谷成英 賀艷菊 王朝迅 曾藝鵬 周里鋼
(復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院內(nèi)分泌科 上海 201399)
追趕生長(zhǎng)是指營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制在營(yíng)養(yǎng)恢復(fù)后可出現(xiàn)代償性生長(zhǎng),在發(fā)展中國(guó)家普遍存在。動(dòng)物研究表明,追趕生長(zhǎng)大鼠發(fā)生基因的表觀遺傳學(xué)改變,如肝細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1,PGC-1)和肉毒堿脂?;D(zhuǎn)移酶的基因組蛋白H3/K9乙?;皆黾?,可引起PGC-1α的增加及肉毒堿脂?;D(zhuǎn)移酶表達(dá)降低,可導(dǎo)致肝糖輸出增加及肝細(xì)胞脂肪酸B氧化障礙,引起肝臟糖脂代謝紊亂[1-2]及脂肪肝,后者是我國(guó)2型糖尿病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此,研究追趕生長(zhǎng)導(dǎo)致2型糖尿病的機(jī)制對(duì)于我國(guó)2型糖尿病的早期防治至關(guān)重要。SIRT1通過(guò)感受細(xì)胞內(nèi)NAD+水平而活性受到調(diào)節(jié),具有組蛋白去乙酰化和非組蛋白去乙?;饔茫墙M蛋白包括PGC-1α/過(guò)氧化物酶體增殖活化受體α(peroxisome proliferator activated receptorα,PPARα)、核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)等分子[3]。主要在肝細(xì)胞合成的糖脂代謝調(diào)節(jié)因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21,F(xiàn)GF21),通過(guò)作用于肝細(xì)胞 PPAR-α受體而受到調(diào)節(jié)[4-5],調(diào)節(jié)FGF21可通過(guò)磷酸化的ERK1/2/GLUT1信號(hào)通路而改善肝細(xì)胞胰島素抵抗,可促進(jìn)胰腺胰島素的分 泌[6]。因此,SIRT1-PPARα/PGC-1α-FGF21 或SIRT1/NF-κB的作用環(huán)節(jié)可反應(yīng)肝細(xì)胞乙?;瘜?duì)肝臟糖脂代謝、免疫炎性反應(yīng)和胰島素分泌過(guò)程的影響。追趕生長(zhǎng)狀態(tài)下,SIRT1如何通過(guò)肝臟乙?;接绊懸葝u素抵抗及SIRT1在飲食干預(yù)中的作用如何,其機(jī)制不明。因此,本研究以普通飲食為對(duì)照組,通過(guò)觀察肝細(xì)胞 SIRT1-PPARα/PGC-1α及下游相關(guān)分子的變化,研究追趕生長(zhǎng)導(dǎo)致脂肪肝改變、胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂的影響機(jī)制以及低熱卡飲食的干預(yù)機(jī)制,這對(duì)于防止2型糖尿病的發(fā)生有著重要意義。
動(dòng)物模型 6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量140~160 g,飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,室溫控制在(22±1)℃,晝夜節(jié)律為12 h:12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,分別單籠喂養(yǎng),自由飲水。大鼠隨機(jī)分為3組,即對(duì)照組8只,高脂追趕生長(zhǎng)模型組(簡(jiǎn)稱(chēng)模型組)8只,飲食干預(yù)組8只。對(duì)照組一直以普通飼料喂養(yǎng)。追趕生長(zhǎng)模型在適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束以后,改喂以60%熱卡限制的普通飼料4周,普通飲食的熱能構(gòu)成比為:蛋白質(zhì)22.4%,脂肪11.8%,碳水化合物65.8%;之后給予高脂飼料,分為模型和飲食干預(yù)組,模型組隨后一直給予高脂飲食;飲食干預(yù)組在限食4周后給與高脂飲食喂養(yǎng)6周,然后恢復(fù)到普通飲食喂養(yǎng),自由進(jìn)食6周。高脂飼料營(yíng)養(yǎng)成分中,粗蛋白、脂肪及碳水化合物含量(百分比)分別為21.3(19%)、21(42%)和43.8(39%)。普通飲食與高脂飼料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。
口服葡萄糖耐量和胰島素釋放功能實(shí)驗(yàn) 大鼠禁食15 h,按2 g/kg 50%葡萄糖灌胃做口服葡萄糖耐量測(cè)試(oral glucose tolerance test,OGTT)。用美國(guó)羅氏血糖儀檢測(cè)0、15、30、60、120 min時(shí)的血糖,并用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)其血清胰島素水平,計(jì)算葡萄糖曲線下面積、胰島素曲線下面積、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);殺鼠前1周同樣方法做OGTT、胰島素釋放功能實(shí)驗(yàn)(the insulin release test,IRT)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)肝功能、血脂、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HBA1C)??偰懝檀迹╰otal cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low densith lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)及游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)以酶法檢測(cè),HBA1C以高壓液相法檢測(cè)。
動(dòng)物處理 每周稱(chēng)重1次,計(jì)算各組大鼠生長(zhǎng)中體質(zhì)量變化,描繪各組大鼠生長(zhǎng)曲線,觀察限食期間及開(kāi)放飲食期間,各組大鼠的生長(zhǎng)特點(diǎn);處死前1周行OGTT(羅氏卓越血糖檢測(cè)儀)和IRT(ELISA方法)。處死前大鼠稱(chēng)重,禁食12h后,腹腔注射20%烏拉坦(5 mL/kg體質(zhì)量)麻醉動(dòng)物,固定,局部消毒后打開(kāi)腹腔,從腹主動(dòng)脈采血,室溫下放置約10 min后,2 000×g離心10 min,取上清至無(wú)菌EP管中,-20℃保存,留取血樣查谷丙轉(zhuǎn)氨酶、HBA1C、TG、TC、LDL、HDL、FFA;迅速分離肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪,在無(wú)菌條件下稱(chēng)肝臟濕重,計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟重量與大鼠體質(zhì)量的比值),取附睪與腎周脂肪稱(chēng)重,計(jì)算內(nèi)臟體脂,即:(附睪脂肪+腎周脂肪)與大鼠體質(zhì)量比值;取部分肝臟用4%的甲醛固定,留作石蠟包埋、切片后的肝臟HE染色;每組取兩只大鼠肝臟組織以戊二醛固定,留作透射電鏡觀察肝臟超微結(jié)構(gòu);取另一部分肝臟放置-70℃保存。
肝細(xì)胞SIRT1、FGF21、NF-KB蛋白含量 以Western blot檢測(cè);抗SIRT1抗體(批號(hào):ab110304,英國(guó)Abcam公司);抗FGF21抗體(批號(hào)LS-B5864,美國(guó)LifeSpan BioSciences公司);抗NF-κB p65抗體(批號(hào):sc-372,美國(guó)santa cruz biotechnology公司)。
real-time PCR檢測(cè)PPAR-α、PGC-1α基因 mRNA表達(dá)水平 大鼠肝細(xì)胞PPAR-α、PGC-1α分子引物序列 如 下:PGC-1α:5′-CGCACAACTCAGCAAGTCCTC-3′ (正向),5′-CCTTGCTGGCCTCCAAAGTCTC-3′(反向 )。PPAR-α:5′-GTGGCTGCTATAATTTGCTGTG-3′(正 向 ),5′-GAAGGTGTCATCTGGATGGGT(反向)。real-time PCR實(shí)驗(yàn)用 T熒光定量PCR試劑盒(中國(guó)寶生物工程大連有限公司),按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。
胰島素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血脂的檢測(cè) 采用ELISA方法檢測(cè)胰島素,批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于10%;谷丙轉(zhuǎn)氨酶以IFCC法檢測(cè)胰島素,TG、TC及FFA以酶法檢測(cè),HBA1C采用高壓液相法檢測(cè),均由德國(guó)羅氏診斷公司提供;LDL及HDL以免疫分離法檢測(cè),由日本第一化學(xué)藥品株式會(huì)社提供試劑盒。
電鏡技術(shù) 取肝臟切成1 mm3小塊固定于2%戊二醛固定液,反復(fù)洗滌后用1%鋨酸溶液作用后固定,酒精系列脫水,環(huán)氧樹(shù)脂包埋,LKB超薄切片機(jī)切片,醋酸鈾與檸檬酸鉛染色,H-600型電子顯微鏡觀察與照相。切片制作及顯微鏡觀察和照相均在上海中醫(yī)藥大學(xué)病理科完成。
葡萄糖、胰島素曲線面積及HOMA-IR的計(jì)算葡萄糖曲線下面積和胰島素曲線下面積的計(jì)算依據(jù)不規(guī)則梯形公式。HOMA-IR=空腹胰島素(uIU/mL)×空腹血漿血糖(mmol/L)÷22.5。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 18軟件分析檢驗(yàn)資料的正態(tài)性和方差齊性,非正態(tài)分布的資料進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換使其符合正態(tài)分布,數(shù)據(jù)以±s表示,兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖表的制作在Graphpad Prism5上完成。
大鼠能量吸收及生長(zhǎng)情況 按照每周稱(chēng)重得到的生長(zhǎng)曲線顯示,追趕生長(zhǎng)大鼠組在60%限食期間生長(zhǎng)停滯,開(kāi)放高脂飲食后1周出現(xiàn)快速增長(zhǎng),干預(yù)前模型組體質(zhì)量增長(zhǎng)仍不及對(duì)照組,但此后持續(xù)增長(zhǎng),明顯大于其他組(動(dòng)物處理前3周模型組與對(duì)照組比較P值分別為0.038,0.05,0.031)?;謴?fù)正常飲食的追趕生長(zhǎng)大鼠,即飲食干預(yù)組,體質(zhì)量明顯低于模型組(動(dòng)物處理前4周P值分別為0.034,0.001 6,0.003,0.002 7,圖1)。
圖1 大鼠生長(zhǎng)曲線Fig 1 Growth curve of rats
OGTT及IRT結(jié)果 大鼠追趕生長(zhǎng)早期OGTT及IRT實(shí)驗(yàn)顯示,追趕生長(zhǎng)組大鼠60 min血糖明顯高于對(duì)照組(P=0.011),120 min仍未回到餐前狀態(tài);其胰島素水平低平,胰島素曲線下面積明顯降低(P=0.012,表1);干預(yù)結(jié)束時(shí)模型組空腹胰島素明顯增高,胰島素曲線下面積明顯增高(P均值為0.006)。各組葡萄糖曲線下面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2);模型組HOMA-IR明顯高于對(duì)照組(P=0.026),飲食干預(yù)明顯改善空腹胰島素、胰島素曲線下面積及HOMA-IR(P值分別為0.033,0.037,0.039,表2)。
表1 大鼠追趕生長(zhǎng)早期葡萄糖耐量試驗(yàn)及胰島素釋放功能特點(diǎn)分析Tab 1 The analysis of glucose tolerance test and insulin release function in the earlier period of catch-up growth in rats
表2 飲食干預(yù)對(duì)追趕生長(zhǎng)大鼠糖脂代謝、胰島素抵抗、肝功能及內(nèi)臟脂肪、肝臟指數(shù)的影響Tab 2 Effect of dietary intervention on glucose and lipid metabolism,insulin resistance,liver function,visceral fat and liver index in rats with catch-up growth (±s)
表2 飲食干預(yù)對(duì)追趕生長(zhǎng)大鼠糖脂代謝、胰島素抵抗、肝功能及內(nèi)臟脂肪、肝臟指數(shù)的影響Tab 2 Effect of dietary intervention on glucose and lipid metabolism,insulin resistance,liver function,visceral fat and liver index in rats with catch-up growth (±s)
TG:Triglyceride;TC:Total cholesterol;FFA:Free fatty acid;ALT:The natural logarithm of alanine amiotransferase;HBA1C:Glycosylated hemoglobin;FPG:Fasting plasma glucose;FIN:The natural logarithm of fasting insulin;HOMA-IR:Insulin resistance index;AUCG:The area under glucose curve;AUCIN:The area under insulin curve;Liver weight:Wet liver weight;P1:Pvalue of CUGFR group vs.NC group;P2:P value of Diet-G group vs.CUGFR group.
Item(unit)NC CUGFR Diet-G P1 P2 TG(mmol/L)0.768±0.13 0.815±0.27 0.972±0.10 0.710 0.250±0.29 1.766±0.66 0.690 0.470 TC(mmol/L)1.464±0.411.545 LDL-C (mmol/L) 0.193±0.12 0.538±0.20 0.22±0.16 0.006 0.020 HDL-C (mmol/L) 1.133±0.40 0.925±0.10 1.558±0.48 0.198 0.011 FFA (mmol/L) 0.466±0.11 0.345±0.08 0.612±0.19 0.031 0.011 ALT (IU/L) 3.49±0.07 4.10±0.38 3.74±0.14 0.004 0.083 HBA1c/% 3.85±0.11 3.86±0.10 3.83±0.09 0.850 0.550 FPG (mmol/L) 6.58±1.19 6.0±0.37 6.73±0.69 0.280 0.059 FIN (ng/mL) 1.575±0.340 2.429±0.387 1.401±0.803 0.006 0.033 HOMA-IR 1.75±0.98 3.22±1.30 1.59±0.69 0.026 0.039 AUCG (mmol/L) 1171.42±83.93 1163.5±46.81 1284.13±150.14 0.875 0.096 AUCIN (ng/mL) 80.39±44.04 185.48±46.68 104.17±55.34 0.006 0.037 Weight(g) 774.5±39.2 786±48.3 674.6±33.1 0.101 0.002 Liver weight(g) 17.14±1.78 31.67±2.47 17.96±1.9 0.000 0.000 Liver index 2.31±0.25 4.03±0.17 2.66±0.22 0.000 0.000 Visceral fat(g) 31.94±6.41 42.55±10.62 25.4±7.57 0.038 0.015 Visceral fat index 4.29±0.82 5.40±1.24 3.75±1.07 0.018 0.015
飲食干預(yù)對(duì)糖脂代謝及肝功能的影響 高脂飲食喂養(yǎng)的模型組,LDL-C明顯增高(P=0.006),游離脂肪酸明顯降低(P=0.031)。低熱卡的飲食干預(yù)組,LDL-C明顯降低(P=0.02),HDL、游離脂肪酸較模型組明顯增高(P=0.011)。追趕生長(zhǎng)后期模型組糖化血紅蛋白較對(duì)照組無(wú)明顯異常(P=0.85)。追趕生長(zhǎng)后期有輕度肝功能不良,模型組谷丙轉(zhuǎn)氨酶較對(duì)照組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004),飲食干預(yù)組有減輕肝功能異常的趨勢(shì)(P=0.083),但較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。
追趕生長(zhǎng)對(duì)內(nèi)臟脂肪及肝臟指數(shù)的影響及飲食的干預(yù)作用:與正常對(duì)照組比較,追趕生長(zhǎng)大鼠肝臟濕重、肝臟指數(shù)、內(nèi)臟脂肪、內(nèi)臟脂肪指數(shù)均明顯增加(P 分別為0.000,0.000,0.038,0.018),而在飲食干預(yù)下上述指標(biāo)可明顯減少(P分別為0.000,0.000,0.015,0.015,表2)。
飲食干預(yù)對(duì)追趕生長(zhǎng)大鼠肝臟病理及超微結(jié)構(gòu)的影響 肝臟HE染色顯示:模型組大鼠肝組織內(nèi)大量的脂滴沉積,有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),飲食干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù),仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),未見(jiàn)明顯脂滴(圖2)。
肝臟透射電鏡顯示:模型組大鼠脂滴多,可融合,線粒體脊多消失,線粒體膜消失;核膜不完整,可見(jiàn)核膜孔,飲食干預(yù)組脂滴很少,線粒體嵴可見(jiàn),但排列紊亂,內(nèi)可見(jiàn)脂質(zhì)包涵體及空泡,核膜較厚但完整,核居邊(圖2)。
追趕生長(zhǎng)大鼠NF-κB、SIRT1、FGF21、PPAR-α、PGC-1α相關(guān)分子異常及飲食干預(yù) 追趕生長(zhǎng)大鼠NF-κB明顯增高(P=0.036),而SIRT1、FGF21蛋白及PPAR-α基因表達(dá)明顯降低(P分別為0.041,0.048,0.035),PGC-1α表達(dá)增加(P=0.129),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。飲食干預(yù)可明顯增加SIRT1水平(P=0.034),對(duì)FGF21、NF-κB、PPAR-α、PGC-1α的影響則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、4)。
中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家在經(jīng)歷嚴(yán)重饑荒40~50年后出現(xiàn)2型糖尿病患病率的大幅增長(zhǎng)[7-8],提示飲食缺乏因素可能會(huì)對(duì)整個(gè)國(guó)家人群的基因產(chǎn)生影響。因而在此背景下存在著大量飲食缺乏生長(zhǎng)抑制后的快速生長(zhǎng),即追趕生長(zhǎng)現(xiàn)象。近年來(lái),越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為,肝臟是2型糖尿病發(fā)病的源頭,脂肪肝是2型糖尿病的危險(xiǎn)因素,但追趕生長(zhǎng)導(dǎo)致肝臟糖脂代謝紊亂及脂肪肝的機(jī)制至今未明。
圖2 肝細(xì)胞透射電鏡與肝臟HE染色Fig 2 Transmission electron microscopy of liver cells and liver HE staining
肝臟胰島素抵抗是非酒精性脂肪肝發(fā)病的中心環(huán)節(jié),免疫炎癥、氧化應(yīng)激是重要的發(fā)病因素[9-10],本研究顯示,追趕生長(zhǎng)大鼠存在明顯的糖脂代謝異常、炎性因子的增高及胰島素抵抗,這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[11]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)P头从车氖墙?jīng)過(guò)限食階段后開(kāi)放高脂飲食的追趕生長(zhǎng)狀況及機(jī)制。不同于生理情況的是,經(jīng)歷限食階段后,在高脂飲食狀況下SIRT1及相關(guān)肝細(xì)胞代謝分子PPARa、FGF21明顯降低,經(jīng)歷CR階段后,高脂飲食明顯降低SIRT1及相關(guān)肝細(xì)胞代謝分子PPARα、FGF21,PGC-1α變化并不明顯。分析可能是下面原因綜合作用的結(jié)果:(1)隨著SIRT1降低,PGC-1α與之形成的復(fù)合物減少,PGC-1α下降;(2)SIRT1降低時(shí)肝細(xì)胞PGC-1基因組蛋白乙?;皆黾?,PGC-1α表達(dá)增加。追趕生長(zhǎng)大鼠肝細(xì)胞降低的SIRT1、PPARα與FGF21對(duì)于胰島素分泌的影響是,出現(xiàn)明顯的高胰島素血癥及胰島素抵抗,脂肪肝進(jìn)行性加重,表現(xiàn)明顯的脂肪肝病理特征、輕度肝功能異常。追趕生長(zhǎng)所導(dǎo)致的SIRT1-PPAR-α相關(guān)的肝臟胰島素抵抗信號(hào)通路病理機(jī)制,以及SIRT1對(duì)胰腺胰島素分泌的影響途徑,還需進(jìn)一步研究。
飲食干預(yù)是2型糖尿病防治的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)?;谏鲜霭l(fā)病機(jī)制,對(duì)于普遍存在著追趕生長(zhǎng)的發(fā)展中國(guó)家,飲食干預(yù)尤其重要。文獻(xiàn)顯示,SIRT1可增加肝細(xì)胞PPAR-α表達(dá)[12],食用含糖指數(shù)低的糙米,可增加肝細(xì)胞SIRT1的表達(dá)而改善糖尿病前期患者代謝參數(shù),如內(nèi)臟脂肪含量,降低炎癥標(biāo)志物[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,低熱卡飲食能明顯提高肝細(xì)胞SIRT1蛋白水平,明顯降低體質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪及肝臟指數(shù),脂肪肝病理結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn),胰島素抵抗及肝功能有明顯改善,此與文獻(xiàn)報(bào)道一致;推測(cè)低熱卡飲食可能通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)SIRT1介導(dǎo)的去乙?;饔茫?jīng)SIRT1-PPAR-α-FGF21路徑調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝及脂肪肝,從而影響胰島素抵抗程度及胰島分泌功能。
上述分析表明,肝細(xì)胞乙?;皆龈咚鶎?dǎo)致的糖脂代謝相關(guān)分子表達(dá)異常,可能是導(dǎo)致追趕生長(zhǎng)后肝臟胰島素抵抗及胰島素釋放功能異常的重要機(jī)制,低熱卡飲食干預(yù)有可能通過(guò)改變體內(nèi)乙?;椒乐?型糖尿病的發(fā)生。
圖3 SIRT1、FGF21、NF-κB蛋白水平及PPAR-α、PGC-1α基因表達(dá)Fig 3 Protein levels of SIRT1,F(xiàn)GF21,NF-κB and the gene expression of PPAR-α,PGC-1α
圖4 SIR1、FGF21和NF-κB蛋白電泳結(jié)果Fig 4 Protein electrophoresis results of SIRT1,F(xiàn)GF21and NF-κB
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復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2015年4期