RhoA相關信號通路的表達對COPD大鼠氣道重塑的影響

徐新毅 劉友琴 徐丹 楊義

﹙1.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003；2.貴州省人民政府機關門診部，貴州 貴陽 550004；3.貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽550002﹚

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）現(xiàn)已成為威脅全球公共健康的最常見的慢性疾病之一，COPD 患者肺部的主要病理變化是呼吸道持續(xù)性炎癥和不可逆的氣流阻塞［1］。氣道重塑則是導致氣流阻塞的重要原因，而氣道重塑主要表現(xiàn)為平滑肌細胞的增殖以及細胞外基質(zhì)蛋白過度沉積。有研究［2－3］表明，在重癥COPD 患者中還觀察到氣道平滑?。ˋSM）組織增生。Rho／ROCK 信號轉(zhuǎn)導通路介導了多種平滑肌與非平滑肌功能異常相關疾病的發(fā)生機制。而Rho家族蛋白有Rho（RhoA，RhoB 和RhoC）。Rho／ROCK 信號轉(zhuǎn)導通路參與支氣管哮喘氣道重塑，我們選取RhoA 基因為主要研究對象，通過RhoA 基因在COPD 大鼠肺組織的表達及地塞米松治療的干預，探討RhoA 基因及其相關通路對COPD 大鼠氣道重塑的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物分組及處理 60只SPF級雄性SD 大鼠（重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（渝）2012－0006），鼠齡8～9周，體質(zhì)量（200±10）g，分為正常對照組、COPD 模型組、地塞米松治療組各20只。

1.2 儀器及試藥 一抗兔抗大鼠（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）；二抗山羊抗兔（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）；ABI7500實時熒光定量PCR 儀。

1.3 COPD 大鼠模型制備及給藥COPD 模型組大鼠及地塞米松組大鼠選用市面出售的黃果樹牌過濾嘴香煙，按文獻［4］完成COPD 模型的制作，將大鼠分別置于自制的60cm×45cm×55cm 有機玻璃箱內(nèi)，箱頂部有4個2cm 的通氣孔，每個煙熏箱內(nèi)1次放置10只大鼠，于每天上午下午各煙熏1次，2次時間間隔至少6h，每次放置6只香煙，燃盡后更換香煙，持續(xù)30min，連續(xù)28d，COPD組及地塞米松治療組分別于第1天和第14天在氣管內(nèi)注射脂多糖，每次200μg／200μL，注射脂多糖當天不熏煙，正常對照組注入相同體積的0.9%氯化鈉溶液，地塞米松治療組從造模30d開始給予地塞米松注射劑1mg／（kg·d），腹腔注射，療程30d，30d后處死大鼠。

1.4 支氣管肺組織RhoA 蛋白含量的測定 60例標本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，切片，選用鏈霉親和素過氧化酶（SP）法進行，微波加熱法修復抗體，DAB顯色，每組切片任選1張用PBS液代替一抗作陰性對照，采用已知陽性切片作為陽性對照，檢測RhoA 蛋白的表達，RhoA 抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）濃度為1∶100。

1.5 免疫組化結(jié)果判定 RhoA 的陽性表達為位于細胞胞漿的棕黃色顆粒。按染色強弱及陽性細胞比例進行評分：（1）染色強度評分：不顯色或顯色不清0分；淺黃色1分；棕黃色2分；深褐色3分。（2）陽性細胞比例評分：每例標本各取4張切片，于光鏡下每張切片隨機選取5個高倍視野，至少計數(shù)500個以上的細胞，算出陽性細胞比例。陽性細胞比例＜1%為0分；2%～10%為1分；11%～50%為2分；51%～80%為3分；81%～100%為4分。兩種評分得分結(jié)果相乘：＜2分為陰性（－）；2～3分為弱陽性（＋）；4～5分為中度陽性（＋＋）；≥6分為強陽性（＋＋＋）。

1.6 Real－time PCR 檢測RhoA 基因mRNA 的表達 采用Trizol試劑提取組織總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進行RT－qPCR 的檢測，引物序列如下：GAPDH上游：5′－CAACGGGAAACCCATCACCA－3′下游：5′–ACGCCAGTAGACTCCACTCCACGACAT－3′（43bp）；RhoA：上游：5′－GTCCAAATGTGCCCATCATCCTA－3′上游：5′－CTGAACACTCCATGTACCCAAAGC－3′（22bp）；Real－time PCR反應條件為：95 ℃預變性10min，95 ℃變性15s，60 ℃退火15s，72 ℃延伸35s，共40 個循環(huán)，用GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△CT法計算目的基因的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，行為和飲食均未見異常，行動敏捷，呼吸平穩(wěn)，皮毛有光澤；COPD 模型組大鼠表現(xiàn)煩躁或精神不振，進食和進水量均有所減少；時有咳嗽，毛色枯槁；地塞米松治療組大鼠上述表現(xiàn)減輕。實驗結(jié)束前各組大鼠均無死亡。

2.2 Real－time PCR 檢測RhoA 基因mRNA 水平的相對表達量 RhoA 標準曲線線性良好，具有可重復性，證明RNA 具有較好的擴增能力。實驗結(jié)果應用2－△△CT法進行分析，結(jié)果見表1。與正常對照組比較，COPD 模型組大鼠RhoA mRNA 表達增高（P＜0.05），地塞米松組RhoA mRNA 表達降低（P＜0.05）；與正常對照組比較，COPD 模型組和地塞米松治療組RhoA mRNA 表達水平增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果見表2及圖1～3。與正常對照組比較，RhoA 在正常對照組、COPD 模型組和地塞米松治療組蛋白陽性表達率分別為20%（4／16），45%（9／20），35%（6／20）；與正常對照組比較，COPD 模型組蛋白陽性表達率增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與COPD 模型組比較，地塞米松治療組蛋白陽性表達率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠RhoA mRNA 的表達（±s）

表1 各組大鼠RhoA mRNA 的表達（±s）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與COPD 模型組比較，＊＊P＜0.05。

表2 各組大鼠肺組織RhoA 免疫組化結(jié)果（n=20）

圖1 正常對照組（RhoA組化染色×200）

圖2 COPD 模型組（RhoA組化染色×200）

圖3 地塞米松治療組（RhoA組化染色×200）

3 討論

COPD的早期主要病理變化是氣道炎癥，氣道重塑則是COPD 氣流阻塞的病理基礎。而氣道平滑肌細胞則是氣道重塑過程中最重要的效應細胞之一，其中RhoA 基因?qū)獾乐厮芷鹬匾饔?。RhoA激酶通過激活ROCK 作用于氣道的平滑肌細胞，調(diào)節(jié)細胞因子和炎性因子等的產(chǎn)生，影響氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展。RhoA 蛋白是細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導分子之一，具有GTP組酶活性。文獻［5］報組道，RhoA組主要通過調(diào)控MFs的重組參與細胞增殖、遷移和凋亡等過程；它還可以通過調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架的聚合狀態(tài)，參與細胞形態(tài)、極性、細胞黏附、轉(zhuǎn)移、信號傳導、細胞增殖、細胞吸附等。本文結(jié)果顯示，COPD 模型組RhoA 基因mRNA 的表達高于正常組（P＜0.05），證實RhoA 基因參與COPD 氣道重塑這一過程。通過前期相關實驗研究我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子－1（TGF－β1）的蛋白及mRNA 在慢性肺阻塞疾病大鼠模型的支氣管黏膜、肺組織均處于高表達，提示此因子可能參與了COPD 的發(fā)病過程。而Rho／ROCK 信號轉(zhuǎn)導通路能被多種細胞因子和炎癥介質(zhì)激活，其中包括TGF－β1、血小板源性生長因子（PDGF）、內(nèi)皮素－1（ET－1）等［6］。本文免疫組化結(jié)果表明，地塞米松治療組蛋白陽性表達率明顯低于COPD 模型組（改變趨勢P＜0.05）。地塞米松治療組RhoA mRNA 的表達與RhoA 免疫組化結(jié)果的改變具有一致性，說明地塞米松能夠抑制RhoA mRNA 及蛋白的表達，進而抑制平滑肌細胞的增生，從而有效地改善氣道重塑。

［1］中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南：2013年修訂版［S］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36（4）：255－264.

［2］Hogg JC，Chu F，Utokaparch S，et al.The nature of small－airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease［J］.The New England journal of medicine，2004，350（26）：2645－2653.

［3］Mcdonough JE，Yuan R，Suzuki M，et al.Small－airway obstruction and emphysema in chronic obstructive pulmonary disease［J］.The New England journal of medicine，2011，365（17）：1567－1575.

［4］宋一平，崔得健，茅培英.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型建立及藥物干預的影響［J］.中華內(nèi)科雜志，2000，39（8）：556－557.

［5］David M，Petit D，Bertoglio J.Cell cycle regulation of Rho signaling pathways［J］.Cell Cycle，2012，11：3003－3010.

［6］Vardouli L，Vasilaki E，Papadimitriou E，et al.A novel mechanism of TGF beta－induced actin reorganization mediated by Smad proteins and Rho GTP ases［J］.FEBSJ，2008，275：4074－4087.