調(diào)節(jié)性T細(xì)胞獲得及其免疫抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

王凊，車緒春

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津 300070）

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞獲得及其免疫抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

王凊1，車緒春2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津 300070）

目的：制備誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（iTreg），探討iTreg的免疫抑制功能及其作用機(jī)制。方法：免疫磁珠分選獲取CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞，TGF-β誘導(dǎo)法獲取iTreg，流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測iTreg的得率及其叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）mRNA水平，活性染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯（CFSE）染色和流式細(xì)胞術(shù)方法觀察Treg細(xì)胞對CD4+T淋巴細(xì)胞體外增殖能力的影響。利用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)方法分別檢測iTreg的IL-10、TGF-β分泌以及胞內(nèi)因子IL-2、IL-4、IL-17、干擾素-γ（IFN-γ）水平。結(jié)果：TGF-β誘導(dǎo)法iTreg得率可達(dá)42.10％，TGF-β誘導(dǎo)后獲得的iTreg Foxp3 mRNA水平明顯升高。獲得的iTreg可以抑制自體CD4+T淋巴細(xì)胞增殖，IL-10和TGF-β分泌水平較原始CD4+T細(xì)胞上升（P＜0.05），但幾乎不分泌IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ。結(jié)論：利用TGF-β誘導(dǎo)法制備獲得的iTreg具有明顯的免疫抑制功能，其發(fā)揮免疫抑制功能過程可能均有IL-10和TGF-β的參與。

誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；Foxp3；TGF-β；免疫抑制

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)是機(jī)體保持對自身抗原特異性免疫耐受，維持T細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的一個(gè)重要機(jī)制。1995年，Sakaguchi等［1］首次報(bào)道了CD4+CD25+Treg細(xì)胞。Treg細(xì)胞過繼療法已經(jīng)在某些疾病的實(shí)驗(yàn)研究中取得重要進(jìn)展［2］，而外周血中無法分離出大量Treg細(xì)胞，要將Treg細(xì)胞真正應(yīng)用于治療，首先需要獲得足夠數(shù)量的有治療意義的Treg細(xì)胞［3］。Hjerrild等首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3）參與Treg細(xì)胞的發(fā)育及其作用發(fā)揮的過程。Wildin等和Bennett等報(bào)道人類Foxp3基因和Scurfy小鼠的Foxp3基因存在同源性（小鼠Foxp3基因編碼的蛋白質(zhì)也稱Scurfy），F(xiàn)oxp3基因敲除的小鼠產(chǎn)生的CD4+CD25+T細(xì)胞不具備調(diào)節(jié)功能，即無Treg細(xì)胞，從而引起自身免疫性疾病的發(fā)生［4］。體外通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)Foxp3，獲得的Treg細(xì)胞可具有與nTreg（native Treg，天然型Treg）相同的表型和功能［5］。另外，TGF-β能夠誘導(dǎo)外周CD4+T表達(dá)Foxp3，并成為與nTreg相似的iTreg（inducible Treg，誘導(dǎo)型Treg）［6］。本文通過研究體外獲取Treg細(xì)胞的方法—利用TGF-β誘導(dǎo)初始CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞來制備CD4+CD25+Treg細(xì)胞，觀察獲得Treg樣細(xì)胞的得率，對方法學(xué)進(jìn)行優(yōu)化、鑒定，研究Treg對免疫的調(diào)控功能及其抑制作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料尼龍毛柱（Wako chemical公司）；流式細(xì)胞儀（BD公司）；淋巴細(xì)胞分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）；CFSE（invitrogen公司）；human IL-2（PEPROTECH公司）；anti-CD3（R&D公司）；anti-CD28（R&D公司）；CD4+CD25+Regulatory T cell isolation kit（Miltenyi公司）；IL-10和TGF-β ELISA試劑盒（R&D公司）。

1.2 方法

1.2.1 CD4+CD25-淋巴細(xì)胞及CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的獲得［6］采用免疫磁珠法（Magnetic activated cell sorting，MACS）。將正常人富含血小板白膜與PBS混合，加入淋巴細(xì)胞分離液，離心吸取單個(gè)核細(xì)胞。以抗CD8+T細(xì)胞抗體和磁珠結(jié)合方法，分離CD4+T細(xì)胞，加入抗CD25抗體，先收集的未標(biāo)記細(xì)胞即為CD4+CD25-淋巴細(xì)胞，磁珠自動(dòng)分選儀的磁場陽性選擇CD4+CD25+淋巴細(xì)胞，檢測細(xì)胞活性。流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度。

1.2.2 TGF-β誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞［7］

人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離法獲得B細(xì)胞，即刺激細(xì)胞。將5×105CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞和刺激細(xì)胞1∶1培養(yǎng)，培基中加入IL-2（200 U/mL）、anti-CD3（10 μg/mL）和anti-CD28（10 μg/mL），并分別加入不同濃度TGF-β（0、1、5和10 ng/mL）。分別在第2、4、6、8、10天，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型標(biāo)記（Foxp3），計(jì)數(shù)iTreg細(xì)胞，并計(jì)算獲得率。

1.2.3 TGF-β誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組如下，TGF-β誘導(dǎo)組：CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞和相同數(shù)量的刺激細(xì)胞加入到96孔板中，并加入IL-2（200 U/mL）、anti-CD3 （10 μg/mL）和anti-CD28（10 μg/mL），加入5 ng/mL TGF-β誘導(dǎo)獲得iTreg細(xì)胞；CD4+T淋巴細(xì)胞活化組：將CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞和相同數(shù)量的刺激細(xì)胞混合培養(yǎng)，并加入IL-2（200 U/mL）、anti-CD3（10 μg/mL）和anti-CD28（10 μg/mL）；CD4+T淋巴細(xì)胞未活化組：CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞單純培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集3組培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞總RNA提取采用Trizol法，real-time PCR方法檢測Foxp3 mRNA。

1.2.4 TGF-β誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對CD4+T淋巴細(xì)胞體外增殖影響實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）TGF-β誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞組；（2）nTreg組；（3）對照組為活化的CD4+T淋巴細(xì)胞即non-Treg（非Treg），未經(jīng)CFSE染色。3組均以經(jīng)CFSE染色的CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞為作用細(xì)胞。具體步驟如下：CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入CFSE稀釋液混勻，之后中止染色，DMEM完全培養(yǎng)基洗滌，收集細(xì)胞，并加入IL-2、anti-CD3、anti-CD28，使其終濃度分別為200 U/mL、10 μg/mL、10 μg/mL。將培養(yǎng)板中的TGF-β誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞、nTreg細(xì)胞、non-Treg細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×106個(gè)/mL，分別同時(shí)加入CFSE染色CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞，混勻。將上述細(xì)胞分別用96孔板培養(yǎng)于10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72 h，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測第1、2、3代CD4+T增殖細(xì)胞的比例。

1.2.5 TGF-β誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞IL-10、TGF-β分泌水平的比較收集TGF-β誘導(dǎo)組iTreg細(xì)胞和non-Treg細(xì)胞懸液（獲得步驟同前）。細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5％CO2，72 h后，收集每孔上清液。IL-10和TGF-β濃度檢測采用ELISA試劑盒，具體檢測步驟參照說明書，450 nm波長下檢測OD值。

1.2.6 TGF-β誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測收集TGF-β誘導(dǎo)組iTreg細(xì)胞和non-Treg細(xì)胞懸液（獲得步驟同前）。加入等體積的胞內(nèi)因子刺激液，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4 h。離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞固定液，再加入破膜液。離心棄上清。分別加入PE標(biāo)記的IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ抗體，孵育后離心棄上清，流式細(xì)胞儀檢測。1.3數(shù)據(jù)分析SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示，多組均數(shù)間比較采用one-way ANOVA（單因素方差分析），組間多重比較應(yīng)用Student-Newman-Keuls法；兩組比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β誘導(dǎo)法獲得iTreg細(xì)胞與對照組（0 ng/mL）比較，應(yīng)用TGF-β（1、5、10 ng/mL）在第2、4、6、8、10天均能使細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05，圖1）。當(dāng)加入5 ng/mL TGF-β，誘導(dǎo)6 d后，iTreg細(xì)胞得率最高，為42.10％，為最佳誘導(dǎo)條件。

圖1 不同濃度TGF-β及不同作用時(shí)間誘導(dǎo)獲得iTreg細(xì)胞Fig 1iTreg acquired by different concentrations of TGF-β and induction time

2.2 iTreg細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)檢測Real-time PCR結(jié)果顯示，與CD4+T淋巴細(xì)胞活化組比較，TGF-β誘導(dǎo)后獲得的iTreg Foxp3 mRNA水平明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）（圖2）。

圖2 iTreg細(xì)胞Foxp3 mRNA水平Fig 2Foxp3 mRNA level of iTreg

2.3 iTreg細(xì)胞對CD4+T淋巴細(xì)胞體外增殖的影響比較與對照組比較，TGF-β誘導(dǎo)獲得的iTreg細(xì)胞組以及nTreg細(xì)胞組的第一代M1和第二代M2 CD4+T淋巴細(xì)胞的體外增殖均顯著被抑制，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖3）。

圖3 iTreg細(xì)胞對自體CD4+T淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig 3Effect of iTreg on the proliferation of autos CD4+T lymphocytes

2.4 兩種iTreg細(xì)胞IL-10和TGF-β分泌水平比較TGF-β誘導(dǎo)iTreg細(xì)胞的IL-10和TGF-β水平均明顯上升，與non-Treg對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表1）。

表1 iTreg的IL-10、TGF-β水平檢測Tab 1The IL-10 and TGF-β levels of iTreg

2.5 兩種iTreg細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ水平比較經(jīng)流式細(xì)胞儀法檢測表明，TGF-β誘導(dǎo)的iTreg細(xì)胞均幾乎不分泌IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ，檢測值分別為（0.32±0.24）、（3.59± 2.72）、（0.39±0.22）、（1.00±0.30）ng/mL。

3 討論

Treg細(xì)胞是目前免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，對于維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。近年來，越來越多研究表明，Treg細(xì)胞在免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的臨床意義［8-9］，如多發(fā)性硬化、紅斑狼瘡等自身免疫病以及與移植免疫、腫瘤和感染免疫有關(guān)［10-12］。由于Treg細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)特性，將其作為治療靶點(diǎn)，利用其在細(xì)胞和分子水平機(jī)制上發(fā)揮作用，達(dá)到自身免疫的平衡，從而達(dá)到治療的目的。但由于Treg細(xì)胞只占正常人外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的5％～10％，及其免疫無能特性，在體外難以培養(yǎng)且增殖能力較差，因而限制了其研究進(jìn)展。Treg細(xì)胞的來源成為Treg細(xì)胞臨床研究及其應(yīng)用的首要挑戰(zhàn)，因?yàn)榇罅康呐c受體MHC匹配Treg細(xì)胞是Treg過繼療法所必需的，從體外獲得足夠數(shù)量的有治療意義的Treg細(xì)胞成為當(dāng)務(wù)之急。

Foxp3屬于叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族，它主要在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中表達(dá)，是調(diào)控Treg分化和行使免疫調(diào)節(jié)功能的主控基因，可作為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞的特異性標(biāo)志物以及篩選標(biāo)志。重要的是，F(xiàn)oxp3高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的Treg細(xì)胞數(shù)目顯著增加，F(xiàn)oxp3基因敲除的小鼠則無獨(dú)立的Treg細(xì)胞，具有整體免疫失調(diào)表現(xiàn)，類似于將具有下調(diào)免疫應(yīng)答作用的共刺激分子CTLA-4基因敲除的小鼠體征［13］。許多研究均證明Foxp3在CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)育、分化上的作用，并且其在CD4+CD25+Treg免疫抑制功能上也起著舉足輕重的作用。TGF-β是一種誘導(dǎo)機(jī)體耐受、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要的抑制性細(xì)胞因子，它誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞，并能抑制T細(xì)胞的增殖和作用，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化、功能維持的關(guān)鍵因子。TGF-β可誘導(dǎo)初始CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞并表達(dá)Foxp3［14］。最早的相關(guān)研究報(bào)道，是利用mRFP（紅色熒光蛋白）標(biāo)記Foxp3，轉(zhuǎn)染小鼠后，發(fā)現(xiàn)表達(dá)Foxp3的細(xì)胞表達(dá)mRFP。胰島瞬時(shí)表達(dá)TGF-β轉(zhuǎn)基因的非肥胖性糖尿?。╪on-obese diabetic，NOD）小鼠，高表達(dá)Foxp3的CD4+CD25+T細(xì)胞的數(shù)目增多，糖尿病發(fā)生率低。并且，iTreg細(xì)胞過繼輸注入非肥胖性糖尿病小鼠，糖尿病發(fā)病也可被抑制。TGF-β誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞的過程中，IL-2可通過STAT-5促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化。IL-2聯(lián)合TGF-β誘導(dǎo)天然CD25-T細(xì)胞成為Treg細(xì)胞，在沒有IL-2情況下，TGF-β誘導(dǎo)小鼠T細(xì)胞Foxp3的表達(dá)與nTreg相比明顯減少。另外，通過混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，還發(fā)現(xiàn)IL-2是TGF-β誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞具有抑制功能活性所必需的，中和IL-2后會(huì)消除TGF-β誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞的抑制功能。

因此，本研究采用TGF-β誘導(dǎo)的方法獲得iTreg細(xì)胞。加入IL-2、抗CD3單克隆抗體、抗CD28單克隆抗體和B細(xì)胞使CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞活化，觀察了不同濃度TGF-β，不同誘導(dǎo)時(shí)間條件下，對Foxp3表達(dá)的影響及iTreg細(xì)胞的得率。結(jié)果顯示，應(yīng)用TGF-β在第2、4、6、8、10天均能使細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)升高，最高為42.10％。iTreg細(xì)胞得率到達(dá)高峰后隨時(shí)間延長而降低。這可能是由于伴隨著培養(yǎng)時(shí)間的過度，細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡［15］。此外，CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖可被細(xì)胞因子TGF-β所抑制，從而CD4+T淋巴細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞過程被抑制。

最佳實(shí)驗(yàn)條件下，TGF-β誘導(dǎo)后得到iTreg，得率均達(dá)40％以上。Treg細(xì)胞的抑制作用涉及CD4+、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞之間的相互聯(lián)系。本文研究了iTreg細(xì)胞對CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用，并對其免疫調(diào)節(jié)能力進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導(dǎo)獲得的iTreg細(xì)胞組以及nTreg細(xì)胞組的CD4+T淋巴細(xì)胞的體外增殖均顯著被抑制，說明獲得的Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，其與天然的CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表型和功能一致。

已證實(shí)IL-10的分泌是iTreg發(fā)揮免疫抑制功能重要細(xì)胞因子，而如前述TGF-β是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化、功能維持的關(guān)鍵因子。本研究表明，iTreg細(xì)胞IL-10和TGF-β分泌水平較原始CD4+細(xì)胞均顯著上升，說明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用模式，即分泌IL-10和TGF-β作用于靶細(xì)胞，并通過細(xì)胞間接觸使膜表面分子CTLA-4發(fā)揮抑制作用。另外，Treg細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間的區(qū)別在于Treg細(xì)胞不分泌IL-2、IL-4、IL-17和IFN-γ等細(xì)胞因子。通過流式細(xì)胞儀檢測，iTreg細(xì)胞幾乎不分泌上述各種細(xì)胞因子。

綜上所述，本研究成功建立了TGF-β誘導(dǎo)法來獲取iTreg的方法，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，為研究體外誘導(dǎo)Treg提供了有力的方法學(xué)證據(jù)；進(jìn)一步研究了iTreg細(xì)胞的免疫抑制功能及發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的初步機(jī)制，檢測了iTreg的細(xì)胞因子分泌，為其在臨床上應(yīng)用發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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（2015-03-25收稿）

Study on obtaining method of iTreg cells obtaining method and its immunosuppression function

WANG Qing1，CHE Xu-chun2
（1.Department of Clinical Laboratory，General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China；2.Department of Immunolgy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

Objective：ToestablishTGF-βinducedmethodtoobtaininducedregulatoryTcells（iTreg），andtostudytheimmunosuppression function and mechanism of iTreg.Methods：CD4+CD25-T were obtained by MACS，after which the iTreg cells were obtained by TGF-β induced method.Flow cytometry and PCR were used to detect iTreg yield and Foxp3 mRNA level，CFSE staining and Flow cytometry were applied to investigate the effect of iTreg on proliferation activity of CD4+T.ELISA and Flow cytometry were adopted to detect iTreg IL-10 and TGF-β secretion levels and intracellular cytokine levels of IL-2，IL-4，IL-17 and IFN-γ.Results：The yield rate of iTreg cells was increased to 42.10％using by TGF-β induced method.The Foxp3 mRNA of the induced iTreg were higher than that of CD4+T（P＜0.05）. CD4+T cell proliferation and IL-10，TGF-β secretion were significantly inhibited by iTreg cells versus non-Treg cells（P＜0.05）.IL-2，IL-4，IL-17 and IFN-γ were hardly secreted by iTreg cells.Conclusion：TGF-β induction can be successfully used to obtain iTreg.IL-10 and TGF-β may be both involved in iTreg immunosuppression function.

induced regulatory T cells；Foxp3；TGF-β；immunosuppression

R392.12

A

1006-8147（2015）05-0393-04

王凊（1978-），女，主管技師，碩士，研究方向：免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤免疫；通信作者：車緒春，E-mail：chexuchun@tmu.edu.cn。