Cu2+修飾低固載量固定化漆酶的活性研究*

孫丹丹，宋守欣，王紅霞

（功能材料的設(shè)計(jì)合成與綠色催化黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025）

Cu2+修飾低固載量固定化漆酶的活性研究*

孫丹丹，宋守欣，王紅霞

（功能材料的設(shè)計(jì)合成與綠色催化黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025）

由于漆酶這種生物蛋白酶有容易變性失活且不可重復(fù)使用的特性,限制了漆酶的應(yīng)用和發(fā)展。因此如何提高漆酶的活性，穩(wěn)定性以及重復(fù)使用性尤為重要。本文采用交叉偶聯(lián)技術(shù),將漆酶固定在具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性納米粒子Fe3O4/SiO2上,并研究了用Cu2+修飾后的低固載量固定化漆酶的活性變化以及修飾后固定化漆酶的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Cu2+修飾后的低固載量固定化漆酶的相對活性提高了54%；而且在溫度不太高的情況下，修飾后的低固載量固定化漆酶的相對活性優(yōu)于修飾前的固定化漆酶；修飾后的固定化漆酶降解濃度為10mg·L-1的普施安染料，重復(fù)利用13次后降解率仍然可以達(dá)到92%。

固定化漆酶；銅離子；活性；穩(wěn)定性

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它能催化大量的酚類和芳香胺類化合物[1]。游離的漆酶不易回收利用，且穩(wěn)定性較低，容易變性失活，而酶固定化技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)漆酶的重復(fù)使用并改善其穩(wěn)定性，所以漆酶的固定化研究引起了人們的廣泛關(guān)注，而固定化漆酶的載體的選擇就變得至關(guān)重要[2]。由于磁性載體固定化酶在磁場作用下可從反應(yīng)體系中迅速分離，有利于回收和反復(fù)使用、降低成本的特點(diǎn)[3-5]，近年來，用磁性載體在漆酶固定化技術(shù)中越來越受到重視。Jun Ge[6]等人發(fā)現(xiàn)將含有Cu2+的無機(jī)物與有機(jī)物混合，通過相互作用形成尺寸不一樣大的具有花瓣形狀的納米花，這種含銅的納米花漆酶與游離漆酶相比催化活性和穩(wěn)定性都有所提高。本課題組以戊二醛為交聯(lián)劑，將漆酶穩(wěn)定固載到氨基修飾的磁性載體Fe3O4/SiO2納米粒子上，進(jìn)行固定化漆酶對酚類偶氮染料的降解研究，研究發(fā)現(xiàn)，在不使用氧化還原介體的情況下，這種固定化漆酶在1h內(nèi)對偶氮染料的脫色率達(dá)80%以上并且重復(fù)利用10次后脫色率仍能達(dá)到80%左右[3]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，用120mM的Cu2+對以Fe3O4/SiO2為載體的固定化漆酶進(jìn)行修飾，考察當(dāng)載體質(zhì)量為50mg，低固載量時（26mg·g-1）固定化漆酶相對活性的變化，并對修飾后固定化漆酶的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

FeCl2·4H2O；FeCl·36H2O；正硅酸乙酯（TEOS）；異丙醇；漆酶（Sigma-Aldrich）；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS）；戊二醛（天津市科密歐化學(xué)試劑中心）。普施安（PR，Sigma-Aldrich）；HAc。

Lambda45型紫外分光光度計(jì)（美國PerkinElmer公司）；JSM-6610型掃描電鏡。

1.2 固定化漆酶制備

本實(shí)驗(yàn)是取質(zhì)量為50mg的Fe3O4/SiO2載體溶解在乙醇中，超聲10min，加入APS，將兩溶液混合在一起，靜置40min，將混合物在室溫下攪拌12h，反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水洗滌除去未反應(yīng)的APS。磁性分離后得到氨基修飾的磁性SiO2粒子，標(biāo)記為Fe3O4/SiO2-NH2。

向處理完的載體中加入2.5%戊二醛，25℃下攪拌3h，得到交聯(lián)的復(fù)合粒子，標(biāo)記為Fe3O4/SiO2-NH2-GA，用PBS洗滌數(shù)遍，然后向載體中加入濃度為0.2mg·mL-1的漆酶溶液，室溫?cái)嚢?2h,過量的漆酶用磷酸緩沖液洗滌直至用ABTS檢測不到殘留的漆酶，由此得到固定化漆酶，標(biāo)記為Fe3O4/SiO2-NH2-GA-E，保存在PBS中，放入4℃的冰箱中，備用。

1.3 固定化漆酶的修飾

將固定化漆酶從冰箱中取出，磁分，將上清液倒入水槽中，加入10mLPBS溶液，取濃度為100，120，140mM的CuSO4溶液各4mL分別加入上述體系中，得到修飾后的固定化漆酶，連續(xù)測試6d。

1.4Cu2+修飾后固定化漆酶相對活性的測定

酶活力（enzymeactivity）也稱酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。反應(yīng)在25℃下進(jìn)行，在總反應(yīng)體積8mL中，含有2mL1mmol ABTS，6mLHAc緩沖液（pH=5.0）。添加到固定化漆酶溶液中啟動反應(yīng),5min后在波長為420 nm下測定其吸光度值的變化[2,7]相對酶活的計(jì)算公式：

R=Ai/Af×100%

式中Ai：固定化漆酶的初始活性；Af：加入Cu2+后固定化漆酶的活性。兩者相比，以Ai初始活性為100%則結(jié)果就是加入Cu2+后對活性影響的一個相對值變化。

1.5 固定化漆酶修飾前后操作穩(wěn)定性研究

為考察Cu2+修飾后的固定化漆酶的操作穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)取6份相同的固定化漆酶，固載量均為26mg·g-1，3份用120mMCu2+修飾，3份用于對比實(shí)驗(yàn)，在最適溫度下用于固定化漆酶降解偶氮染料普施安重復(fù)利用的平行實(shí)驗(yàn)。取修飾前后的固定化漆酶，用PBS溶液洗1～2遍，除去殘留的Cu2+，最后將洗液倒掉，取濃度10mg·L-1的普施安染料15mL，15mLPBS溶液加入到固定化漆酶的燒杯中攪拌，每隔20min用紫外分光光度計(jì)測量吸光度的變化。

普施安脫色率根據(jù)Lambert-Beer定律計(jì)算：

式中C0、C、A0、A分別表示PR溶液的初始濃度、脫色后濃度、初始吸光度、脫色后的吸光度。

1.6 固定化漆酶修飾前后熱穩(wěn)定性的研究

載體質(zhì)量為50mg的固定化漆酶與修飾后的固定化漆酶，測試溫度從20℃到70℃。在不同溫度下放置30min測定漆酶的吸光度變化值然后根據(jù)公式（1.4）來計(jì)算固定化漆酶的相對活性，以在室溫時的相對活性為100%。

2 結(jié)果與討論

2.1Cu2+修飾后固定化漆酶相對活性的影響

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,對于漆酶來源不同，銅的含量也不同，一般含有4個Cu2+，目前，已證實(shí)Cu2+是漆酶的活性部位[8，9]，所以Cu2+的加入是否會對漆酶活性有進(jìn)一步的提高呢？本實(shí)驗(yàn)用不同Cu2+濃度對固定化漆酶進(jìn)行修飾，然后對其活性進(jìn)行測試，結(jié)果顯示固定化漆酶的相對活性有明顯提高。

圖1 是在漆酶固載量為26mg·g-1時不同Cu2+濃度對固定化漆酶活性的影響。

圖1 Cu濃度對固定化漆酶相對活性的影響（Cinitial laccase=0.2mg·mL-1）Fig.1Effect of Cu2+concentration on the relative activity of immobilized laccase

從圖1中可以看到，當(dāng)Cu2+濃度為120mM時對漆酶活性影響最大[6]，相對活性可以達(dá)到154%。

2.2 Cu2+修飾后固定化漆酶的穩(wěn)定性研究

2.2 .1 固定化漆酶的熱穩(wěn)定性研究漆酶是一種蛋白酶，在較高溫度時不可避免發(fā)生失活行為，漆酶的熱穩(wěn)定性差已經(jīng)成為限制其在較高溫度下發(fā)展應(yīng)用的重要瓶頸，因此，研究漆酶的熱穩(wěn)定性及如何提高漆酶的熱穩(wěn)定性具有極為重要的意義。圖2是在不同溫度下對修飾前后的固定化漆酶進(jìn)行熱處理，得到不同溫度下相對活性的曲線。

圖2 溫度對Cu2+修飾前后的固定化漆酶相對活性的影響（pH=7.0磷酸緩沖溶液）Fig.2Effect of temperature on the relative activity of the immobilized laccase before and after modification with Cu2+in the phosphate buffer at pH=7.0

從圖2中可以看到，25℃時為固定化漆酶的最適溫度，將最適溫度下的活性定義為100%。而且隨著溫度的升高，修飾前后的固定化漆酶相對活性都呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)溫度達(dá)到50℃以上時，Cu2+修飾后的固定化漆酶的相對活性下降較快，70℃時的相對活性達(dá)到60%左右[10]。而在25～45℃之間，Cu2+修飾后的固定化漆酶的相對活性下降較慢，而且活性高于修飾前活性。由此說明，Cu2+修飾后的固定化漆酶在溫度不太高的情況下，能夠保持較高的活性。

2.2.2Cu2+修飾后固定化漆酶的操作穩(wěn)定性研究

圖3 Cu2+修飾后固定化漆酶操作穩(wěn)定性（10mg·L-1PR，pH=7.0 25℃）Fig.3Repeated use of immobilized laccase before and after Cu2+modification for the decoloration of 10mg·L-1of PR solution at 25℃in the phosphate buffer solution

從圖3中可以看出，未用Cu2+修飾的固定化漆酶降解第一份10mg·L-1普施安之后，殘留濃度最小大概在0.5%左右，隨著使用次數(shù)的不斷增多，10 mg·L-1的普施安的殘留濃度逐漸增大，第13個循環(huán)時達(dá)到14%。而用銅離子修飾后的固定化漆酶在重復(fù)使用13次之后，普施安的殘留濃度更低，只有8%左右，可見，修飾后的固定化漆酶在經(jīng)過多次循環(huán)使用后，操作穩(wěn)定性要優(yōu)于未經(jīng)Cu2+修飾的固定化漆酶，在第13個循環(huán)時降解率仍能達(dá)到92%。

2.3Cu2+修飾后固定化漆酶的SEM分析

圖4120mM Cu2+修飾固定化漆酶的SEM圖，修飾（a）1d（b）3d（c）5dFig.4SEM micrographs of immobilized laccase modified with 120mM Cu2+for（a）1 day（b）3 days and（c）5 days

圖4 是120mM Cu2+修飾固定化漆酶SEM照片，（a）為修飾1d的形貌，我們可以看到固定化漆酶成層疊狀，一些片狀結(jié)構(gòu)隱約可見。修飾3d時，已經(jīng)初步有花狀形成，片狀結(jié)構(gòu)越來越多，越緊密，越來越立體。修飾5d時，我們可以清晰的看到納米花結(jié)構(gòu)的形成。在JunGe[6]的文獻(xiàn)中，他們也報(bào)道了銅離子修飾后的固定化漆酶呈現(xiàn)納米花的機(jī)構(gòu)，我們這里的結(jié)果和他們一致而且對照修飾后的固定化漆酶活性數(shù)據(jù)，固定化漆酶是在銅離子修飾5d時活性最高。Jun Ge等人認(rèn)為相對較高的活性與漆酶這種納米花結(jié)構(gòu)有關(guān)，漆酶的比表面積增大，吸附能力增加，導(dǎo)致漆酶對底物的脫色能力增強(qiáng)[6]。我們推斷固定化漆酶活性提高與漆酶的形貌變化有關(guān)，但不完全是漆酶形貌變化導(dǎo)致比表面積增加的原因，因?yàn)檫@種染料是無法被游離漆酶降解的，所以單純的漆酶比表面增加無法使該偶氮染料降解，恰恰是在漆酶固載在Fe3O4/SiO2載體上[3]，才能使這種染料得到快速降解，因此Cu2+的加入很有可能改變或誘導(dǎo)漆酶的活性位發(fā)生變化，確切的原因?qū)⒆鲞M(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

本文對低固載量的固定化漆酶進(jìn)行Cu2+修飾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：120mMCu2+的修飾低固載量（26mg· g-1）的固定化漆酶，漆酶的活性有明顯提高，提高了54%。因此，可以利用這一方法制備低固載量的漆酶，獲得較高的活性。修飾后的固定化漆酶的熱穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性研究結(jié)果表明：Cu2+修飾后的固定化漆酶，在溫度不太高的情況下，其相對活性優(yōu)于Cu2+修飾前的固定化漆酶；修飾后的固定化漆酶，降解10mg·L-1的普施安染料，重復(fù)利用13次后降解率仍然可以達(dá)到92%，穩(wěn)定性優(yōu)于Cu2+修飾前的固定化漆酶。

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Research on activity of immobilized laccase with lower laccase loading after Cu2+modification*

SUN Dan-dan，SONG Shou-xin，WANG Hong-xia
（Key Laboratory of Heilongjiang Province for Design and Synthesis of Functional Materials and Green Catalytic,College of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Normal University,Harbin 150025，China）

Laccase is a kind of biological protease,however,the easy denaturation and difficult separation for reuse limit the application and development of laccase.So,how to improve the activity stability of laccase and repeatability is particularly important.In this paper,laccase was immobilized on magnetic Fe3O4/SiO2nanoparticles through cross-coupling method to further investigate the modification of immobilized laccase with lower laccase loading by Cu2+and the corresponding activity as well as the stability of immobilized laccase after modification with Cu2+ions.The results show that the relative activity of the immobilized laccase with lower laccase loading after Cu2+modification increased by 54%,and the relative activity at lower temperature was better than that before modification with Cu2+ions;The modified immobilized laccase can be reused for the degradation of the procion dyes solution with a concentration of 10mg·L-1.,even 13 cycles later,the decolorization percentage is still up to 92%.

immobilized laccase；copper ions；active；stability

Q814.9

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150314

2015-01-13

黑龍江省自然科學(xué)基金（No.B201011）

孫丹丹（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：催化化學(xué)。

導(dǎo)師簡介：王紅霞（1974-），女，教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事多孔材料、Fe3O4/SiO2基負(fù)載型催化劑的設(shè)計(jì)、制備及甲烷轉(zhuǎn)化、有機(jī)污染物的去除等催化反應(yīng)的研究。