高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中缺氧對(duì)胰島素抵抗及脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤的影響

張莉亞 苗 青 李益明 葉紅英

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院內(nèi)分泌科 上海 200040）

肥胖及其相關(guān)性疾病嚴(yán)重威脅著人類健康。肥胖主要的病理生理改變?yōu)橹炯?xì)胞增大、脂肪組織分泌功能異常、巨噬細(xì)胞浸潤等，是肥胖致胰島素抵抗的重要因素。但肥胖致胰島素抵抗的始動(dòng)因素、巨噬細(xì)胞浸潤增加的機(jī)制尚未完全闡明。

肥胖狀況下，白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）的分泌功能發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為炎性介質(zhì)分泌顯著增加和具有抗炎作用的脂聯(lián)素分泌減少，被認(rèn)為是肥胖致胰島素抵抗的機(jī)制之一［1］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肥胖時(shí)這些炎性介質(zhì)主要由浸潤于脂肪組織的巨噬細(xì)胞分泌［2］。在肥胖狀態(tài)下，脂肪組織是局部持續(xù)性激活巨噬細(xì)胞的炎癥部位，表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞特征性地圍繞個(gè)別脂肪細(xì)胞成冠狀而不是分散在脂肪細(xì)胞間，被巨噬細(xì)胞圍繞的脂肪細(xì)胞呈特征性縮?。?－4］。

2007年，Ye等［5－6］首次發(fā)現(xiàn)ob／ob小鼠和高脂飲食誘導(dǎo)肥胖（diet－induced obesity，DIO）小鼠的脂肪組織存在局部缺氧并伴隨炎性因子表達(dá)增加和脂聯(lián)素表達(dá)降低。此后有多項(xiàng)研究在肥胖模型鼠及肥胖人群中都證實(shí)了其脂肪組織存在缺氧的現(xiàn)象［7－14］。Rausch等［13］證實(shí)高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖小鼠的脂肪組織存在局部缺氧，且缺氧區(qū)域出現(xiàn)包繞脂肪細(xì)胞的F4／80陽性的巨噬細(xì)胞浸潤。但肥胖時(shí)脂肪組織缺氧是否是胰島素抵抗、巨噬細(xì)胞浸潤的始動(dòng)因素仍不明確。

因此，我們利用DIO小鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察高脂飲食（high－fat diet，HFD）小鼠各時(shí)間點(diǎn)（4、8、12 w）病理生理特點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化，明確缺氧是否為肥胖時(shí)脂肪組織胰島素抵抗和巨噬細(xì)胞浸潤的始動(dòng)因素。

材料和方法

藥品與試劑 超敏小鼠胰島素ELISA試劑盒購自瑞典Mercodia公司；4%甲醛溶液、二甲苯、無水乙醇、伊紅、蘇木精均購自上?；び邢薰荆籉4／80單抗購自美國 R＆D公司；hypoxyprobeTM－1試劑盒購自美國Chemicon公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)4周齡C57BL／6J雄性小鼠60只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，按照SPF（無特定病原體動(dòng)物）級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料（10%熱卡來自脂肪）及高脂飼料（60%熱卡來自脂肪）購自美國Research Diets公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)飼料組（CON）和HFD組，每組各30只。每周監(jiān)測攝食量、體質(zhì)量、空腹血糖。飲食干預(yù)后第4、8、12周時(shí)間點(diǎn)，兩組小鼠禁食不禁水6 h后稱重，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并在上述時(shí)間點(diǎn)處死CON組及HFD組小鼠各10只。

腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠糖代謝 采用50%注射用葡萄糖，按2．5 g／kg體質(zhì)量進(jìn)行腹腔注射。注射前和注射后15、30、60、90 min分別尾尖采全血，用拜耳拜安易血糖儀測定血糖（德國拜耳公司，檢測高限30．5 mmol／L，血糖顯示高者按30．5 mmol／L計(jì)算。腹腔注射葡萄耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitioneal ghrcose tolerance test，ipGTT）曲線下面積計(jì)算公式：AUCipGTT（min·mmol／L）＝30 min×［1／2×（BG0＋BG90）＋1×（BG15＋BG30＋BG60）］。

評(píng)價(jià)WAT量及其與體質(zhì)量的比值 ipGTT2日后禁食不禁水6 h，摘眼球取血后，分離附睪脂肪，記錄重量，4%甲醛溶液固定，液氮凍存。分離血樣得血清后－80℃凍存待用。

ELISA檢測血清胰島素 根據(jù)胰島素試劑盒操作手冊測定血清胰島素水平，并依據(jù)HOMA模型計(jì)算胰島素抵抗指數(shù) HOMA－IR，HOMA－IR＝FBG （mmol／L）×FINS（μg／L）／22．5。

鏡下觀察脂肪細(xì)胞大小 取兩組小鼠的附睪脂肪組織，4%甲醛溶液（pH＝7．0）固定后，進(jìn)行組織處理、石蠟包埋、切片，HE染色。用Image pro plus（IPP）6．0軟件分析脂肪細(xì)胞的平均直徑，以分析不同時(shí)間點(diǎn)脂肪細(xì)胞大小的動(dòng)態(tài)變化。

免疫組化染色檢測脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤 取兩組小鼠的附睪脂肪組織石蠟切片，用巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記物F4／80抗體進(jìn)行免疫組化，DAB顯色，以顯示脂肪組織中的巨噬細(xì)胞。

免疫組化染色檢測脂肪組織缺氧情況 采用hypoxyprobeTM－1試劑盒對(duì)兩組小鼠的附睪脂肪組織石蠟切片進(jìn)行哌莫硝唑標(biāo)記的免疫組化，DAB顯色，以檢測細(xì)胞缺氧情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11．5軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組之間采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組間采用Wilcoxon檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

HFD組和CON組小鼠體質(zhì)量的動(dòng)態(tài)變化HFD組與CON組小鼠的基礎(chǔ)體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．5029）；隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長，兩組小鼠體質(zhì)量均增加；4周時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．2153）；8周時(shí)間點(diǎn)HFD組體質(zhì)量顯著高于CON組（P＜0．001），12周時(shí)間點(diǎn)兩組體質(zhì)量差異進(jìn)一步增大（表1）。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠體質(zhì)量比較Tab 1 Comparison of body weight at different weeks of HFD group and CON group （±s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠體質(zhì)量比較Tab 1 Comparison of body weight at different weeks of HFD group and CON group （±s）

BW （g）CON group HFD group P 0wk 15．1±1．05 15．3±1．24 0．502 9 4 wk 25．7±1．06 26．5±1．66 0．215 3 8 wk 27．1±1．97 34．7±3．06 0 12 wk 29．2±1．40 40．2±2．70 0

HFD組和CON組小鼠WAT重量與體質(zhì)量比值的動(dòng)態(tài)變化 CON組附睪脂肪重量與體質(zhì)量的比值（Wepi／BW）在各時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化，而HFD組進(jìn)行性增加。兩組相比，HFD組 Wepi／BW在4周時(shí)間點(diǎn)即顯著高于CON組（P＜0．001），在8周和12周時(shí)間點(diǎn)兩組差異進(jìn)一步增大（表2）。如果按脂肪比例增加為判斷標(biāo)準(zhǔn)，HFD組在HFD4周時(shí)即已出現(xiàn)肥胖。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠附睪脂肪重量與體質(zhì)量的比值比較Tab 2 Comparison of the ratio of epididymal fat weight to body weight at different weeks of HFD group and CON group （±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠附睪脂肪重量與體質(zhì)量的比值比較Tab 2 Comparison of the ratio of epididymal fat weight to body weight at different weeks of HFD group and CON group （±s）

Wepi／BW （%）CON group HFD group P 4 wk 1．17±0．25 2．90±0．81 0 8 wk 1．16±0．31 5．15±0．75 0 12 wk 1．28±0．30 5．37±0．77 0

HFD組和CON組小鼠糖耐量及胰島素抵抗水平的動(dòng)態(tài)變化 4周時(shí)間點(diǎn)HFD組的AUCipGTT即顯著高于CON組（P＜0．001），提示4周時(shí)間點(diǎn)即已經(jīng)存在明顯糖耐量異常；在8和12周時(shí)間點(diǎn)兩組間糖耐量差異進(jìn)一步增大（表3）。4周時(shí)間點(diǎn)，兩組間HOMA－IR水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．505 1）；8周時(shí)間點(diǎn) HFD組 HOMA－IR水平顯著高于CON組（P＜0．001），12周時(shí)間點(diǎn)兩組HOMA－IR水平的差異進(jìn)一步增大（表4）。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠的AUCipaTT比較Tab 3 Comparison of AUCipGTTat different weeks of HFD group and CON group （±s）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠的AUCipaTT比較Tab 3 Comparison of AUCipGTTat different weeks of HFD group and CON group （±s）

AUCipGTT（min·mmol／L）CON group HFD group P 4 wk 58．62±7．41 85．075±7．88 0 8 wk 55．595±9．85 99．845±9．24 0 12 wk 54．505±9．34 103．52±15．14 0

表4 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠的胰島素抵抗水平比較Tab 4 Comparison of HOMA－IR at different weeks of HFD group and CON group （±s）

表4 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠的胰島素抵抗水平比較Tab 4 Comparison of HOMA－IR at different weeks of HFD group and CON group （±s）

HOMA－IR CON group HFD group P 4 wk 0．8±0．22 0．72±0．3 0．5051 8 wk 0．52±0．29 1．9±0．69 0 12 wk 0．81±0．23 3．03±1．37 0

HFD組和CON組小鼠脂肪細(xì)胞體積的動(dòng)態(tài)變化 在不同時(shí)間點(diǎn)，CON組脂肪細(xì)胞的直徑無明顯變化，而HFD組進(jìn)行性增大。4周時(shí)間點(diǎn)HFD組附睪脂肪組織的細(xì)胞大小即大于CON組，在8和12周時(shí)間點(diǎn)兩組脂肪細(xì)胞大小的差異進(jìn)一步增大（圖1）。

HFD組和CON組小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤的動(dòng)態(tài)變化 F4／80為巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，表達(dá)F4／80的巨噬細(xì)胞內(nèi)可見黃褐色顆粒沉淀，而其他細(xì)胞則不被染色。在12周時(shí)HFD組附睪脂肪組織F4／80陽性染色的巨噬細(xì)胞浸潤較CON組增加，且呈聚集現(xiàn)象，包繞一個(gè)直徑明顯小于周圍細(xì)胞的脂肪細(xì)胞（圖2）。

HFD組和CON組小鼠脂肪組織脂肪組織缺氧狀況的動(dòng)態(tài)變化 12周時(shí)間點(diǎn)HFD組哌莫硝唑陽性染色的脂肪細(xì)胞較CON組增加，證實(shí)HFD組小鼠附睪脂肪組織局部存在缺氧，而在4和8周時(shí)間點(diǎn)未顯示哌莫硝唑陽性染色（圖3）。

討 論

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠附睪脂肪細(xì)胞大小Fig 1 The size of adipose cells of epididymal fat at different weeks of HFD group and CON group

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠附睪脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤情況Fig 2 The macrophage infiltration into epididymal fat at different weeks of HFD group and CON group

DIO小鼠模型被廣泛用于肥胖和胰島素抵抗為特點(diǎn)的代謝綜合征及相關(guān)疾病的研究。本研究選用60%熱卡來自脂肪的高脂喂養(yǎng)5周齡C57BL／6J小鼠，利用簡單的動(dòng)態(tài)觀察有效地展現(xiàn)了DIO小鼠的體質(zhì)量、WAT重量與體質(zhì)量的比值、糖耐量及胰島素抵抗?fàn)顩r、缺氧、脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤的動(dòng)態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，盡管4周時(shí)HFD組小鼠的體質(zhì)量無顯著升高，但已出現(xiàn)脂肪細(xì)胞直徑增大及Wepi／BW顯著升高。而脂肪組織比例的增加正是肥胖的關(guān)鍵要素，如果按脂肪比例增加為判斷標(biāo)準(zhǔn)，HFD組在4周時(shí)即已肥胖；在8和12周時(shí)HFD組小鼠的平均體質(zhì)量較對(duì)照組分別增高28%和37．7%，達(dá)到了體質(zhì)量增加20%的肥胖建模標(biāo)準(zhǔn)。另外，4周時(shí)HFD組小鼠的AUGCipGTT即顯著高于對(duì)照組，提示在4周時(shí)即已存在明顯的糖耐量異常；在8周時(shí)HFD組小鼠HOMA－IR水平較對(duì)照組顯著升高，提示在8周時(shí)存在明顯的胰島素抵抗。

哌莫硝唑因其特殊的化學(xué)性質(zhì)可以作為缺氧化學(xué)探針，哌莫硝唑在缺氧環(huán)境（PO2＜10 mmHg）中和蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生新蛋白質(zhì)化合物［7］，標(biāo)記這些新生成的蛋白質(zhì)并根據(jù)標(biāo)記信號(hào)的強(qiáng)弱可反映缺氧狀況。F4／80是巨噬細(xì)胞的特異性表達(dá)抗原，利用F4／80抗體對(duì)脂肪組織行免疫組化染色可以將巨噬細(xì)胞與其他脂肪組織間質(zhì)細(xì)胞鑒別［4］。本研究分別用哌莫硝唑和F4／80為標(biāo)記對(duì)DIO小鼠的附睪脂肪組織進(jìn)行了免疫組化染色。我們的研究結(jié)果顯示，脂肪組織缺氧和巨噬細(xì)胞浸潤增加同步出現(xiàn)在HFD后12周時(shí)間點(diǎn)，遲于糖代謝異常和胰島素抵抗的出現(xiàn)。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)HFD組和CON組小鼠附睪脂肪組織缺氧情況Fig 3 The existence of hypoxia of epididymal fat at different weeks of HFD group and control group

Ye等［5］僅對(duì)肥胖模型的12周時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了觀察，只能觀察到胰島素抵抗、脂肪因子分泌變化、巨噬細(xì)胞浸潤、缺氧等病理生理變化同時(shí)存在，提示了相關(guān)性，但卻無法回答其中可能的因果關(guān)系。Elias等［15］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子的脂肪組織可通過增加氧供而改善胰島素抵抗，但并未闡明缺氧是否啟動(dòng)了胰島素抵抗的發(fā)生。而我們的研究通過動(dòng)態(tài)觀察提示了各種病理生理改變的時(shí)間先后關(guān)系，至少可以得出結(jié)論---缺氧可能不是HFD致糖代謝異常和胰島素抵抗的啟動(dòng)因素。

巨噬細(xì)胞作為炎性因子的經(jīng)典來源，其在肥胖和代謝疾病發(fā)生機(jī)制中的作用已越來越受到關(guān)注。多項(xiàng)研究表明，只有在肥胖個(gè)體的脂肪組織中才出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤而正常個(gè)體并沒有這種現(xiàn)象［4，16］。在肥胖發(fā)展過程中，脂肪組織中的巨噬細(xì)胞浸潤呈漸進(jìn)性，其數(shù)量甚至可達(dá)到脂肪組織細(xì)胞總數(shù)的40%，而這種增多與胰島素抵抗密切相關(guān)［17］。相反，體質(zhì)量減輕則會(huì)減少巨噬細(xì)胞浸潤、改善胰島素抵抗［18］。此外，采用特異性基因敲除阻斷巨噬細(xì)胞的炎癥信號(hào)通路也可改善肥胖小鼠的胰島素抵抗［19］。然而，對(duì)于造成肥胖個(gè)體脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤的原因，目前尚不明確，可能與脂肪細(xì)胞增生與肥大導(dǎo)致的脂肪細(xì)胞因子異常分泌、局部脂肪組織缺氧狀態(tài)及營養(yǎng)性內(nèi)毒素血癥有關(guān)。而我們的研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織缺氧和巨噬細(xì)胞浸潤增加同步出現(xiàn)在同一時(shí)間點(diǎn)，提示缺氧與巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān)，前者可能是后者的原因、伴隨現(xiàn)象或加重因素。

為了進(jìn)一步研究脂肪組織缺氧與巨噬細(xì)胞浸潤的關(guān)系，我們后續(xù)建立了體外間歇缺氧的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)體外間歇缺氧改變脂肪組織多種脂肪因子基因表達(dá)但脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞并未增加。此外，我們開展的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常培養(yǎng)相比，體外缺氧（1%O2）環(huán)境下的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)單核細(xì)胞的趨化作用未增加。以上研究結(jié)果提示肥胖時(shí)脂肪組織缺氧可能并非巨噬細(xì)胞浸潤的始動(dòng)因素。但缺氧與肥胖時(shí)脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤的關(guān)系仍待進(jìn)一步研究。

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