。與對照組相比，不同濃度黃芪提取物組OD值均隨時間變化呈增長趨勢（F值分別為5.324、9.626、11.172，均P＜0.05）。（2）各時點組間比較。各組間OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F組間=10.018）。與對照組相比，各時點10-4、10-3、10-2g/L黃芪提取物組OD值均明顯升高，呈濃度依賴性（F值分別為4.134、8.724、12.528，均P＜0.05）。組間和處理時間之間存在交互效應(yīng)（F交互=13.473，P＜0.05），見圖3。

Fig.3Effect of astragalus extracts on Viability in EPCs圖3 黃芪提取物對EPCs活力的影響

2.4 黃芪提取物對EPCs血管形成能力的影響與對照組相比，不同濃度黃芪提取物組促EPCs的血管形成能力均明顯增強，且呈濃度依賴性（F= 97.549，P＜0.05），見圖4。

Fig.4Effect of astragalus extracts on microvascular formation in EPCs圖4 黃芪提取物對EPCs血管形成能力的影響

2.5 黃芪提取物對EPCs中eNOS mRNA轉(zhuǎn)錄表達的影響與對照組相比，不同濃度黃芪提取物組EPCs中eNOS mRNA的表達水平均明顯升高，且呈濃度依賴性（F=56.356，P＜0.05），見圖5。

Fig.5Effect of astragalus extracts on mRNA transcription level of eNOS in EPCs圖5 黃芪提取物對EPCs中eNOS mRNA轉(zhuǎn)錄表達的影響

2.6 黃芪提取物對EPCs中eNOS蛋白表達的影響與對照組相比，不同濃度黃芪提取物組EPCs中eNOS蛋白的表達水平均明顯升高，且呈濃度依賴性（F=77.125，P＜0.05），見圖6。

Fig.6Effect of astragalus extracts on protein expression levels of eNOS in EPCs圖6 黃芪提取物對EPCs中eNOS蛋白表達的影響

3 討論

EPCs的黏附和遷移是EPCs從骨髓中動員并進入循環(huán)，再進入損傷部位分化為血管內(nèi)皮細胞，進而形成微血管的初始關(guān)鍵步驟和必要條件之一［1］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，黃芪提取物可顯著促進EPCs的黏附和遷移，且呈濃度依賴性。這可能與黃芪提取物活化細胞間黏附分子l（intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1）和血管細胞黏附分子l（vascular cell adhesion molecule l,VCAM-1）的作用密切相關(guān)，ICAM-1和VCAM-1可介導(dǎo)EPCs之間的黏附、趨化因子誘導(dǎo)的EPCs跨內(nèi)皮的遷移［5］。EPCs增殖過程中的活細胞百分比反映EPCs的活力，決定著EPCs被誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細胞的效率。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，黃芪提取物可顯著增加EPCs的活力，且呈時間和濃度依賴性，提示黃芪提取物可明顯提升EPCs分化為血管內(nèi)皮細胞的效率。另外，黃芪提取物可提升EPCs誘導(dǎo)分化血管的長度，這可能與其提升EPCs誘導(dǎo)生成多種生長因子的作用密切相關(guān)，如促進VEGF、基質(zhì)細胞衍生因子-1、胰島素樣生長因子-1、血小板衍生生長因子等的生成增多，以上生長因子聯(lián)合發(fā)揮作用，在血管新生的進程中扮演著重要角色［6-7］。綜合以上結(jié)果，黃芪提取物可以明顯提升EPCs的黏附、遷移、活力以及血管形成能力，這對于誘導(dǎo)EPCs在缺血受損組織區(qū)域內(nèi)分化為微血管，進而促進缺血性組織損傷的修復(fù)發(fā)揮著重要的作用。

新生的血管能否保持穩(wěn)態(tài)、避免轉(zhuǎn)化為老化的肉芽組織并發(fā)育為成熟的血管組織對于有效的微循環(huán)形成起著決定性的作用。eNOS及其產(chǎn)物NO在微血管循環(huán)的穩(wěn)態(tài)維持中扮演著重要的角色，并調(diào)控著血壓水平、血管的緊張度，而且發(fā)揮著重要的抗炎、抗氧化、抗血栓形成效應(yīng)［8］。有研究證實eNOS的轉(zhuǎn)錄上調(diào)可以顯著升高EPCs的表達水平［9］。本研究結(jié)果顯示，黃芪提取物可上調(diào)eNOS的mRNA和蛋白表達水平，且呈濃度依賴性，提示黃芪提取物不僅可以誘導(dǎo)EPCs分化為新生的微血管，而且可以促進新生的微血管發(fā)育成熟，從而為缺血受損組織提供有效的微循環(huán)，實現(xiàn)真正意義上的血管新生。

（圖1見插頁）

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（2015-04-21收稿 2015-07-16修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effect of astragalus extracts on bone marrow-derived endothelial progenitor cells in rats

LIU Nuan,MAO Bingyu,YANG Lei△,XU Guochang,YE Songshan,ZHANG Peihua,ZHANG Lifang
Medical Experimental Center，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China△

ObjectiveTo explore the effect of astragalus extracts on adherence,migration,cell viability,microvascular formation,and eNOS expression in bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）of rats.MethodsEPCs were cultured,isolated and identified in vitro and divided into four groups:low titer group（10-4g/L of astragalus extracts）,middle titer group（10-3g/L of astragalus extracts）,high titer group（10-2g/L of astragalus extracts）and control group.The effects of astragalus extract on adhesion,migration or microvascular formation were observed under the inverted microscope and com?pared between all groups；Cell viability was detected by MTT assay；mRNA transcription and protein expression levels of en?dothelial nitric oxide synthase（eNOS）in EPCs were detected by reverse transcription PCR（RT-PCR）and Western blot re?spectively.ResultsCompared with the control group,cell adhesion,migration and microvascular formation of EPCs all en?hanced with addition of astragalus extracts in a dose dependent manner（F=15.256,13.633,97.549 respectively,and P＜0.05 in all cases）；Cell vitality of EPCs increased with administration of astragalus extracts in a time and dose dependant manner.（F=9.755 for time and F=10.18 for dose）.mRNA transcription and protein expression of eNOS in EPCs were up-reg?ulated with addition of astragalus extracts in a dose dependent manner（F=56.356 and 77.125 respectively,and P＜0.05 in both cases）.ConclusionAstragalus extracts play important role in angiogenesis in EPCs probably through up-regulating expressions of eNOS.

Astragalus membranaceus；myeloid progenitor cells；cell adhesion；cell movement；endothelial progenitor cells；angiogenesis；endothelial nitric oxide synthase

R322.11；R322.12

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.002

國家自然科學(xué)基金資助項目（81473438，81202791，81173372）；河南省中醫(yī)內(nèi)科學(xué)重點學(xué)科支撐課題（豫教高［2012］186號）

南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心（郵編473004）

劉暖（1987），醫(yī)學(xué)碩士，助教，主要從事心血管疾病發(fā)病機制研究

△通訊作者E-mail:yanglei200609@126.com