丹參酮ⅡA對(duì)慢性心力衰竭心肌重構(gòu)的影響及其機(jī)制研究*

馮　俊　陳華文　李樹生

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430030）

·研究報(bào)告·

丹參酮ⅡA對(duì)慢性心力衰竭心肌重構(gòu)的影響及其機(jī)制研究*

馮俊陳華文李樹生

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430030）

目的觀察丹參酮ⅡA通過調(diào)控mir-133水平對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌重構(gòu)的影響。方法SD大鼠行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立心力衰竭模型，給予連續(xù)12周的丹參酮ⅡA治療，miR-133拮抗劑組同時(shí)給與皮下植入滲透泵持續(xù)泵入拮抗劑antagomirs；分析12周后大鼠心肌心臟及左心室質(zhì)量指數(shù)、凋亡指數(shù)、膠原含量及caspase-9、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、RhoA蛋白水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，手術(shù)組心臟及左心室質(zhì)量指數(shù)、凋亡指數(shù)和膠原含量增加（P＜0.05），caspase-9、CTGF、RhoA蛋白水平表達(dá)上升（P＜0.05）；丹參酮ⅡA處理組大鼠各指標(biāo)均有改善（P＜0.05）；皮下連續(xù)泵入antagomirs能夠部分消除丹參酮ⅡA的抗心肌重構(gòu)作用（P＜0.05）。結(jié)論丹參酮ⅡA可能通過上調(diào)miR-133水平，從而調(diào)控caspase-9、CTGF、RhoA蛋白水平的表達(dá)發(fā)揮抗心肌重構(gòu)的作用。

丹參酮ⅡAmir-133心力衰竭心肌重構(gòu)

心室肌重構(gòu)是心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，隨著心室肌組織重構(gòu)的發(fā)生及發(fā)展，最終導(dǎo)致心肌缺血、心律失常和猝死［1］。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的主要成分丹參酮ⅡA具有抗心室肌重構(gòu)的作用［2-4］；最近研究發(fā)現(xiàn)，mir-133可調(diào)節(jié)相關(guān)因子如caspase-9［5］、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）［6］、RhoA等［7］表達(dá)實(shí)現(xiàn)抗心肌重構(gòu)的作用；筆者的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可以升高心力衰竭大鼠下降的mir-133 mRNA水平［8］。本實(shí)驗(yàn)研究丹參酮對(duì)mir-133的靶基因caspase-9、CTGF、RhoA等的影響，進(jìn)一步探討丹參酮ⅡA此作用的可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物健康成年雄性SD大鼠40只，月齡2個(gè)月，體質(zhì)量250～300 g，同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2試劑與儀器丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，上海第一生化藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；國(guó)產(chǎn)分析純，武漢康盛醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品。

1.3分組與造模將SD大鼠隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組（Sham組）、手術(shù)組（Model組）、丹參酮ⅡA組（Model+ TanⅡA組）、miR-133抑制劑處理組（Model+TanⅡA+antagomirs組），每組10只，4組大鼠均于同一環(huán)境下飼養(yǎng)。采用腹主動(dòng)脈縮窄法（AAC）構(gòu)建慢性心力衰竭大鼠模型，10%水合氯醛（0.3 mL/kg）腹腔麻醉，仰位固定，腹部常規(guī)備毛、消毒，于腹中線開腹處理，暴露分離腹主動(dòng)脈，8號(hào)針頭平行置于腹主動(dòng)脈旁后采用手術(shù)縫線（4－0）將兩者結(jié)扎，隨后抽出針頭關(guān)閉腹腔。術(shù)后腹腔注射青霉素抗感染。假手術(shù)組只分離腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎。正常喂養(yǎng)4周。從第5周開始，丹參酮ⅡA組給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液［1 mL/（kg·d）］連續(xù)12周灌胃，其余兩組均給予等容積0.9%氯化鈉注射液，此外，miR-133抑制劑處理組還于皮下植入滲透泵持續(xù)泵入antagomirs（0.6 μmol/L）。

1.4觀察指標(biāo)心臟指數(shù)（HWI）及左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI），靜脈注射過量的氯化鉀可使心臟止于收縮期，迅速取出心臟稱重，并分離大血管、心房及右心室，用預(yù)冷的PBS液充分沖洗，濾紙吸干，稱量左心室（包括室間隔）的濕重，以心臟（mg）與體質(zhì)量（g）之比作為HWI，左室質(zhì)量（mg）與體質(zhì)量（g）之比作為L(zhǎng)VMI。Masson染色觀察心室肌膠原變化情況，將左心室中部冠狀切面的心肌組織用4%多聚甲醛固定后制備成石蠟包埋切片（5 μm），脫蠟至水，按照Masson試劑盒指示方法進(jìn)行染色，膠原纖維呈藍(lán)色，心肌纖維呈紅色，胞核黑藍(lán)色。觀察心肌膠原纖維含量變化。TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。大鼠處死后取出左心室，依次4%福爾馬林固定、梯度酒精脫水、石蠟包埋和切片（5 μm），按照TUNEL試劑盒提供的步驟進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野的染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例計(jì)為凋亡指數(shù)。caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平表達(dá)，采用western bolt法檢測(cè)心肌caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平，取大鼠心肌組織100 mg，提取總蛋白，依次加入上樣緩沖液煮沸變性、10%SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、一抗（caspase-9、CTGF、RhoA）孵育過夜，二抗孵育后進(jìn)行ECL顯示處理；Gel-Pro analyzer分析caspase-9、CTGF、RhoA的光密度，以β-actin作為內(nèi)參照對(duì)比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對(duì)含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)測(cè)定結(jié)果比較見表1。與Sham組比較，Model組的HWI和LVMI均顯著升高（P＜0.05）。TanⅡA處理后HWI和LVMI均明顯降低（P＜0.05），說明TanⅡA可抑制左心室重構(gòu)，而Model+ TanⅡA+antagomirs組的HWI和LVMI較Model+TanⅡA組上升（P＜0.05），說明antagomirs可部分抵消TanⅡA抑制左心室重構(gòu)。

表1　各組心臟指數(shù)和左心室指數(shù)結(jié)果比較（mg/g，）

表1　各組心臟指數(shù)和左心室指數(shù)結(jié)果比較（mg/g，）

與Sham組比較，△P＜0.05；與Model組比較，*P＜0.05；與Model+TanⅡA組比較，▲P＜0.05，下同。

組別nHWILVWI Sham組102.62±0.052.07±0.04 Model組103.24±0.15△2.77±0.13△Model+TanⅡA組102.76±0.08*2.15±0.03*Model+TanⅡA+antagomirs組103.15±0.12△▲2.68±0.08△▲

2.2各組Masson染色觀察心肌膠原含量變化比較

見圖1。正常心肌細(xì)胞呈紅色，膠原呈綠色。Sham組心肌間隙可見少量膠原纖維，排列整齊；Model組大鼠心肌間隙見大量膠原堆積，并有微瘢痕形成，心肌纖維排列紊亂，間質(zhì)膠原纖維增生，以血管周圍為明顯，非血管區(qū)膠原纖維增生程度比血管周圍輕；Model+TanⅡA組可見不同程度膠原沉積于細(xì)胞間質(zhì)，膠原纖維排列紊亂，間質(zhì)纖維增生，以血管周圍為明顯，但總體膠原纖維增生程度較Model組明顯減輕。Model+TanⅡA+ antagomirs組膠原纖維增生程度較Model+TanⅡA組明顯。

圖1　各組大鼠心肌心肌膠原含量變化

2.3各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較見表2和圖2。與Sham組比較，Model組凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.05），而TanⅡA可以降低慢性心力衰竭大鼠心肌凋亡指數(shù)（P＜0.05）；皮下泵入antagomirs可部分拮抗TanⅡA的作用（P＜0.05）。

2.4Caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平表達(dá)見表3和圖3。與Sham組比較，Model組心肌細(xì)胞的caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平上升（P＜0.05），TanⅡA可使三者的蛋白水平降低，Model+TanⅡA組與Model組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；皮下連續(xù)泵入antagomirs能夠部分消除TanⅡA的作用，使caspase-9、CTGF、RhoA蛋白水平上升（P＜0.05）。

表2　各組大鼠心臟凋亡指數(shù)比較（）

表2　各組大鼠心臟凋亡指數(shù)比較（）

組別n凋亡指數(shù)Sham組100.05±0.01 Model組100.44±0.03△Model+TanⅡA組100.06±0.01*Model+TanⅡA+antagomirs組100.35±0.02△*▲

圖2　各組大鼠心肌心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

表3　各組心臟caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平比較（）

表3　各組心臟caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平比較（）

組別nCaspase-9CTGFRhoA Sham組101.00±0.00 Model組102.21±0.19△Model+TanⅡA組101.36±0.08*1.00±0.001.00±0.00 2.01±0.12△2.18±0.19△1.26±0.12*1.27±0.09*Model+TanⅡA+antagomirs組101.78±0.12△*▲1.66±0.08△*▲1.83±0.18△*▲

圖3　各組大鼠心肌心肌caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白水平水平比較

3　討論

丹參酮ⅡA是丹參乙醚提取物中的脂溶性有效成分。研究表明其具有抗心室重構(gòu)的作用，治療各種原因?qū)е碌穆孕牧λソ撸苊黠@改善心功能［9］。

本實(shí)驗(yàn)用腹主動(dòng)脈縮窄法建立慢性心力衰竭大鼠模型，發(fā)現(xiàn)手術(shù)組術(shù)后左心室質(zhì)量指數(shù)和凋亡指數(shù)明顯升高，Masson染色顯示大量心肌膠原沉積，間質(zhì)膠原纖維增生。給予丹參酮ⅡA處理后，和手術(shù)組相比，大鼠左心室肥厚指標(biāo)、凋亡指數(shù)以及心肌膠原含量等明顯改善，提示丹參酮ⅡA可抑制和逆緩左心室重構(gòu)。此外，在給予AAC大鼠丹參酮ⅡA處理的同時(shí)，皮下植入滲透泵連續(xù)泵入miR-133的抑制劑antagomirs以證明丹參酮ⅡA是否通過調(diào)控miR-133來(lái)抑制心力衰竭大鼠左心室重構(gòu)，經(jīng)antagomirs處理后，左心室肥厚指標(biāo)、凋亡指數(shù)以及心肌膠原含量變化情況較丹參酮ⅡA組惡化，表明antagomirs可以下調(diào)miR-133的表達(dá)從而部分消除丹參酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重構(gòu)的作用。

Caspase-9是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。在凋亡刺激下，細(xì)胞色素C以dATP的形式從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，和凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）和caspase-9形成凋亡復(fù)合體。凋亡復(fù)合體激活caspase-9，然后蛋白水解激活caspase-3，共同參與細(xì)胞凋亡［10］。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是保持心肌組織強(qiáng)度和功能完整性的必要物質(zhì)。高血壓和壓力負(fù)荷等病理刺激下，ECM蛋白質(zhì)在心臟過量積聚。CTGF是一種由細(xì)胞外基質(zhì)合成的分泌性蛋白，是一個(gè)重要的組織纖維化介質(zhì)，在心肌重塑過程中，心肌細(xì)胞也可分泌CTGF［11］。RhoA是小GTP-結(jié)合蛋白的成員之一，其最重要的功能是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，其次在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、膜泡運(yùn)輸?shù)冗^程中也起重要作用［20］。RhoA激酶依賴性通路也可通過收縮血管平滑肌細(xì)胞、作為G蛋白耦聯(lián)受體的下游目標(biāo)、激活心臟和全身腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性等途徑參與心力衰竭大鼠的腎血管收縮和心肌肥厚，并參與調(diào)節(jié)心臟形態(tài)的變化和基因表達(dá)的變化［12-13］。

本實(shí)驗(yàn)慢性心力衰竭模型組大鼠caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白表達(dá)水平上升，給予丹參酮ⅡA干預(yù)后caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白表達(dá)水平均明顯降低，提示丹參酮ⅡA可能通過抑制caspase-9、CTGF、RhoA的表達(dá)來(lái)抑制左心室重構(gòu)。此外，在給予模型大鼠丹參酮ⅡA處理的同時(shí)，給予miR-133的抑制劑干預(yù)后，caspase-9、CTGF、RhoA的蛋白表達(dá)水平明顯下降，表明antagomirs可以下調(diào)miR-133的表達(dá)從而部分消除丹參酮ⅡA的作用。以上證據(jù)表明，miR-133在丹參酮ⅡA抗心室重構(gòu)過程中發(fā)揮著重要的作用，而丹參酮ⅡA通過上調(diào)miR-133水平抗心室重構(gòu)的可能的途徑是通過miR-133來(lái)調(diào)控相關(guān)蛋白如caspase-9、CTGF、RhoA等的表達(dá)，進(jìn)而影響心室重構(gòu)。

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The Effect and Mechanism of TanshinoneⅡA on Myocardial Remodeling in Rats with Heart Failure

FENG Jun，CHEN Huawen，LI Shusheng.
Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College，HuaZhong University of Science and Technology，Hubei，Wuhan 430030，China

Objective：To investigate the effect of miR-133 on myocardial remodeling in rats with chronic heart failure induced by TanshinoneⅡA and its mechanism.Methods：The rats with heart failure were induced by Abdominal aortic constriction（AAC）.The TanⅡA injection was applied in the continuous twelve weeks，while part of the rats were subcutaneously implanted with osmotic pump to pump into the antagomirs（inhibition of miR-133）.Twelve weeks later，cardiac index，left ventricular mass index，apoptosis index，collagen content and the protein expression of caspase-9，CTGF and RhoA were Analysized.Results：Compared with Sham group，AAC operation could increase cardiac index，left ventricular mass index，apoptosis index and collagen content（P＜0.05），and enhance the protein expression of caspase-9，CTGF and RhoA（P＜0.05）；TanⅡA treatment on AAC rats could improve those items above with significant difference（P＜0.05）.Subcutaneous pumping of antagomirs could abolish these effects of TanⅡA.Conclusions：TanⅡA may resist the cardiac remodeling of the rats with heart failure by lift regulating miR-133 levels to regulate the protein expression of caspase-9，CTGF and RhoA.

TanshinoneⅡA；MiR-133；Heart failure rats；Cardiac remodeling

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2069-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.001

2015-08-12）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81202825）