貝那普利聯(lián)合低分子肝素對大鼠腎纖維化的作用研究

盧濤 朱春玲

（1.海口市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，海南 ?？?570000；2.貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 貴陽 550004）

腎間質(zhì)纖維化是指在各種致病因子作用下，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)蛋白合成增加，降解受抑制造成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的大量堆積導(dǎo)致的［1］。低分子肝素（LMWH）具有抑制腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生的作用及抗腎間質(zhì)纖維化作用［1］。本文通過觀察聯(lián)用貝那普利和LMWH 與單用貝那普利對轉(zhuǎn)化生長因子－β1（TGF－β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶－2（MMP－2）的表達(dá)和對腎組織結(jié)構(gòu)的影響，以探討藥物對腎間質(zhì)纖維化的作用效果，并為臨床治療提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗組動組物組雄組性SD組大組鼠72組只，2組個組月組齡組左右，體質(zhì)量150～200g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 鹽酸貝那普利片（商品名洛丁新，成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，批號070501），低分子肝素鈣注射液（商品名尤尼舒，海南通用同盟藥業(yè)有限公司，批號20060401，國藥準(zhǔn)字H20010300）。以下試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗鼠TGF－β1（編號BA0290），兔抗鼠MMP－2（編號BA2200），生物素標(biāo)記羊抗兔IgG（編號BA1003），鏈酶親和素－過氧化物酶復(fù)合物（編號SA1082），封閉用正常山羊血清（編號AR0009），DAB顯色劑（編號AR1022）。

1.3 動物造模 左側(cè)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)（UUO），建立UUO 模型。假手術(shù)組打開腹腔后即關(guān)閉腹腔。

1.4 分組 健康SD 大鼠72只，預(yù)養(yǎng)1周后，空腹12h，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、貝那普利組、貝那普利＋LMWH組，每組18只。貝那普利組術(shù)后給予貝那普利10 mg／（kg·d）灌胃，貝那普利＋LMWH組給予貝那普利10 mg／（kg·d）灌胃及LMWH 200IU／（kg·d）皮下注射。

1.5 標(biāo)本采集 乙醚麻醉后，腹部作縱形切口，分離出左腎，用生理鹽水反復(fù)灌洗至發(fā)白，摘除腎臟，剔除包膜，橫斷切取約0.5cm 柱狀體2 塊，置于4%多聚甲醛中固定12h，石蠟包埋，切片。HE 染色：常規(guī)制片觀察。Masson 染色：常規(guī)制片觀察。免疫組化：采用SABC法，常規(guī)制片觀察。

1.6 腎小管間質(zhì)損傷評分 在低倍鏡下（×200）依序單盲法觀察左上、右上、左下、右下、中間5個腎間質(zhì)視野，按腎小管間質(zhì)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)評分并計算各個評分的均值，得出腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。

1.7 免疫組化 TGF－β1 及MMP－2：細(xì)胞胞漿染上棕黃色為陽性細(xì)胞。在400倍光鏡（LEICA DM 1000）下目測5個病變比較明顯的視野并計數(shù)陽性細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果以陽性細(xì)胞數(shù)／HP×400表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用方差分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，多組間用單因數(shù)方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 假手術(shù)組：體質(zhì)量穩(wěn)定，精神狀況良好；模型組：精神逐漸萎靡、消瘦；貝那普利組及貝那普利＋LMWH組：懶動，體質(zhì)量稍減輕。

2.2 Masson 染色結(jié)果 假手術(shù)組：腎小管結(jié)構(gòu)正常；模型組：術(shù)后5d，小管間質(zhì)輕度增寬，少量炎性細(xì)胞浸潤及膠原沉積；術(shù)后10d，小管間質(zhì)中度增寬，小管結(jié)構(gòu)破壞，偶有管腔塌陷，炎性細(xì)胞浸潤，膠原成分增加；術(shù)后15d，小管間質(zhì)損傷程度明顯，3個時段比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。貝那普利組及貝那普利＋LMWH組均較同期模型組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)減低（P＜0.05）。貝那普利＋LMWH組較同期貝那普利組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)減低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)

2.3 TGF－β1 在各組的表達(dá)水平 假手術(shù)組水平最低，模型組水平最高（P＜0.05）。貝那普利組及貝那普利＋LMWH組均較模型組表達(dá)水平低（P＜0.05）。貝那普利＋LMWH組較貝那普利組表達(dá)水平低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)TGF－β1的表達(dá)

2.4 MMP－2的表達(dá)水平 假手術(shù)組水平最高，模型組水平最低（P＜0.05）。貝那普利組及貝那普利＋LMWH組均較模型組水平高（P＜0.05）。貝那普利＋LMWH組較貝那普利組水平高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腎小管間質(zhì)MMP－2的表達(dá)

3 討論

腎間質(zhì)纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展到后期的病理學(xué)特征，是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎功能衰竭的共同通路。腎間質(zhì)纖維化病變過程涉及細(xì)胞、細(xì)胞因子、ECM、生長因子及它們之間的相互作用［1］。在組調(diào)組節(jié)組因組子組中，TGF－β1組被組公組認(rèn)組為是最主要的前纖維化因子［2］。作為一種強(qiáng)效的致纖維化因子，TGF－β1在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)起作用。ECM 在腎間質(zhì)的過度沉積是引起腎間質(zhì)纖維化的主要原因，ECM 的降解由細(xì)胞外基質(zhì)降解酶系統(tǒng)介導(dǎo)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶／基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（MMPs／TIMPs）的表達(dá)與活性異常在其中發(fā)揮重要的作用。許多腎臟疾病可以激活腎局部腎素－血管緊張素系統(tǒng)使血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）分泌增多，進(jìn)而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。用ACEI能抑制Ang Ⅱ引起的腎臟纖維化及炎癥反應(yīng)，對腎臟具有較好的保護(hù)作用［3－4］。本實驗中模型組Masson染色顯示間質(zhì)膠原沉積加重，腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)升高，提示UUO 造模成功。模型組TGF－β1 表達(dá)漸增強(qiáng)而MMP－2表達(dá)漸減少。實驗顯示貝那普利組較同期模型組腎間質(zhì)損傷指數(shù)低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證實貝那普利有延緩腎間質(zhì)纖維化的作用。貝那普利＋LMWH組較同期貝那普利組腎間質(zhì)損傷指數(shù)減低（P＜0.05），提示在貝那普利使用的基礎(chǔ)上加用LMWH 會進(jìn)一步減輕腎間質(zhì)纖維化。關(guān)于在貝那普利使用的基礎(chǔ)上加用LMWH 會進(jìn)一步改善腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，有研究［5］顯示肝素通過抑制TGF－β1啟動子和防止核蛋白與調(diào)節(jié) 性AP－1 位 點組結(jié)組合，從組而組抑組制TGF－β1組表達(dá)。并且肝素可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶t－PA 活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，從而促進(jìn)ECM 的降解［6］。本實驗顯示貝那普利＋LMWH組較同期貝那普利組的TGF－β1表達(dá)水平減低、MMP－2表達(dá)水平升高（P＜0.05），提示在貝那普利使用的基礎(chǔ)上加用LMWH 改善腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制之一可能與LMWH組對UUO組模型中TGF－β1、MMP－2組的組表組達(dá)組水組平組的組調(diào)組節(jié)組有組關(guān)。關(guān)組于LMWH組對UUO組模型組中TGF－β1、MMP－2組具組體組調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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