氯沙坦對(duì)靜態(tài)牽張刺激導(dǎo)致肥大心室肌細(xì)胞中L型鈣離子通道表達(dá)的影響

楊君 楊龍 鄭亞西 牛晨光 田龍海 夏桂玲 田水 張羽坤 唐倩

（1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550002；3.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；4.貴州航天醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 遵義 563003；5.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550004）

心力衰竭（心衰）發(fā)病率及死亡率目前仍居高不下，是心源性死亡的主要病因之一，心衰時(shí)，受損心肌通過(guò)改變心肌收縮力、導(dǎo)致心肌肥大及電生理的重構(gòu)起到代償作用［1－2］。心肌肥大是心臟長(zhǎng)期承受過(guò)重負(fù)荷，靠質(zhì)量增加、收縮力加強(qiáng)產(chǎn)生的一種緩慢而有效的代償方式［3］。這種代償在維持充足心搏量的同時(shí)會(huì)增加耗氧量，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)、細(xì)胞膜電位改變等，從而導(dǎo)致和促進(jìn)心力衰竭，誘導(dǎo)心律失常［4］。肥大心肌細(xì)胞會(huì)引起大量第二信使相關(guān)通路的激活，其中血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）信號(hào)的激活與心肌肥大之間存在密切相互作用［5］。腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（RAS）激活增強(qiáng)血管收縮、促進(jìn)機(jī)體水鈉潴留，使回心血量和有效血容量增加；心臟前、后負(fù)荷的顯著增加進(jìn)一步惡化心力衰竭。因此，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）或AT1R 拮抗劑（ARB）能在有效降低血壓的同時(shí)起到保護(hù)心肌肥大的作用［6］。研究［7］表明，AT1R 拮 抗劑氯沙坦不僅可降低收縮壓，并且阻止心肌肥大。因而本研究擬通過(guò)靜態(tài)牽張刺激體外培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞，用血管緊張素受體阻斷劑氯沙坦干預(yù)，探討氯沙坦在靜態(tài)牽張刺激導(dǎo)致的心室肌細(xì)胞L－型鈣離子通道改變中的作用［8］。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 胎牛血清（FBS）和DMEM 高糖培養(yǎng)基由Gbico 公司生產(chǎn)，胰酶和Ⅱ型膠原酶購(gòu)自Sigma公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自碧云天公司，蛋白－DNA－mRNA 共提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega生物技術(shù)公組司，Cav1.2組抗組體組購(gòu)組自Abcam組公組司，SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自Takara公司，α－橫紋肌動(dòng)蛋白（α－SCA）單克隆抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純以上級(jí)別。

1.2 心室肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 出生1d的清潔級(jí)SD 大鼠用乙醚氣霧麻醉。取近心尖中下2／3的心室組織，洗去血液，剪至約1mm×1mm 的組織塊。用含0.05%胰酶和80mol／LⅡ型膠原酶的消化液消化，結(jié)合差速貼壁法獲得心室肌細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)和α－SCA 陽(yáng)性染色情況鑒定心室肌細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理 細(xì)胞于靜態(tài)牽張裝置硅膠模上貼壁培養(yǎng)24h，更換含5%FBS的DMEM 培養(yǎng)基，分為4組。（1）對(duì)照組：不予干預(yù)；（2）牽張組：較基礎(chǔ)培養(yǎng)狀態(tài)增加20%硅膠模面積；（3）氯沙坦組：在培養(yǎng)液中加入氯沙坦10μmol／L；（4）靜態(tài)牽張＋氯沙坦組：在培養(yǎng)液中加入氯沙坦10μmol／L 干預(yù)2h后，增加20%硅膠膜面積。各組細(xì)胞分組培養(yǎng)后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 牽張有效性鑒定 按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中BNP 水平；測(cè)定細(xì)胞DNA 和蛋白含量，計(jì)算蛋白／DNA 比值。結(jié)晶紫染色細(xì)胞并用軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞面積大小。

1.5 基因mRNA 水平的檢測(cè) 采用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物（序列見(jiàn)表1）。Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明檢測(cè)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 Cav1.2和GAPDH RT－PCR引物序列

1.6 蛋白質(zhì)印跡法 提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。取50μg總蛋白上樣，電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。充分漂洗后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h。充分漂洗后顯影、攝片并進(jìn)行條帶灰度定量測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Epidata 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，使用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以（±s）表示。組間總體差異性比較用方差分析，多處理組與對(duì)照組比較用t檢驗(yàn)，未計(jì)劃兩組間比較用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，如無(wú)特殊說(shuō)明，P值表示雙側(cè)概率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心室肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 倒置顯微鏡下可見(jiàn)心室肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形。心室肌細(xì)胞免疫組化染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，胞漿內(nèi)清晰可見(jiàn)棕褐色顆粒物，成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)陰性，可見(jiàn)大量細(xì)胞核。見(jiàn)圖1。

圖1 心室肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞α－SCA 抗體免疫組化染色（×200）

2.2 牽張有效性 心室肌細(xì)胞受靜態(tài)牽張后結(jié)果顯示刺激24h的細(xì)胞蛋白／DNA 比值明顯增加（P＜0.001，n=3），而Losar干預(yù)可有效抑制此效應(yīng)（P＜0.001，n=3，圖2）。靜態(tài)牽張心肌細(xì)胞使得其ANP基因表達(dá)（P＜0.01，n=3，圖3）均明顯增加。

圖2 4組心室肌細(xì)胞蛋白／DNA 比值（＊P＜0.001）

圖3 對(duì)照組與牽張組ANP基因表達(dá)比（＊P＜0.01）

2.3 L－型鈣離子通道基因表達(dá)情況 RT－PCR 技術(shù)加熒光定量法檢測(cè)樣本中初始目標(biāo)mRNA 含量，結(jié)果顯示靜態(tài)牽張刺激顯著下調(diào)心室肌細(xì)胞Cav 1.2的mRNA 表達(dá)（P＜0.01，n=3）；Losar可有效抑制該效應(yīng)（P＜0.05，n=3，圖4）。

圖4 牽張刺激心室肌細(xì)胞降低Cav1.2的

2.4 L－型鈣離子通道蛋白表達(dá)情況 WB 技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示靜態(tài)牽張刺激顯著下調(diào)心室肌細(xì)胞Cav1.2的蛋白表達(dá)（P＜0.01，n=3）；Losar可有效抑制該效應(yīng)（P＜0.05，n=3，圖5，6）。

圖5 Cav1.2蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果（＊P＜0.05；＊＊P＜0.01）

圖6 免疫印跡檢測(cè)Cav1.2蛋白表達(dá)

3 討論

3.1 靜態(tài)牽張刺激致肥大心室肌細(xì)胞模型評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)原代心室肌細(xì)胞，結(jié)合靜態(tài)牽張模仿過(guò)負(fù)荷導(dǎo)致的心室肌肥大，有效避免體內(nèi)神經(jīng)－體液因素的影響。若排除了機(jī)體復(fù)雜因素的干擾，即可較為單一的研究目標(biāo)通路。試驗(yàn)中牽張組心室肌細(xì)胞蛋白／DNA 比值、ANP基因表達(dá)和細(xì)胞面積明顯高于對(duì)照組，證明靜態(tài)牽張刺激導(dǎo)致心室肌細(xì)胞肥大模型建立成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 肥大心室肌細(xì)胞L－型鈣離子通道Cav1.2mRNA 和蛋白表達(dá)情況及AT1R信號(hào)調(diào)控作用 心力衰竭時(shí)部分離子通道表達(dá)發(fā)生改變，證明心衰是心律失常發(fā)生的重要獨(dú)立因素。有研究［9－10］指出心衰時(shí)心房細(xì)胞ICa－L降低，基因表達(dá)水平降低，但較少涉及蛋白水平及AT1R 信號(hào)調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)與正常組比較，靜態(tài)牽張組心室肌細(xì)胞Cav1.2基因及蛋白表達(dá)均明顯受到抑制，這種現(xiàn)象能被AT1R阻滯劑Losar所抑制。證明牽張刺激可能通過(guò)激活A(yù)T1R信號(hào)通路導(dǎo)致心室肌細(xì)胞肥大，同時(shí)還通過(guò)該通路下調(diào)Cav1.2的表達(dá)。Losar可抑制牽張刺激所致的心室肌細(xì)胞肥大，這也提示了RAS參與心室肌細(xì)胞的重構(gòu)過(guò)程。心衰導(dǎo)致RAS系統(tǒng)激活，可使心律加快進(jìn)而鈣離子內(nèi)流增加，超載的鈣離子可以反饋抑制L－型鈣離子通道［11］。進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)外鈣、鉀分布，心肌細(xì)胞電位不穩(wěn)定，誘發(fā)心律失常。

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