燕窩唾液酸檢測方法研究綜述

操 然

（福建農林大學 材料工程學院，福建 福州350002）

燕窩是金絲燕屬（Collocalia）雨燕科（Apodidae）6 種燕子以其富含蛋白質的唾液和羽絨混合凝結于懸崖峭壁上，或農家屋舍而長成的巢窩。燕窩的種類可以隨燕子和筑巢用材分為官燕、毛燕和草燕3種。其中官燕習慣以純唾液筑成燕巢, 所以雜質較少,其色澤微黃,呈絲瓜絡樣,加水后變軟,吸水力強,是燕窩中的上品；毛燕產自“洞燕”,此類燕子習慣用羽毛混和唾液筑巢,毛燕的吸水力較官燕弱,且顏色較暗,含有雜質營養(yǎng)價值較官燕低；草燕喜以雜草混和口水筑巢,含大量雜質,其燕窩成分是最少的。

燕窩的主要成分為活性糖蛋白和天然營養(yǎng)物質、礦物質，其特征成分為唾液酸糖蛋白，唾液酸糖蛋白由唾液酸、氨基酸和糖構成，在一定的酸性條件下可水解出游離的唾液酸單體，學名N-乙酰神經氨酸。鑒別燕窩的本質就是檢測燕窩中的唾液酸是否具符合標準。

圖1 唾液酸的化學結構式

1 釋放唾液酸

在合理的條件下將唾液酸從低聚糖和糖蛋白中釋放出來是檢測燕窩唾液酸含量的前提，常見釋放唾液酸的方法有酸解法和酶解法。其中酸解法大多用磷酸為利用酸水解斷開連接、去乙酰基、去碳酸基，唾液酸釋放較為徹底，而且適應性好，無特異性，合適的水解條件是決定唾液酸是否釋放完全的關鍵。檢測中所用到的酸有磷酸、冰乙酸、硫酸氫鈉、鹽酸、三氟乙酸（沸點低，提取后易揮發(fā)）、乙酸。所用最多的是硫酸氫鈉和磷酸，酶解法利用較少。

2 唾液酸檢測方法的研究進展

長期以來，經過科技人員的不懈努力，燕窩唾液酸檢測方法不斷取得進展，先后發(fā)現了氣相色譜法、傅里葉紅外光譜法、液相色譜法、紫外分光度計法、雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測檢測方法、離子色譜法等6 大類9 種方法。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法是將唾液酸通過醇解和三甲基硅烷衍生化后利用氣象色譜儀進行分析。在實踐中，該方法由早期的毛細管氣象色譜法演進到多糖氣相色譜法。

2.1.1 毛細管氣象色譜法

陳文銳[1]早在1995年就毛細管法測唾液酸進行了研究。毛細管法是將燕窩中唾液酸水解后，通過比對氨基酸含量，判別燕窩的含量。該研究中對真燕窩唾液酸水解后和豬皮魚鰾等摻假燕窩水解后，對唾液酸中氨基酸種類成分進行了比較，得出的結果為真燕窩中16 種氨基酸的總含量為40.50-45.12%； 而豬皮摻假燕窩為73.46%； 魚鰾為91.80%；銀耳為4.88%；瓊脂為1.37%。并根據這些差別鑒定了市面宣稱含燕窩的飲品，例如“冰糖燕窩”等，通過實驗方法和理論分析其是否含羥基脯氨酸和是否含動物性蛋白，檢測出燕窩相關產品的真?zhèn)?。該方法能粗略檢測出燕窩中唾液酸，但不能定量測出唾液酸含量，僅能根據水解后氨基酸種類和含量判斷燕窩加工產品中是否含有燕窩，適用于燕窩相關產品檢測。

2.1.2 多糖氣相色譜法

2011年李波[2]等進行了氣相色譜法同時測定多糖中的中性糖、糖醛酸、氨基糖和唾液酸的研究。用1mol/l 鹽酸甲醇在85℃反應18-24h，碳酸銀中和，加入乙酸酐室溫暗處反應24h，使氨基糖重新引N-乙酰基，除銀鹽，干燥，加入硅烷化試劑，室溫放置5天，最后用氣相色譜進行分析，實驗所用的多糖樣品為豆腐渣堿溶性多糖和雞腿菇多糖。氣相色譜法測唾液酸可應用至燕窩中唾液酸的檢測中，與液相色譜等方法相比，該方法樣品用量少，靈敏度高，分辨率強，分析速度快，但也存在前處理時間長的缺點。

2.2 傅里葉紅外光譜法

孫素琴[3]等人在2001 首次利用微鉆石ATR 探頭傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)無損快速鑒別了6種燕窩。研究根據燕窩中的唾液酸(N-乙酰神經氨酸)在紅外光譜下有特殊的吸收峰，利用微鉆石ATR探頭FTIR 光譜法直接測定燕窩樣品，通過比較不同天然燕窩的紅外特征譜可以達到鑒別燕窩的作用。研究中對比了6 種來源不同的燕窩的紅外吸收光譜，進行了非均勻性分析，并對比了常見燕窩摻假品豬皮屑、銀耳的光譜圖，發(fā)現豬皮屑和銀耳的紅外光譜有較大的特征性, 天然燕窩在2925cm-1附近的吸收峰強度較弱，而銀耳和豬皮屑則在此處吸收較強；豬皮屑的蛋白質、氨基酸類化合物含量較豐富,即酰胺Ⅰ、Ⅱ帶(1629、1531cm-1)的吸收峰較強，1039cm-1附近的吸收峰較弱; 銀耳和豬皮屑在1734cm-1附近會出現脂肪類化合物的特征吸收峰，銀耳在1021cm-1的吸收峰很強，這是區(qū)別燕窩中是否摻有豬皮屑和銀耳的判別依據。

傅里葉紅外光譜法與傳統(tǒng)鑒別方法相比更直觀、可靠，可做到無損快速鑒別，缺點是不能定量檢測燕中唾液酸，即N-乙酰神經氨酸的含量。

2.3 液相色譜法

液相色譜法是檢測唾液酸最常見的方法，主要是將唾液酸在弱酸性條件下水解，從寡糖鏈、糖脂、糖蛋白中游離出來，利用高效液相色譜法（HPLC）分離，以其他改進或衍生的方法來鑒定。

2.3.1 高效液相色譜法(HPLC)

該方法利用唾液酸在酸性條件下可與某些物質（如鄰苯二胺）反應,生成有強紫外吸收的唾液酸衍生物。具體方法是確定高效液相色譜、制備標準曲線、確定檢測波長、實際樣品測定、HPLC 分析（通過測定處理后的燕窩樣品吸收峰的峰面積，用標準曲線法可以計算出其中含唾液酸的含量）。該方法的圖譜具有較強的特征性、直觀性和一致性,能夠鑒別燕窩類保健品的真?zhèn)? 還能對燕窩類保健品中的唾液酸含量進行定量測定，具有靈敏度高、重復性好的特點,可準確測定燕窩及其類保健品中唾液酸的含量。

2.3.2 柱前衍生二極管陣列/熒光檢測器串聯(lián)的反相高效液相色譜檢測法 (DAD/FLD 串聯(lián)HPLC 法)

馮婷玉[4]等人在2009年對HPLC 進行改進，該方法采用DAD/FLD 串聯(lián)HPLC 法，以鄰苯二氨鹽酸鹽(OPD-HCl)為衍生化試劑對唾液酸(N—乙酰神經氨酸)進行定量測定。通過對比不同屬解條件，該方法選擇了0.5mol/l 硫氫酸鈉在80℃水浴加熱30 分鐘的水解方法，唾液酸在酸性條件下與鄰苯二胺反應生成強紫外吸收和熒光的唾液酸衍生物，采用C18 柱分離，四氫呋喃溶液-乙腈為流動相進行等度洗脫，檢出限為0.2μg/mL(DAD)，0.005μg/mL(FLD)。

DAD/FLD 串聯(lián)HPLC 法將最普及的HPLC 檢測器DAD 和具有更高的靈敏度和選擇性的FLD 串聯(lián)，彌補各自的不足，保證待測唾液酸在各濃度下能被正確檢出。該法具有靈敏度高、檢出限低、定量準確、方便快速等特點。

2.3.3 高效液相色譜—質譜法(HPLC-MS)

侯向昶[5]等人在2013年建立了燕窩中唾液酸含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）測定方法。該方法將經磷酸水解后的燕窩中的唾液酸從與唾液酸糖蛋白的結合狀態(tài)中游離出來，吸取上清液過Oasis HLB 柱，用水淋洗固相萃取柱并棄去全部流出液，用真空泵在40-60kPa 負壓下抽干Oasis HLB 固相萃取柱，再用甲醇洗脫被測物，洗脫液40℃水浴中氮氣吹干，用流動相溶液定容，采用負離子模式和多反應監(jiān)測模式超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測，并用外標法計算其唾液酸含量。方法的線性范圍在0.1-50mg/L 之間，相關系數0.999，檢出限為0.02mg/kg，定量限為0.1mg/kg，樣品平均加標回收率為93.5%，相對標準偏差1.52%。與其他高效液相色譜法不同的是，該方法省略了唾液酸衍生化的過程，簡化了實驗流程，同時在流動相中采用高比例水相并采用T3 色譜柱，解決了極性化合物唾液酸在C18 柱上不保留或者需要通過衍生化的方式進行測定的問題。

高效液相色譜—質譜法前處理簡單、重復性好、靈敏度高，可應用于燕窩中唾液酸含量的測定。

2.4 紫外分光光度計法（UV-Vis）

李敏[6]等人在2011年研究了用分光光度計方法檢測燕窩含量。實驗研究了水解時酸的種類、酸的濃度和時間對水解的影響。并得出了最適宜的水解條件為50%的醋酸水解10min。該方法利用唾液酸與酸性茚三酮形成穩(wěn)定的黃色物質，在470nm 有最大吸收峰的特點，用分光光度計測其吸光度，并根據標準曲線計算出唾液酸含量。該方法準確率高，可定量檢測唾液酸含量、定量鑒別燕窩真?zhèn)?。該方法比HPLC 法結果偏低，但無顯著性差異。

2.5 雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測方法（ELISA）

張世偉[7]等人在2013年建立一種燕窩中唾液酸糖蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測方法。該方法以唾液酸糖蛋白為抗原, 分別制備唾液酸糖蛋白的多克隆和單克隆抗體。將單克隆抗體為包被抗體, 辣根過氧化物酶標記多克隆抗體為二抗構建燕窩唾液酸糖蛋白的雙抗夾心ELISA 方法。本方法的IC50為2.3ng/mL，樣品的添加回收率為92%-96%，相對標準偏差小于10%。傳統(tǒng)檢驗方法僅將唾液酸作為檢測目標，但目前唾液酸已能進行產業(yè)化規(guī)模生產，作為食品添加劑、營養(yǎng)強化劑使用，并不是燕窩特有的組分。將唾液酸法作為燕窩制品真?zhèn)舞b定的方法，其特異性及可靠程度不高。但該方法利用燕窩中唾液酸主要以唾液酸糖蛋白形式高豐度、特異性存在的，唾液酸蛋白在不同燕窩中含量穩(wěn)定且不易熱變性、熱分解，可作為燕窩的指示蛋白。摻偽燕窩由于混入了其他物質，其唾液酸糖蛋白含量將明顯偏低。該方法檢測實際樣品穩(wěn)定可靠，能檢測燕窩中的唾液酸為燕窩所特有而不是另外添加的。

雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測方法不易受基質干擾，具有較好的實際應用價值和開發(fā)成商品化試劑盒的潛力。該方法具有高靈敏度和高特異性、操作簡單、檢測成本低等優(yōu)點。能同時對幾十個樣品進行檢測，可用于生產實際中[8]。

2.6 離子色譜法—積分脈沖安培法

李耿[9]等在2014 采用離子色譜儀、抑制器、電導檢測器在一定條件下分別測定燕窩、速食燕窩及偽品中N-乙酰神經氨酸的含量。實驗結果N-乙酰神經氨酸在0.25-5.00μg/mL 范圍內線性良好，r=0.9999； 在燕窩中的平均回收率為99.7%，RSD=0.82%（n=6）。該方法的優(yōu)點靈敏度高，可達pmol 水平；分析時間短，一般在15-30min 內即可完成；無需進行衍生化和嚴格的樣品處理；可以使用梯度洗脫；色譜柱的選擇性及分辨率高；可定性定量檢測燕窩及其相關產品中唾液酸含量。

3 總 結

至今為止，科技工作者發(fā)現了6 大類9 種燕窩唾液酸檢測方法，各有特點，現綜合比較如表1 所示。

表1

續(xù)表

對比以上6 大類燕窩鑒別方法，氣相色譜法、紅外光譜法等方法可粗略檢測燕窩中的唾液酸，但不能定量檢測出唾液酸的含量，可用于判斷加工產品中是否含有燕窩。液相色譜法和紫外分光光度計法和離子色譜—積分脈沖安培法均可以定性定量檢測燕窩中唾液酸含量，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，這兩種方法具有分析時間短和流程簡單等特點，適合于快速檢驗。雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測檢測方法（ELISA）利用燕窩中唾液酸以特異性的唾液酸糖蛋白形式存在的特點設計出的檢驗方法，該方法不僅具有高靈敏度和高特異性、操作簡單、檢測成本低等優(yōu)點，還不易受基質干擾，具有較好的實際應用價值，可開發(fā)成商品化試劑盒，可在商業(yè)上推廣。

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[9]李耿,ASANTE Joseph Obiri，戴潔，等.離子色譜-積分脈沖安培法測定燕窩中N-乙酰神經氨酸的含量[J].廣東藥學院學報,2014(01）:40-43.