三聚氰胺降解菌的分離鑒定及其生物炭固定化研究

付 盼，周 輝，趙雨薇，孫明星，沈國清

（1.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

三聚氰胺（Melamine）是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，分子式為C3N6H6.自2008年三聚氰胺食品污染事件發(fā)生后，環(huán)境中三聚氰胺的污染引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注［1］.早在2007年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織就曾指出，作為農(nóng)藥或動(dòng)物殺蟲劑使用的滅蠅胺，在分解后會(huì)產(chǎn)生三聚氰胺.除此之外，由于三聚氰胺的含氮量高達(dá)66.6%，有報(bào)道指出，我國每年生產(chǎn)的5.0×108kg三聚氰胺的廢渣全氮含量為50.01%，可以制成肥料，為植物提供氮素營養(yǎng)［2－3］.然而，三聚氰胺本身所具有的水溶性差和土壤中難降解的特性，導(dǎo)致農(nóng)作物對(duì)三聚氰胺中氮素的利用率較低［4－5］.現(xiàn)有研究表明，環(huán)境中的污染物主要通過生物降解途徑從環(huán)境中緩慢消失，因此，污染物的生物降解受到了廣泛關(guān)注［6－7］.

Daniel R Shelton等（1997）研究報(bào)道了Klebsiella terragena 菌對(duì)三聚氰胺的降解途徑與機(jī)理［8］；Kazuhiro Takagi等（2012）從稻田土壤中篩選出了Nocardioides三聚氰胺降解菌，研究了三聚氰胺微生物降解過程中各產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化［9］.然而這些降解菌在實(shí)際環(huán)境中還無法形成優(yōu)勢菌，其生態(tài)穩(wěn)定性較差.國內(nèi)還未見有關(guān)土壤中三聚氰胺降解菌的研究報(bào)道.本文從農(nóng)田土壤中成功分離出了1株高效降解三聚氰胺的菌株，并采用微生物生物炭固定法，對(duì)兩種類型土壤中的三聚氰胺進(jìn)行了生物降解試驗(yàn)，研究結(jié)果可為提高土壤中三聚氰胺的降解提供新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試土樣：試驗(yàn)用水稻土和黑土分別采自上海市閔行區(qū)浦江鎮(zhèn)和吉林省松原市農(nóng)田土壤，過0.385mm 篩備用，供試土壤理化性質(zhì)見表1.

（2）培養(yǎng)基：基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）和Luria－Bertani培養(yǎng)基（LB）按參考文獻(xiàn)［10］配制.

（3）主要試劑和儀器：三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、乙腈、甲醇（色譜純）、氨水、庚烷磺酸鈉、檸檬酸由上海國藥集團(tuán)提供；PCR 和電泳等試劑購自上海星漢生物科技有限公司.UV－2401PC紫外可見分光光度計(jì)；PE200高效液相色譜儀，Tecnai G2Spirit Biotwin透射電子顯微鏡；TC－96／G／H（b）BPCR 儀；JY－600C三恒電泳儀.

表1 供試土壤理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of soils

1.2 菌株的富集與篩選

取水稻土于錐形瓶中，加入生理鹽水，振蕩30s，用4層紗布過濾.將過濾液分別接入含10mg／L 三聚氰胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃，180r／min培養(yǎng).每隔7d，提高三聚氰胺濃度10mg／L，直至三聚氰胺濃度至40mg／L.取富集培養(yǎng)液涂布于添加相應(yīng)三聚氰胺濃度的無機(jī)鹽平板上培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24h后，挑取生長較好的菌落進(jìn)行純化，并作為目標(biāo)菌株保存?zhèn)溆?

1.3 初始pH 值和溫度對(duì)降解菌株生長的影響

將降解菌株制成A600為1.0的菌懸液，吸取等量菌懸液以1%（體積分?jǐn)?shù)）分別接入到pH 為5，6，7，8，9和10的含三聚氰胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37℃，180r／min培養(yǎng)，連續(xù)取樣10d，測定初始pH 對(duì)菌株生長的影響；另外選取不同溫度（27，32，37，42和47℃）分別培養(yǎng)，測定溫度對(duì)菌株生長的影響；以上試驗(yàn)連續(xù)取樣后，測菌體A600，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，且設(shè)不接種菌為對(duì)照.

1.4 降解率測定

將降解菌株制成A600為1.0的菌懸液，以1%（體積分?jǐn)?shù)）分別接入含有10，20，30，40，50mg／L 三聚氰胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37℃，180r／min搖床培養(yǎng)，設(shè)置不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，間隔1 天取樣，連續(xù)2 周.所取培養(yǎng)液直接過固相萃取柱（Poly－Sery MCX SPE TUBES；40μm，60mg，3mL；CNW Technologies；通過甲醇活化），用氨水甲醇溶液（5／95，體積比）洗脫，收集洗脫液N2吹干，用20%甲醇溶液定容，過0.45μm 有機(jī)濾膜，用高效液相色譜檢測其殘留.色譜條件：色譜柱SPHERI－5RP－18（5μm，250mm×4.6mm），柱溫為30℃；流動(dòng)相為乙腈／庚烷磺酸鈉－檸檬酸緩沖液（15／85，體積比），緩沖液配比為每500mL水含1.01g庚烷磺酸鈉和1.05g檸檬酸；檢測波長240nm，流速1.0mL／min，進(jìn)樣量10μL.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中三聚氰胺的殘留量，根據(jù)如下公式計(jì)算降解率.降解率（%）＝［1－（處理實(shí)測殘留量／對(duì)照實(shí)測殘留量）］×100%.

1.5 菌株對(duì)三聚氰胺的降解動(dòng)力學(xué)分析

為了解菌株降解規(guī)律，采用下列描述底物濃度和降解速率之間定量關(guān)系的Monod方程，研究分析菌株對(duì)三聚氰胺的降解動(dòng)力學(xué)：

式（1）中：v、vmax分別為底物的生物降解速率和最大底物的生物降解速率，mg／（L·h）；Km為米氏方程常數(shù)，mg／L；S 為底物濃度，mg／L.

通過實(shí)驗(yàn)測得最適條件下三聚氰胺濃度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)，將培養(yǎng)72～96h（對(duì)數(shù)期）中三聚氰胺含量與時(shí)間的半對(duì)數(shù)圖做線性最小二乘擬合，計(jì)算出不同底物濃度對(duì)應(yīng)的生物降解速率，然后采用雙倒數(shù)法作圖，得到1／v與1／S 的關(guān)系，計(jì)算確定菌株降解三聚氰胺的動(dòng)力參數(shù).

1.6 菌種的鑒定

（1）形態(tài)及生理生化鑒定：用光學(xué)和透射電子顯微鏡觀察降解菌的形態(tài)，參照文獻(xiàn)［11］對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定，所用試劑盒為K2005革蘭氏陰性桿菌生化鑒別試劑（BIO－KONT 20E，康泰生物科技有限公司）.

（2）分子鑒定：Axygen細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株的總DNA，采用細(xì)菌的16SrRNA 通用引物，上游引物27F：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’，下游引物1492R：5’－TACGGCTACC TTGTTACGACTT－3’；擴(kuò)增出的序列酶切后連接到pMD18－T 載體，并轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞篩選陽性克隆菌落［12］.PCR 引物合成及序列測定由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司完成.利用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索，然后用軟件MEGA6進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，確定菌株的種屬關(guān)系.

1.7 生物炭及其固定化小球的制備

（1）生物炭的制備：對(duì)風(fēng)干后的樟樹枝條在烘箱中80℃下烘干，用高速萬能粉碎機(jī)粉碎后500℃下限氧熱解4h，制得實(shí)驗(yàn)所需生物炭.

（2）固定化小球的制備：稱取1.0g生物炭，加入含有10mL菌懸液（A600＝1.0）的錐形瓶中，搖床培養(yǎng)12h.8 000r／min離心清洗得吸附載體，加入無菌水定容至20mL備用.包埋：將聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA）按10%＋0.5%混合配成50 mL 水溶液，在水?。?0 ℃）中加熱并連續(xù)攪拌溶解，冷卻后（40℃）得混合膠體；交聯(lián)：加入20mL上述吸附載體，用無菌水定容至100mL充分混勻后，用注射器將其滴入含4%CaCl2的飽和硼酸溶液中（NaOH 調(diào)pH 值至6.7），在4℃下靜置24h，固化成球后備用.

1.8 固定化降解菌對(duì)土壤中三聚氰胺的降解

試驗(yàn)采用黑土和水稻土兩種土壤，土壤樣品經(jīng)高壓滅菌鍋120℃滅菌20min后，準(zhǔn)確稱取500g樣品，置于1 000mL燒杯中.加入含三聚氰胺的20%甲醇溶液，形成50mg／kg的土壤樣品.兩種土壤分別設(shè)置生物炭固定化菌、菌懸液、無菌生物炭固定化小球和空白對(duì)照4個(gè)處理，每處理重復(fù)3次.處理后的土壤樣品置于30℃、濕度為40%的恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)培養(yǎng)35d，每隔一周取樣檢測三聚氰胺殘留量，研究生物炭固定化降解菌對(duì)土壤中三聚氰胺的降解效果.在此基礎(chǔ)上，分別配置含三聚氰胺50，100，200和400mg／kg的土壤，考察生物炭固定化降解菌降解效率.數(shù)據(jù)分析采用Excel、SPSS 和Origin 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生理生化特性

經(jīng)過富集篩選后，共得到具有較強(qiáng)降解三聚氰胺的菌株10株，經(jīng)進(jìn)一步篩選，確定1株對(duì)三聚氰胺具有較高降解效率的菌株，編號(hào)為MB4.該菌株在30mg／L的三聚氰胺液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d，降解效率達(dá)到81.67%，經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證得知，該菌株降解重現(xiàn)性良好.菌株生理生化特性檢測結(jié)果表明，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，濕潤，乳白色，邊緣平整，表面凸起.生理生化特征見表2.圖1為LB 液體培養(yǎng)基、37℃培養(yǎng)12h后，透射電子顯微鏡（20 000×）觀察到的圖片，菌體細(xì)胞為長桿狀，無芽孢，長度3.2～5.5μm，寬度0.8～1.2μm.

表2 菌株MB4的生理生化特征Tab.2 Biochemical features of strain MB4

圖1 三聚氰胺降解菌株MB4透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 Micrographs of melaminedegrading strain MB4

2.2 16SrRNA測序分析

將菌株MB4序列經(jīng)16SrRNA 測序后，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，構(gòu)建菌株MB4與其親緣關(guān)系較近菌屬的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2.由圖2可見，MB4與菌株AY741360.1（GenBank序列登錄號(hào)）的同源性達(dá)99%，表明該菌株與洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）有很近的親緣關(guān)系，其16SrRNA 序列長度為1 468bp，結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化性質(zhì)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，將菌株MB4鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia cepacia.于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏號(hào)為：CGMCC No.9843.該菌株是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性細(xì)菌，也有報(bào)道指出該種屬的一些細(xì)菌具有生物防治、促進(jìn)植物生長和生物修復(fù)等功能［13－14］，然而作為三聚氰胺降解菌株卻未見報(bào)道.

圖2 菌株MB4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain MB4

2.3 菌株MB4生長及其對(duì)三聚氰胺的降解動(dòng)力學(xué)分析

由圖3可見，菌株在0～2d時(shí)處于適應(yīng)期，生長緩慢，對(duì)三聚氰胺的降解也較弱；2d后，菌株利用三聚氰胺作為營養(yǎng)物質(zhì)，開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，菌體量增加較快，對(duì)三聚氰胺的降解作用也增強(qiáng)；培養(yǎng)5d后，菌株處于最活躍階段，生長量達(dá)到最大；6d后對(duì)數(shù)生長期結(jié)束，菌株進(jìn)入衰退狀態(tài)，對(duì)三聚氰胺的降解趨緩.

圖4為采用Monod方程，通過雙倒數(shù)法作圖得到的1／v與1／S 的關(guān)系曲線.由圖4可見，三聚氰胺為唯一碳源和氮源的生物降解速率在底物濃度為10～50mg／L 時(shí)，呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2＝0.986 3.菌株降解三聚氰胺的米氏方程為：

式（2）中，Km＝2.545mg／L.當(dāng)S 遠(yuǎn)大于2.545mg／L 時(shí)，最大降解速率vmax＝1.24mg／（L·h）.說明，底物濃度在10～50mg／L時(shí)降解菌株具有快速降解能力.

圖3 菌株MB4的生長和三聚氰胺的降解曲線Fig.3 Curves of stain MB4growth and melamine degradation

圖4 1／v與1／S 的關(guān)系曲線Fig.4 The relation curve of 1／vand 1／S

2.4 初始pH 值和溫度對(duì)降解菌MB4生長的影響

（1）初始pH 值對(duì)菌株生長的影響：培養(yǎng)基的pH 值會(huì)影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進(jìn)或抑制微生物生長［15］.將菌株MB4分別接種于初始pH 值分別為5～10含三聚氰胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，研究了初始pH 值對(duì)降解菌MB4生長的影響.結(jié)果表明，菌株在中性和堿性（pH≥7）條件下，生長速度較快，pH 值為8時(shí)菌株生長量最大，A600達(dá)到9.610；在初始pH 值為9和10的條件下，菌株生長量較小；而初始pH 值為5和6時(shí)，菌株受抑制且?guī)缀跬Ｖ狗敝常▓D5）.因此，菌株MB4最適生長的初始pH 值為7～8.這是因?yàn)橐话慵?xì)菌表面帶有負(fù)電荷，大多數(shù)生長的環(huán)境要求中性或偏堿性，過高或過低的pH 值會(huì)使細(xì)胞表面電荷發(fā)生改變，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收［16］.

（2）溫度對(duì)菌株MB4生長的影響：圖6為不同溫度條件下，菌株MB4在含三聚氰胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長情況.由圖中可見，菌體生長量隨著溫度升高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，菌株的最適生長溫度為37℃，此時(shí)的生物量最大，這是因?yàn)殡S著溫度的升高，酶促反應(yīng)速度相應(yīng)提高，微生物的代謝速率與生長速率均相應(yīng)提高，溫度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白質(zhì)或核酸變性失活，導(dǎo)致菌體生長量降低.

圖5 初始pH 值對(duì)降解菌MB4生長的影響Fig.5 Effects of different primary pH on strain MB4growth

圖6 溫度對(duì)降解菌MB4生長的影響Fig.6 Effects of different temperature on strain MB4growth

2.5 生物炭固定化降解菌對(duì)土壤中三聚氰胺的降解作用

圖7為生物炭固定化降解菌對(duì)水稻土和黑土中三聚氰胺的降解作用，由圖中可見，無論是水稻土還是黑土，在35d培養(yǎng)期內(nèi)，不添加菌和炭的對(duì)照組（PS－CK 和BS－CK）中，幾乎無三聚氰胺降解作用發(fā)生；菌液處理的水稻土（PS－B）和黑土（BS－B）中三聚氰胺的降解率分別為14.67%和21.86%；生物炭處理后，一周內(nèi)水稻土和黑土中三聚氰胺的含量分別下降了13.6%和14.4%.這主要是由生物炭對(duì)三聚氰胺的吸附作用引起的；而添加生物炭固定化降解菌后，土壤中三聚氰胺的濃度顯著下降，在35d培養(yǎng)期間，水稻土和黑土中三聚氰胺的濃度分別降低了67.34%和70.66%，表現(xiàn)為生物炭固定化降解菌對(duì)黑土中三聚氰胺的降解作用優(yōu)于水稻土.表3 為生物炭固定化降解菌對(duì)黑土中不同濃度三聚氰胺的降解作用，經(jīng)過35d培養(yǎng)后，生物炭固定化降解菌MB4對(duì)黑土中50～400 mg／kg 三聚氰胺的降解效率可達(dá)52.83%～70.33%.其降解動(dòng)態(tài)符合Logistic方程Y＝A－A／［1＋（t／t0）n］，擬合系數(shù)均在0.95以上.式中Y 為土壤中三聚氰胺濃度；A 為土壤中三聚氰胺的最終降解率；t為降解時(shí)間；t0為半降解時(shí)間.

圖7 生物炭固定化降解菌對(duì)不同土壤中三聚氰胺的降解作用Fig.7 Degradation of melamine in two soils bybiochar immobilized strain MB4

表3 生物炭固定化降解菌MB4對(duì)黑土中三聚氰胺的Logistic降解動(dòng)力學(xué)模型各參數(shù)及統(tǒng)計(jì)指標(biāo)Tab.3 Parameters and statistical indicators of melamine degradation Logistic Kinetic model in black soil by biochar immobilized stain MB4

（1）從農(nóng)田土壤中分離篩選出了1株能以三聚氰胺為唯一碳源和氮源的三聚氰胺降解菌株MB4，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16SrRNA 序列分析，初步鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌.

（2）菌株MB4能夠在三聚氰胺濃度為10～50mg／L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中正常生長，10d內(nèi)對(duì)30mg／L三聚氰胺的降解率可達(dá)到81.67%，其最適生長條件為pH 為7～10，溫度27～37℃.

（3）Monod方程動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明，在三聚氰胺濃度為10～50mg／L時(shí)，降解菌MB4具有快速降解能力，米氏方程常數(shù)Km＝2.545mg／L，最大降解速率為1.24mg／（L·h）.

（4）經(jīng)過35d實(shí)際土壤培養(yǎng)后，生物炭固定化降解菌MB4對(duì)黑土中50～400mg／kg三聚氰胺的降解效率可達(dá)52.83%～70.33%.其降解動(dòng)態(tài)符合Logistic方程.

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