表達(dá)結(jié)核分枝桿菌融合抗原TB10.4－HspX的重組酵母免疫效果研究

張宇飛，陸 健，劉建平，王洪海

（1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所，上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌等病原體引起的傳染病，自古以來(lái)一直是人類健康的重大威脅.長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化使結(jié)核分枝桿菌發(fā)展出了在人體內(nèi)潛伏感染的機(jī)制，導(dǎo)致全世界近1／3的人口是結(jié)核病病原體的潛伏感染者，并在一定的條件下發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病.2012年全世界共有870萬(wàn)例結(jié)核病病例，其中130萬(wàn)例死亡，是致死人數(shù)排名第二的傳染病，僅次于艾滋?。?］.更為可怕的是這兩大傳染病共同感染的幾率很高，在130 萬(wàn)例結(jié)核病死亡病例中有32 萬(wàn)例是與HIV 共同感染，結(jié)核病成為艾滋病人的一大直接死因［2－4］.

目前結(jié)核病的防治主要存在兩大難點(diǎn)：（1）治療上，異煙肼和利福平是治療結(jié)核最有效的藥物，但隨著抗藥性菌株的出現(xiàn)，依賴這兩種抗生素的治療變得愈發(fā)困難，在2012年的130萬(wàn)例結(jié)核死亡病例中有17萬(wàn)例感染的是多抗藥性菌株［5］；（2）預(yù)防上，卡介苗（Bacillus Calmette－Guérin，BCG）是國(guó)際上唯一批準(zhǔn)使用的抗結(jié)核疫苗，在幼兒時(shí)期接種后具有一定保護(hù)作用，但其效果隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，并且重復(fù)接種無(wú)法增強(qiáng)保護(hù)效果.而且作為一種純預(yù)防性疫苗，卡介苗無(wú)法清除處于潛伏感染期的結(jié)核病病原體，如果為HIV 感染者接種則可能激活潛伏的結(jié)核病病原體，使其發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病.目前開(kāi)發(fā)中的抗結(jié)核疫苗多為亞單位疫苗和減毒活疫苗等，存在保護(hù)效果低下和恢復(fù)致病性風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題［6］.因此有必要研發(fā)效果更好的新型抗結(jié)核疫苗.

近年來(lái)一種新的疫苗類型進(jìn)入了人們的視野，即重組釀酒酵母（S.cerevisiae）全菌疫苗.重組釀酒酵母全菌疫苗是以釀酒酵母作為疫苗載體，將表達(dá)抗原的重組釀酒酵母全菌免疫接種.與傳統(tǒng)的疫苗相比，這種新型疫苗的主要特點(diǎn)是：（1）清晰的遺傳背景；（2）較高的安全性；（3）能一次表達(dá)多個(gè)外源蛋白，而且培養(yǎng)方便，成本低廉；（4）具有很強(qiáng)的免疫佐劑作用，其細(xì)胞壁是一種天然的佐劑，其中所含的β－1，3－D－葡聚糖和甘露糖等成分能刺激免疫系統(tǒng)中最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic Cells，DCs），促進(jìn)其成熟并增強(qiáng)其抗原遞呈能力，DCs遞呈抗原激活殺傷性T 淋巴細(xì)胞或輔助性T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而在整體上達(dá)到增強(qiáng)抗原免疫原性的效果［7－8］；（5）自身的免疫原性很低，很少與機(jī)體產(chǎn)生免疫中和反應(yīng)，不會(huì)形成記憶型免疫，這意味著可通過(guò)重復(fù)接種增強(qiáng)疫苗效果；（6）釀酒酵母熱失活后與活菌相比具有等價(jià)的免疫效果，使用熱失活的酵母進(jìn)行免疫，排除了使用活菌可能帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步提高了安全性.

綜上所述，釀酒酵母疫苗具有成為治療性疫苗的潛力.目前，已有幾個(gè)釀酒酵母全菌疫苗在前期研究中取得成功并進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，例如表達(dá)癌癥相關(guān)抗原的Yeast－Ras、Yeast－CEA 以及表達(dá)丙肝抗原的Yeast－HBV［9－11］.釀酒酵母疫苗能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生保護(hù)乃至治療效果.

基于重組釀酒酵母全菌的抗結(jié)核疫苗國(guó)外尚未見(jiàn)到報(bào)道.本研究擬將釀酒酵母應(yīng)用于抗結(jié)核疫苗研究.選取兩個(gè)結(jié)核分枝桿菌抗原TB10.4（Rv0288）和HspX（Rv2031c），將其融合表達(dá).TB10.4是一種免疫原性較強(qiáng)的抗原，結(jié)核分枝桿菌和BCG 菌株都有表達(dá)，在結(jié)核分枝桿菌感染宿主的整個(gè)過(guò)程中，都能檢測(cè)到高數(shù)量的TB10.4特異性T 淋巴細(xì)胞［12－13］.目前也已有多種結(jié)核疫苗以TB10.4抗原為靶點(diǎn)，進(jìn)入了一期或二期臨床試驗(yàn)階段.HspX 是結(jié)核病病原體在潛伏感染期表達(dá)的一種抗原蛋白，接種BCG 并不能產(chǎn)生HspX 特異性T 細(xì)胞免疫反應(yīng)［14］，提示無(wú)法清除處于潛伏期內(nèi)的結(jié)核病病原體.本研究以釀酒酵母Y16為宿主，構(gòu)建了表達(dá)融合抗原TB10.4－HspX（TB10H）的重組釀酒酵母Y16－TB10H，將其熱失活后免疫小鼠，檢測(cè)小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)，評(píng)估該重組釀酒酵母的免疫效果.

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coli DH5α；釀酒酵母S.cerevisiae S1502B本實(shí)驗(yàn)室保存，簡(jiǎn)稱為Y16；大腸桿菌克隆載體PTEF－KcSP－RH 和釀酒酵母表達(dá)載體pHR－PTEF－A 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建.

1.2 試劑與材料

限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司，Blend Tap、KOD Plus PCR 擴(kuò)增酶購(gòu)自ToYoBo 公司，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 片段膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司.基因測(cè)序與引物合成在上海桑尼生物公司進(jìn)行.主要引物序列為T(mén)B10H 正向引物TB10H－F1 5'－atagatctTCGCAAATCATGTACAACTACCCC－3'；TB10H 反向引物TB10H－R1 5'－acactagtttaTCAGTTGGTGGACCGGATCTGAA－3'.

細(xì)胞因子ELISA 試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)抗體購(gòu)自eBioscience公司.Rabbit anti－TB10.4抗體購(gòu)自Abcam 公司，Goat anti－rabbit抗體和Goat anti－mouse抗體購(gòu)自ABGENT.TB10.4抗原表位肽段9AA（QIMYNYPAM）、HspX 抗原表位肽段15AA（SEFAYGSFVRTVSLP）由上海強(qiáng)耀生物公司合成.C57BL／6小鼠，雌性，6～8周，由復(fù)旦大學(xué)楓林動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心采購(gòu)和飼養(yǎng).DMEM、FBS、R／MINI1640培養(yǎng)基購(gòu)于Biowest公司.LB、SD 和YEPD 培養(yǎng)基配方見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（1996年第二版）和《酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南》（2000年第一版）.

1.3 主要儀器

AppliedBiosystems PCR 擴(kuò)增儀、Bio－Rad蛋白電泳槽、BAYGENE 蛋白電泳儀、Gene Company化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、BD Falcon流式細(xì)胞儀.

1.4 克隆構(gòu)建

大腸桿菌轉(zhuǎn)化采用42℃熱激方法，釀酒酵母轉(zhuǎn)化采用LiAC化學(xué)法，具體步驟參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（1996年第二版）和《酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南》（2000年第一版）.

從模板質(zhì)粒：pMD18－T－TB10H 上擴(kuò)增得到TB10H 融合基因片段，通過(guò)酶切連接將其克隆到大腸桿菌質(zhì)粒PTEF－KcSP－RH 上，NotⅠ酶切獲得含有釀酒酵母同源片段、信號(hào)肽、TB10H 基因片段的重組表達(dá)盒.該表達(dá)盒與酶切后的釀酒酵母表達(dá)載體pHR－PTEF－A 共轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y16，發(fā)生同源重組，在SDLeu平板（即無(wú)亮氨酸SD 選擇性培養(yǎng)基）上篩選，獲得重組釀酒酵母轉(zhuǎn)化子Y16／pHR－PTEF－TB10H，簡(jiǎn)稱為Y16－TB10H.

1.5 Western blot鑒定重組釀酒酵母表達(dá)抗原TB10H 情況

挑選菌落PCR 陽(yáng)性的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子，接于液體SD－Leu培養(yǎng)基中，30℃220r／min振搖培養(yǎng)過(guò)夜作為種子液，第二天按5%的接種量轉(zhuǎn)接入YEPD 培養(yǎng)基，繼續(xù)30℃220r／min振蕩培養(yǎng)72h，離心收集培養(yǎng)液上清與菌體，上清使用TCA 沉淀法收集蛋白樣品，菌體使用玻璃珠法破碎，離心收集破菌上清樣品，使用Rabbit anti－HspX 抗體，Western blot檢測(cè)TB10H 重組蛋白表達(dá)情況.

1.6 小鼠免疫及免疫反應(yīng)檢測(cè)

1.6.1 小鼠免疫

重組釀酒酵母70℃水浴1h熱失活.用PBS懸浮菌體至109／mL，分別用前肢皮下注射和滴鼻吸入兩種方式免疫C57BL／6小鼠，皮下注射接種量100μL，滴鼻接種量10μL.每組8只小鼠，其中4只在第一次免疫的一周后取樣，其余4只在第二次免疫的一周后取樣，兩次免疫相隔2周.設(shè)立空白對(duì)照組N／A（不對(duì)小鼠進(jìn)行任何免疫處理）；酵母對(duì)照組Y16－pHR－A（轉(zhuǎn)入未克隆抗原序列的空表達(dá)載體pHR－PTEF－A 的酵母）.具體分組情況與給藥量見(jiàn)表1.

1.6.2 小鼠血清中抗原特異性IgG ELISA 檢測(cè)

96孔板中每孔包被TB10.4和HspX 合成肽段各0.25μg，隨后使用含2%BSA 的PBS溶液封閉，加入稀釋一定倍數(shù)的血清樣品，反應(yīng)后使用PBST 清洗5～7次，二抗反應(yīng)加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，反應(yīng)后再次使用PBST 清洗5～7次，隨后每孔加100μL TMB 底物顯色，用50μL 2mol／L 硫酸終止顯色反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的OD450數(shù)據(jù)并分析.

1.6.3 小鼠脾細(xì)胞胞外細(xì)胞因子的ELISA 檢測(cè)

1）將小鼠脾臟細(xì)胞按每孔2×106個(gè)接種至24孔板中，加入培養(yǎng)液補(bǔ)足至1mL.

2）各加入10μg TB10H 肽段（其中TB10.4、HspX 各5μg）抗原刺激，37℃培養(yǎng)72h.

3）將培養(yǎng)液以1 000g離心10min，收集培養(yǎng)液上清，稀釋5倍，ELISA 檢測(cè)其中的細(xì)胞因子IFN－γ和IL－4.

ELISA 所用試劑與流程參考IFN－γ、IL－4細(xì)胞因子ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū).

1.6.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠DCs細(xì)胞分化情況

在24孔板中各接種小鼠脾臟細(xì)胞4×106個(gè)，補(bǔ)加培養(yǎng)液至2mL，并加入IL－2，37℃培養(yǎng)約36h.

首先用CD11c－FITC抗體標(biāo)記小鼠脾細(xì)胞，CD11c陽(yáng)性的細(xì)胞即為DCs細(xì)胞，隨后將每個(gè)樣品的脾細(xì)胞分為4組，分別加入CD80－PE、CD86－PE、MHCI－PE、MHCII－PE 4種PE 熒光標(biāo)記的抗體，使用流式細(xì)胞術(shù)的FITC通道和PE通道，分別檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中CD80、CD86、MHCI和MHCII陽(yáng)性DCs細(xì)胞.

表1 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)分組表Tab.1 Group dividing of the vaccination

2 結(jié)果

2.1 重組釀酒酵母構(gòu)建與鑒定

融合抗原TB10H 酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程參考文獻(xiàn)［15］.TB10H 序列長(zhǎng)度為729bp，挑選重組酵母轉(zhuǎn)化子以引物TB10H－F1／TB10H－R1進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示.1、2、3、5 號(hào) 轉(zhuǎn)化子為T(mén)B10H 陽(yáng)性克?。▽?duì)應(yīng)圖1中3、4、5、7泳道），挑選5號(hào)重組酵母轉(zhuǎn)化子，命名為Y16－TB10H，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).收集培養(yǎng)的重組酵母Y16－TB10H，Western blot鑒定融合抗原TB10H 表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示.融合抗原TB10H 預(yù)期大小約為27ku，Western blot結(jié)果表明，重組釀酒酵母Y16－TB10H 成功表達(dá)了融合蛋白TB10H，并且表達(dá)的TB10H 主要集中在胞內(nèi)，有少部分分泌至胞外.

圖1 重組釀酒酵母轉(zhuǎn)化子PCR 鑒定Fig.1 PCR identification of the recombinant yeast strains

2.2 小鼠血清樣品中TB10H 特異性IgG 抗體檢測(cè)

分別在第一次免疫和第二次免疫后一周（即第7 天和第21 天）取小鼠血清，樣品稀釋250 倍后ELISA 檢測(cè)TB10H 特異性抗體，結(jié)果如圖3所示：Y16－TB10H 皮下注射組（E 組）IgG 顯著高于對(duì)照組（A、B、C組），而Y16－TB10H 滴鼻免疫組（D 組）與對(duì)照組無(wú)差異.Y16－TB10H 皮下注射組2次免疫產(chǎn)生的IgG 高于1次免疫，但差異未達(dá)到顯著水平.

圖2 Western blot檢測(cè)重組釀酒酵母中TB10H 表達(dá)Fig.2 Western blot detection of TB10Hexpressed by the recombinant yeast

圖3 ELISA 檢測(cè)免疫小鼠血清中TB10H 特異性IgGFig.3 ELISA assay for anti－TB10HIgG in murine serum

2.3 小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子檢測(cè)

通過(guò)檢測(cè)IFN－γ和IL－4這兩種典型的Th1型和Th2 型細(xì)胞因子，判斷各組樣品能否使小鼠產(chǎn)生Th1型和Th2型免疫反應(yīng)，以及主要偏向于哪種類型，從而評(píng)估重組釀酒酵母的免疫刺激效果.各組小鼠脾細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后分泌至培養(yǎng)液中IFN－γ和IL－4檢測(cè)結(jié)果如圖4所示.

圖4 ELISA 檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞經(jīng)抗原刺激產(chǎn)生的胞外細(xì)胞因子Fig.4 ELISA assay for extracellular cytokines of antigen－stimulated mice splenocytes

Y16－TB10H 皮下注射組產(chǎn)生的IFN－γ 顯著高于對(duì)照組，但其產(chǎn)生的IL－4 與對(duì)照組無(wú)差異.Y16－TB10H 滴鼻免疫組無(wú)論IFN－γ還是IL－4均與對(duì)照組無(wú)差異.說(shuō)明Y16－TB10H 皮下注射免疫方式可以刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子IFN－γ，但并不能有效刺激產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子IL－4，即小鼠發(fā)生Th1型免疫應(yīng)答.作為對(duì)照，伴刀豆球蛋白（ConA）能夠刺激小鼠脾細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生IFN－γ和IL－4，沒(méi)有偏向性。

2.4 小鼠DCs細(xì)胞分化情況檢測(cè)

CD11c為DCs細(xì)胞表面的特異性分子，CD11c陽(yáng)性即為DCs細(xì)胞.CD80、CD86為成熟分化的DCs細(xì)胞表面共刺激分子，MHCI和MHCII是DCs細(xì)胞表面抗原遞呈分子.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD11c＋／CD80＋、CD11c＋／CD86＋、CD11c＋／MHCI＋和 CD11c＋／MHCII＋細(xì)胞，可以了解DCs細(xì)胞分化情況.各組小鼠脾臟細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果如圖5所示：與對(duì)照組比較，重組酵母Y16－TB10H無(wú)論是滴鼻免疫（D 組）還是皮下注射免疫（E組）均顯著提高CD80、CD86、MHCI和MHCII陽(yáng)性的DCs細(xì)胞比例，說(shuō)明重組釀酒酵母Y16－TB10H 具有促進(jìn)小鼠DCs細(xì)胞分化成熟和增強(qiáng)其抗原遞呈能力的刺激效果.

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫小鼠DCs分化變化Fig.5 Flow cytometric analysis of dendritic cells'surface markers

3 討論

本研究使用表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原的重組釀酒酵母Y16－TB10H 以不同途徑免疫小鼠，皮下注射免疫后，小鼠血清中TB10H 抗原特異性IgG 抗體顯著增加，說(shuō)明重組酵母能夠激發(fā)小鼠抗原特異性體液免疫應(yīng)答；小鼠脾細(xì)胞針對(duì)TB10H 的刺激，分泌產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子IFN－γ，但不產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子IL－4，說(shuō)明重組酵母能夠有效激發(fā)小鼠Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答.研究還發(fā)現(xiàn)重組酵母能夠刺激DCs成熟分化和抗原遞呈作用.黏膜免疫對(duì)于結(jié)核病這種經(jīng)呼吸道途徑感染疾病防護(hù)至關(guān)重要.本研究試圖探討重組酵母以滴鼻方式通過(guò)黏膜途徑的免疫效果，但未檢測(cè)到抗原特異的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答.

上述研究結(jié)果初步說(shuō)明重組酵母Y16－TB10H 具有通過(guò)專職抗原遞呈細(xì)胞DCs途徑激活小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性免疫應(yīng)答的潛力，但不同的免疫方式產(chǎn)生的效果差異很大，該重組酵母作為一種新型的抗結(jié)核疫苗形式具有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值.

后續(xù)擬繼續(xù)開(kāi)展的研究工作有：檢測(cè)包括Il－2、TNF－α等在內(nèi)更多的細(xì)胞因子，全面系統(tǒng)地了解重組酵母免疫后小鼠免疫系統(tǒng)應(yīng)答變化；殺傷性T 淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T Lymphocyte，CTL）實(shí)驗(yàn)和攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn).DCs通過(guò)MHCI途徑激活CTL.CTL實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从硽訲 淋巴細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性作用，這對(duì)于清除病原體非常關(guān)鍵［16－17］.而攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)?zāi)苤庇^反映疫苗的總體免疫效果，考察其在實(shí)際應(yīng)用中的意義.由于一定的實(shí)驗(yàn)條件限制，本研究中并未進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，但對(duì)于該重組酵母疫苗功效的評(píng)價(jià)是不可或缺的指標(biāo).

重組釀酒酵母作為疫苗應(yīng)用需要關(guān)注一個(gè)問(wèn)題，即酵母表達(dá)的抗原可能被過(guò)度糖基化，無(wú)法保證其免疫原性與原始抗原相同，有可能造成重組釀酒酵母刺激產(chǎn)生的抗原特異性免疫反應(yīng)不一定對(duì)于原病原菌完全有效［18－19］.在本研究中，用于檢測(cè)的抗原為人工合成的包含抗原表位的15個(gè)氨基酸殘基的小肽，因此得出的結(jié)果與野生型抗原之間具有一致性，如果使用的檢測(cè)抗原為重組酵母所表達(dá)純化的抗原，則需注意考察該一致性問(wèn)題.目前，在畢赤酵母中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了通過(guò)敲除一系列特定基因而消除其過(guò)度糖基化的機(jī)制.本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)構(gòu)建過(guò)敲除Och1基因（釀酒酵母蛋白質(zhì)糖基化過(guò)程第一步所需酶的編碼基因）的釀酒酵母，如果釀酒酵母的過(guò)度糖基化被阻斷，則將解決重組釀酒酵母疫苗的一個(gè)重要問(wèn)題，極大提高重組釀酒酵母作為新型疫苗應(yīng)用的可能性.

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