Girdin蛋白在腦膠質瘤組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

林憲仁，何佳，巴一，馬勇杰

（1.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060；2.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所細胞生物學實驗室，天津 300060）

Girdin蛋白在腦膠質瘤組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

林憲仁1，何佳1，巴一1，馬勇杰2

（1.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060；2.天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所細胞生物學實驗室，天津 300060）

目的：研究Girdin在人腦膠質瘤組織中表達的特點及其與病理特征和預后的關系。方法:應用SP免疫組化技術測定100例腦膠質瘤組織中Girdin的表達情況，分析Girdin表達與患者臨床病理特征的關系，Kaplan-Meier生存曲線分析Girdin表達與預后的關系，用Cox比例風險分析影響生存結果的獨立預后因素。結果：Girdin在各病理級別腦膠質瘤中均有表達，Girdin在III～IV級腦膠質瘤表達高于Ⅰ～Ⅱ級腦膠質瘤，差異具有統(tǒng)計學意義。Girdin表達與腦膠質瘤惡性程度、腫瘤大小呈正相關，Girdin高表達組患者的預后比低表達組患者差，Cox比例風險分析提示Girdin、年齡、病理學分級及腫瘤大小是腦膠質瘤患者預后影響因素。結論：Girdin可能在促進惡性腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

Girdin蛋白；腦膠質瘤；免疫組化；預后

惡性腦膠質瘤是最常見的原發(fā)中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度高、術后易復發(fā)、對放療及化療藥物不敏感、預后差，是神經外科領域的難治性疾病［1］。惡性腦膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤過程的分子機制尚未完全揭曉，因此明確其分子機制有利于臨床治療和改善患者預后。研究發(fā)現(xiàn)，Girdin在多種惡性腫瘤組織中表達上調［2-5］，這提示Girdin與惡性腫瘤的發(fā)生有密切關系。Girdin蛋白具有募集并聯(lián)結、調控細胞內微絲的作用，參與調節(jié)細胞生長、遷移以及血管生成及自噬等功能［6］。我們采用免疫組化SP方法觀察100例腦膠質瘤中Girdin的表達，探討Girdin蛋白在腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其與臨床病理特征的相關性和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 病例資料選用來自天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院2004年至2012年腦膠質瘤組織標本60例及天津市環(huán)湖醫(yī)院2011年至2012年間腦膠質瘤組織標本40例，全部病例按世界衛(wèi)生組織（WHO）2007年神經系統(tǒng)腫瘤分級標準診斷，Ⅰ級12例，Ⅱ級35例，Ⅲ級17例，Ⅳ級36例，其中男63例，女37例。年齡9～79歲，中位年齡52歲。所有患者術前均未接受放療、化療。隨訪選用天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腦膠質瘤組織標本60例，自病理確診日開始，至2013 年9月截止。

1.2 免疫組織化學法采用免疫組化（SP）法染色，每例標本經4 μm厚連續(xù)切片，脫蠟入水，3％過氧化氫30 min阻斷內源性過氧化物酶，經EDTA高壓抗原修復2 min 15 s，2％正常山羊血清封閉30 min，加一抗（稀釋濃度為1∶60）后4℃孵育過夜，生物素標記的二抗孵育25 min，鏈霉素親和素-過氧化物酶孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，梯度酒精分化，常規(guī)脫水，干燥，封片。Girdin抗體購自日本IBL公司。

1.3 免疫組化結果判斷標準由兩位專業(yè)病理科醫(yī)師盲法閱片，對免疫組化檢測結果進行評估。采用雙盲法統(tǒng)計實驗結果，每張切片隨機選取10個高倍視野（×400），計算每個高倍視野中陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)的百分比，最后計算此10個視野陽性細胞的平均百分比。Girdin陽性主要定位于胞漿，根據染色強度評分：無棕色顆粒為0分，黃色為1分，棕色為2分，深棕色為3分。陽性細胞百分比：1％～25％為1分，26％～50％為2分，＞50％為3分。將細胞染色程度計分與陽性百分數(shù)計分相乘即為綜合評分，積分0分為無表達，1～3分為低表達，4～6分為中表達，7～9分為高表達。生存分析：積分0～3分為低表達組，4～9分為高表達組。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，Girdin與臨床病理參數(shù)的關系使用方差分析和Spearman’s Rank等級相關分析?？偵妫∣S）和無進展生存（PFS）使用Kaplan-Meier分析，使用logrank檢驗。采用多因素Cox比例風險分析患者的生存預后，并用危險比（HR）和95％可信區(qū)間（CI）表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Girdin蛋白在不同級別腦膠質瘤組織的表達

Girdin主要表達在胞漿中（圖1）。在不同級別的腦膠質瘤組織中Girdin表達的程度不同，Ⅰ級腦膠質瘤Girdin的表達強度最低，陽性細胞數(shù)最少（圖1A），胞漿著色淺；Ⅱ級腦膠質瘤Girdin表達較Ⅰ級強，胞漿有較深的著色（圖1B）；Ⅲ級腦膠質瘤中Girdin表達強度高于Ⅰ級和Ⅱ級，胞漿著色深（圖1C）；Ⅳ級腦膠質瘤中Girdin表達強度最高，胞漿深染（圖1D）。

圖1 Girdin在各級神經膠質瘤組織中的表達（SP，×200）Fig 1Girdin expression demonstrated in glioma tissues（SP，×200）

2.2 100例病例中Girdin蛋白不同級別腦膠質瘤中的表達Ⅰ～Ⅱ級腦膠質瘤中Girdin表達陽性率為51％（24/47），低于Ⅲ～Ⅳ級腦膠質瘤的表達陽性率71.7％（40/53），Girdin在腦膠質瘤各級別中的表達強度差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.041），Girdin蛋白的表達與性別無顯著的相關性，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 隨訪數(shù)據完整的60例Girdin蛋白在不同級別腦膠質瘤中的表達在Ⅰ～Ⅱ級腦膠質瘤中Girdin表達陽性率為39.3％（11/28）低于Ⅲ～Ⅳ級腦膠質瘤的表達陽性率78.1％（25/32），Girdin在腦膠質瘤各級別中的表達強度差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。Girdin蛋白的表達在不同年齡組、性別、病理類型、腫瘤定位之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而與腫瘤大小的差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.024）（表2）。2.460例腦膠質瘤患者Girdin蛋白的表達與生存時間的關系Kaplan-Meier法分析表明，在60例腦膠質瘤患者中，Girdin低表達組的患者中位總生存時間為60個月，明顯長于Girdin高表達組患者的平均總生存時間（20個月），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.040，圖2）。Girdin低表達組和高表達組的中位無進展生存時間分別為48個月和26個月，Girdin低表達組的患者無進展生存明顯長于高表達組，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.038，圖3）。在多因素分析中，Girdin、病理學分級、腫瘤大小、年齡為影響患者總生存和無進展生存的獨立預后因素（表3）。

表1 100例腦膠質瘤病例中Girdin表達和病理參數(shù)的關系（n）Tab 1Girdin expression and pathological parameters in 100 cases of glioma patients（n）

表2 隨訪60例腦膠質瘤病例中Girdin表達和病理參數(shù)的關系（n）Tab 2Complete follow up of 60 glioma cases to show the relationship between pathological parametersand and Girdin expression （n）

表3 膠質瘤患者Cox多因素生存分析Tab 3Multivariate analyses for glioma patient survival

圖2 Girdin低表達組與高表達組的總生存曲線Fig 2OS curve of low Girdin expression group and high Girdin expression group

圖3 Girdin低表達組與高表達組的無進展生存曲線Fig 3PFS curve of low Girdin expression group and high Girdin expression group

3 討論

Girdin是一種大分子肌動蛋白結合蛋白，該蛋白具有調節(jié)腫瘤細胞的生長與凋亡［7-10］，促進腫瘤細胞侵襲與轉移以及促進腫瘤血管生成的作用［8-11］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Girdin在許多人類惡性腫瘤細胞中呈現(xiàn)高表達，包含乳腺癌、結直腸癌［11-14］、消化道癌［15］等，在腫瘤的進展與轉移中起著十分重要的作用，并且與有些腫瘤細胞的分化程度及生存預后密切相關。Garcia-Marcos等［12］通過研究Girdin在多種腫瘤中的表達及作用機制，發(fā)現(xiàn)Girdin特異性高表達主要在侵襲性強的腫瘤細胞中，促進腫瘤細胞的遠處轉移能力，以此證明Girdin與腫瘤轉移有相關性。Girdin的表達也與結直腸癌病患的生存預后相關。有研究說明Girdin可調節(jié)肌動蛋白細胞骨架的重組，從而促使腦膠質瘤細胞侵襲與遷移［16］，提示Girdin在腦膠質瘤的發(fā)展過程中起著重要作用。此外，Girdin在調控惡性腦膠質瘤細胞增殖和凋亡的過程中也具有重要的作用。Natsume等［17］通過基因敲除實驗研究發(fā)現(xiàn)，Girdin在腦膠質母細胞瘤表達缺失時干細胞分化能力增強，且細胞運動、侵襲與轉移等能力受到抑制，說明腫瘤干細胞侵襲與轉移能力需Girdin的維持，提示Girdin在促使腦膠質瘤的侵襲、轉移、發(fā)生與發(fā)展中具有重要意義。

我們通過免疫組化SP方法觀察Girdin在各級別腦膠質瘤中均有表達。本研究結果顯示，在腦膠質瘤中Girdin的表達強度從I級到Ⅳ級總體呈現(xiàn)升高的趨勢，即隨著腦膠質瘤的惡性程度級別增高而表達強度逐漸增強，在惡性程度最高的Ⅳ級腦膠質瘤中Girdin表達顯著高于其他級別，提示Girdin在腦膠質瘤的惡性發(fā)展中起關鍵作用，Girdin可能作為反映惡性腦膠質瘤程度的一個重要分子標志物。惡性腦膠質瘤的侵襲性生長是導致其預后差的首要因素，本研究結果表明，Girdin低表達組的腦膠質瘤患者生存期顯著長于高表達組的患者。Cox比例風險模型分析提示Girdin、病理學分級、年齡及腫瘤大小是腦膠質瘤患者預后影響因素。Girdin表達強度越強、年齡越大、病理級別越高及腫瘤越大患者預后越差，進一步驗證了前期的研究結論。

綜上所述，Girdin蛋白主要表達在腦膠質瘤胞漿中，Girdin的表達與腦膠質瘤病理級別及大小相關，且影響患者預后；多因素生存分析表明Girdin、病理學分級、年齡及腫瘤大小為腦膠質瘤患者判斷預后的指標，提示Girdin在促進腦膠質瘤侵襲、轉移等分子生物學過程中起到了一定的作用。

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（2015－01－07收稿）

Expression of Girdin in glioma tissues and its relationship with pathological clinical characteristics and prognosis of the patients

LIN Hsien-jen1，HE Jia1，BA Yi1，MA Yong-jie2
（1.Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2.Laboratory of Cancer Cell Biology，Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300060，China）

Objective：To investigate the characteristics of Girdin expression and its expression in glioma patients with malignancy grade in the prognosis of these patients.Methods:Girdin expression was investigated using the SP method in glioma tissues in 100 specimens. Kaplan-Meier survival was constructed to assess Girdin expression and living status.Cox Proportional hazard analysis was used to analyze the factors affecting survival prognosis.Results:Protein expression level and pathological grade of glioma were both increased accordingly，patients with high and low protein expressions had a significantly different survival times，where patients with low Girdin expression had higher survival times as compared to patients with high Girdin expression.Cox Proportional Hazard analysis found that Girdin expression，age，pathology grade，and size of glioma were all factors affecting the prognosis of glioma patients.Conclusion:Expression of the protein Girdin is positively correlated with pathological grade of gliomas，and patients with high Girdin expression have poorer prognosis，suggesting that Girdin may play a role in tumorgenesis and progression of gliomas.

protein Girdin；glioma；immunohistochemistry；prognosis

R739.4

A

1006-8147（2015）05-0397-04

林憲仁（1986－），男，碩士在讀，研究方向：神經腫瘤中膠質瘤的基礎與臨床研究；通信作者:馬勇杰，E-mail:yongjiemagu@ aliyun.com。