體外構(gòu)建合成成纖維細(xì)胞生長因子-1 mRNA及其表達(dá)的初步研究

吳志敏，李光明，白潔，王金鑫，賈欣雨，杜曉玲，朱澤

（天津醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，天津 300070）

體外構(gòu)建合成成纖維細(xì)胞生長因子-1 mRNA及其表達(dá)的初步研究

吳志敏，李光明，白潔，王金鑫，賈欣雨，杜曉玲，朱澤

（天津醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，天津 300070）

目的：參照mRNA穩(wěn)定性理論，設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄合成具有一定穩(wěn)定性的FGF1 mRNA，對其表達(dá)進(jìn)行初步驗(yàn)證。方法：在pT7TS載體上加poly A、βglobin 3′、5′UTR，增加GC含量優(yōu)化設(shè)計(jì)FGF1序列，并結(jié)合mRNA二級結(jié)構(gòu)分析其穩(wěn)定性，目的序列瓊脂糖凝膠電泳及測序驗(yàn)證后，體外轉(zhuǎn)錄合成FGF1 mRNA，待濃度及片段大小驗(yàn)證后，行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過ELISA法檢測FGF1 mRNA表達(dá)。結(jié)果：二級結(jié)構(gòu)分析顯示，優(yōu)化后FGF1序列穩(wěn)定性更高；雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示pT7TS-FGF1重組載體構(gòu)建成功，測序驗(yàn)證正確；聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示合成mRNA大小正確。ELISA檢測顯示，實(shí)驗(yàn)組（92.48 pg/mL）小鼠血清中FGF1蛋白含量較對照組（13.59 pg/mL和15.54 pg/mL）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對照組間FGF1蛋白含量接近，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P＞0.05）。結(jié)論：成功構(gòu)建并體外轉(zhuǎn)錄合成穩(wěn)定的FGF1 mRNA，mRNA與魚精蛋白結(jié)合后回輸小鼠在體內(nèi)成功表達(dá)。

體外轉(zhuǎn)錄；mRNA穩(wěn)定性；成纖維細(xì)胞生長因子-1；體內(nèi)表達(dá)

成纖維細(xì)胞生長因子-1（fibroblast growth factor-1，F(xiàn)GF1）是一種細(xì)胞因子，具有促有絲分裂作用［1］，研究發(fā)現(xiàn)其有潛在的調(diào)節(jié)營養(yǎng)平衡作用［2］。2014年，美國科學(xué)家通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)［3］，糖尿病小鼠單次注射FGF1蛋白，可持續(xù)2 d以上將血糖水平恢復(fù)至正常范圍。與普通胰島素增敏藥相比，F(xiàn)GF1蛋白不會(huì)引起小鼠體質(zhì)量增加、心臟和肝臟危險(xiǎn)性問題等副作用。但FGF1克隆蛋白是由擬核細(xì)菌表達(dá)的異源性蛋白，免疫原性和安全性問題限制了其廣泛應(yīng)用。而近來發(fā)展的mRNA體外合成技術(shù)，能夠很好地解決這一問題。2012年P(guān)etsch等［4］體外轉(zhuǎn)錄合成穩(wěn)定性mRNA的抗流感疫苗，并在小鼠體內(nèi)成功表達(dá)出蛋白即抗體，抵抗流感病毒的感染。本研究通過優(yōu)化設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄合成穩(wěn)定的FGF1 mRNA，與魚精蛋白結(jié)合成體外穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，小鼠皮下注射，觀察其在小鼠體內(nèi)的表達(dá)蛋白，為體外合成mRNA技術(shù)構(gòu)建的細(xì)胞因子預(yù)防和治療疾病，進(jìn)一步為FGF1細(xì)胞因子治療糖尿病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，聚丙烯酰胺凝膠RNA回收試劑盒（Poly-Gel RNA Extraction Kit）購自O(shè)mega公司，體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（mMESSAGE mMACHINE Kit）購自Ambion公司，Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、SalⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、RNA marker購自大連寶生物工程有限公司。Trans2K Plus II DNA Marker、DH5α感受態(tài)、PCR混合試劑購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物合成及測序于蘇州金唯智生物科技有限公司。魚精蛋白購自Sigma公司，人酸性成纖維細(xì)胞生長因子（FGF1）ELISA試劑盒為美國Rapidbio產(chǎn)品。

1.1.2 儀器設(shè)備渦旋振蕩器（Vortex－genie2）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5415R centrifuge）、Nanodrop （ND－1000型）、PCR儀（Eppendorf 22331 Hamburg）、Real－time PCR儀（BIO－RAD iQ5）、電泳儀（北京六一儀器廠DYY－7C型）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO－RAD ChemiDocTMXRS）、超低溫冰箱（海爾DW－86L388）、電子天平（Sartorius CPA64）。

1.2 質(zhì)粒和動(dòng)物pT7TS購自Addgene官網(wǎng)，雄性ICR小鼠（18～20 g）30只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pT7TS載體優(yōu)化pT7TS送金唯智公司測序確定。載體T7啟動(dòng)子之后，設(shè)計(jì)加入序列，分別為globin 5′UTR、酶切位點(diǎn)、globin 3′UTR、poly A結(jié)構(gòu)A60。由蘇州金唯智公司合成并測序驗(yàn)證。

1.3.2 FGF1序列合成及目的載體構(gòu)建FGF1目的序列參照GeneBank NM_001257210.1，結(jié)合軟件二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，在不改變編碼氨基酸的情況下進(jìn)行種屬偏好密碼子優(yōu)化，調(diào)整GC含量并做分析。選擇其中GC含量高且穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)合理的序列，經(jīng)序列堿基分析后兩端分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)為SpeⅠ和SalⅠ，由蘇州金唯智公司合成。前期優(yōu)化的質(zhì)粒pT7TS和目的序列FGF1在37℃水浴條件下同時(shí)進(jìn)行SpeⅠ和SalⅠ雙酶切2 h，1％瓊脂糖凝膠電泳72 V 25 min后用DNA回收試劑盒回收，使用T4 DNA連接酶將目的片段與載體片段于PCR儀中16℃連接過夜。

1.3.3 克隆菌的轉(zhuǎn)化及鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，接種于氨芐抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)箱中過夜。16～18 h內(nèi)從LB平板上挑選多個(gè)單克隆菌，依次接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基（氨芐抗性）的試管中，放置于搖床，37℃，200 r/min搖菌1 h。后每管取1 μL菌液行菌落PCR，引物為Forward：GGCAGATCTGTCGACCTCGAGACTAGTATGGCTGAAGGGGAAATCACCACC，Reverse：AACCAGATCCTAGTCAGTCGATATCTTAATCAGAAGAGACTGG CAGGGGG。條件：95℃3 min；95℃30 s，50℃1 min，68℃1 min，35 REP；68℃4 min；HOLD 4℃。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，篩選陽性單克隆菌繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h，按說明書抽提質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒以SpeⅠ和SalⅠ雙酶切（37℃水浴，4 h），瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定陽性的重組質(zhì)粒用Nanodrop測定濃度，并送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，與理論序列比對。

1.3.4 FGF1 mRNA體外合成在無菌無RNA酶條件下，按照mMESSAGE mMACHINE體外轉(zhuǎn)錄操作步驟，將鑒定陽性的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ單酶切線性化（37℃、2 h），加入EDTA醋酸銨混合液和無水乙醇停止反應(yīng)，-20℃放置15 min。微型離心機(jī)以最大轉(zhuǎn)數(shù)（13.2×1 000 r/min）離心15 min，去上清，槍頭小心地移去殘余液體。按照重組質(zhì)粒濃度計(jì)算，用無酶水重懸線性質(zhì)粒濃度為0.5～1 μg/μL。室溫下將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組分混合，1 μL線性質(zhì)粒于20 μL體系，37℃2 h。加入TURBO DNase 1 μL反應(yīng)37℃15 min，降解模板DNA。后加入50 μL LiCl溶液沉淀RNA，充分混勻，-20℃冷卻≥30 min，以最大轉(zhuǎn)速（13.2×1 000 r/min）4℃15 min離心。小心吸除上清，用1 mL70％乙醇沖洗1次，再次以同樣條件離心。小心吸除70％乙醇，無RNA酶水溶解后測定RNA濃度，-70℃保存。過程中所有溶液均為試劑盒自帶或用無RNA酶水配制。

1.3.5 體外合成mRNA的鑒定獲得mRNA通過聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證后，使用聚丙烯酰胺凝膠RNA回收試劑盒進(jìn)一步純化回收，獲得更純的FGF1 mRNA，并由Nanodrop測定濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)用到的mRNA均由前面方法重復(fù)操作獲得。

1.3.6 mRNA-魚精蛋白復(fù)合物獲得按照參考文獻(xiàn)［5］的方法，換算mRNA濃度后，在無菌無RNA酶室溫條件下，將0.5 μg魚精蛋白：1 μg mRNA（1∶2）于100 μL的緩沖液（150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Hepes，pH7.4）中混合孵育，搖勻5 min。不加mRNA的魚精蛋白按同樣步驟進(jìn)行，用于下一步注射小鼠時(shí)的對照。所有用到的溶液均由無RNA酶水配制，操作迅速，搖勻后立即置于冰上。

1.3.7 FGF1 mRNA-魚精蛋白在小鼠體內(nèi)的表達(dá)

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為1組：生理鹽水對照組（0.1 mL/10 g）；2組：空白魚精蛋白對照組（0.1 mL/10 g）；3組：FGF1 mRNA-魚精蛋白組（0.1 mL/10 g）。每天定時(shí)注射1次，連續(xù)注射3 d，第4天通過尾靜脈取血。用干凈的1.5 mL離心管收集血液，室溫放置2 h使血清析出，4℃3 000 r/min離心10 min，小心吸取上清。按照ELISA檢測試劑盒說明步驟操作：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔。標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為：1 000、500、250、125、62.5、0 pg/mL。標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；待測樣本孔加待測樣本10 μL和樣本稀釋液40 μL。隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔加HRP標(biāo)記的檢測抗體50 μL，封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min后甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5次。所有孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min，再加入終止液50 μL，15 min內(nèi)酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處OD值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各孔FGF1蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化后載體pT7TS序列根據(jù)mRNA穩(wěn)定性理論及參考文獻(xiàn)（討論部分），優(yōu)化設(shè)計(jì)后由公司合成并測序驗(yàn)證，得到了目的pT7TS序列，如圖1。得到的質(zhì)粒由T7作為啟動(dòng)子，能夠在序列末端單酶切線性化，滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 優(yōu)化pT7TS結(jié)構(gòu)圖Fig 1The optimized structure of pT7TS

2.2 FGF1序列的設(shè)計(jì)在保證編碼氨基酸不變的前提下，進(jìn)行種屬密碼子偏好優(yōu)化，并適當(dāng)調(diào)整增加目的序列中GC含量，由公司結(jié)合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件進(jìn)行分析。如圖2，序列A為優(yōu)化之后，GC含量為58.97％，序列B為原始野生型序列，GC含量為51.50％。分析二級結(jié)構(gòu)后初步認(rèn)為，序列A的折疊和環(huán)相對較少，會(huì)比較穩(wěn)定一些。

2.3 pT7TS-FGF1重組載體構(gòu)建合成FGF1與優(yōu)化pT7TS連接，經(jīng)氨芐青霉素選擇和菌落PCR鑒定陽性的菌液所提重組載體，經(jīng)SpeⅠ和SalⅠ雙酶切驗(yàn)證，如圖3。10個(gè)單克隆菌液PCR，其中有8個(gè)得到的主條帶均在500 bp附近，與FGF1 PCR條帶大小相符。選取其中1個(gè)擴(kuò)增抽提得到的重組質(zhì)粒，未酶切的顯示有4條條帶，符合質(zhì)粒電泳結(jié)果，其中較大的1條在3 000～4 000 bp之間。雙酶切后得到的2條條帶分別約3 000 bp和500 bp，與優(yōu)化pT7TS和FGF1的大小一致，初步說明重組載體構(gòu)建成功。送公司測序，結(jié)果正確。

圖2 調(diào)整堿基后編碼FGF1蛋白的mRNA結(jié)構(gòu)Fig 2 The secondary structure of optimized mRNA coding FGF1

圖3 pT7TS-FGF1瓊脂糖凝膠電泳Fig 3Agarose gel electrophoresis of pT7TS-FGF1

2.4 體外合成mRNA的檢測圖4結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物條帶大小在700 nt附近，且條帶單一。真核mRNA的結(jié)構(gòu)中包括5′cap、5′UTR、編碼區(qū)、3′UTR 和poly A尾（圖5），合成產(chǎn)物的條帶位置符合理論合成FGF1 mRNA的大小。Narnodrop測得20 μL轉(zhuǎn)錄體系中，得到mRNA的量約為15 μg，OD260/280約1.9～2.0。每次體外轉(zhuǎn)錄合成產(chǎn)物略有差別。

圖4 mRNA聚丙烯凝膠電泳檢測結(jié)果Fig 4PAGE result of synthetic mRNA

圖5 真核mRNA結(jié)構(gòu)Fig 5The structure of eukaryotic mRNA

2.5 ELISA檢測mRNA在小鼠體內(nèi)的表達(dá)ELISA法檢測3組小鼠血清中的FGF1含量，結(jié)果如圖6。實(shí)驗(yàn)組（92.48 pg/mL）血清中FGF1的含量顯著高于空白對照組（13.59 pg/mL）和魚精蛋白對照組（15.54 pg/mL），說明mRNA進(jìn)入體內(nèi)并成功表達(dá)出FGF1蛋白，空白與魚精蛋白對照組FGF1蛋白含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 ELISA檢測血清中重組人FGF1蛋白的含量Fig 6Human FGF1 content was identified by ELISA

3 討論

基因治療作為一種新的治療手段受到廣泛認(rèn)可，mRNA因其自身優(yōu)勢而逐漸受到重視。體外轉(zhuǎn)錄mRNA后導(dǎo)入體內(nèi)表達(dá)，可翻譯成具有功能的蛋白質(zhì)［6］，得到的蛋白是真核表達(dá)的，且具有自體同源性［7］，與體外表達(dá)得到的蛋白相比，減少了MHC限制等排斥反應(yīng)及其他潛在的不安全因素。同時(shí)mRNA穩(wěn)定性的問題也隨著研究的逐步深入而破解，Petsch等［4］體外合成特異性mRNA并開發(fā)出新型抗流感疫苗，實(shí)現(xiàn)了設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄mRNA在體內(nèi)表達(dá)的成功應(yīng)用。

真核mRNA結(jié)構(gòu)包括5′cap、5′UTR、開放閱讀框、3′UTR和polyA尾等部分，各部分均與穩(wěn)定性密切相關(guān)。研究顯示，使用帽子類似物ARCA或者牛痘病毒加帽系統(tǒng)代替常規(guī)的帽子結(jié)構(gòu)，可顯著提高mRNA的翻譯率，而翻譯常常被作為穩(wěn)定性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)帽子類似物添加方向具有不確定性，反向添加的帽子結(jié)構(gòu)其甲基化會(huì)受到影響，故而翻譯效率大大下降［8］；而且ARCA本身在細(xì)胞中就具有較長的半衰期［9］。PolyA中堿基數(shù)對mRNA穩(wěn)定性也起到重要作用，該結(jié)構(gòu)能夠增加mRNA的穩(wěn)定性和蛋白的表達(dá)［10］，polyA的減少意味著mRNA的衰退。當(dāng)腺苷酸殘基A少于約20 nt時(shí)，mRNA便不能結(jié)合多聚A結(jié)合蛋白（PABP）進(jìn)行翻譯，mRNA就會(huì)進(jìn)入降解程序［11］。mRNA的降解與UTR，尤其是3′UTR的末端有密切關(guān)系，對UTR的優(yōu)化常通過使用globin的UTR。非洲爪蟾蜍β globin的5′和3′UTR對體外轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性有重要的意義［12］，已有研究表明，globin 5′UTR提高了翻譯效率而3′UTR增加了mRNA的穩(wěn)定性［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)，編碼globin、膠原蛋白及免疫球蛋白等常見蛋白的mRNA相對來說會(huì)更穩(wěn)定［14］。本研究序列設(shè)計(jì)中也引入globin UTR來穩(wěn)定體外轉(zhuǎn)錄合成的mRNA。開放閱讀區(qū)GC含量高的mRNA會(huì)更加穩(wěn)定，CUREVAC GMBH［15］通過在原野生型基礎(chǔ)上增加GC含量，構(gòu)建GC穩(wěn)定型序列。不同種屬密碼子具有選擇偏好，個(gè)體內(nèi)同一種氨基酸的不同tRNA可能有差別，當(dāng)相應(yīng)tRNA較少時(shí)，可能會(huì)大大減緩翻譯的進(jìn)行［16］。魚精蛋白結(jié)合mRNA后能夠抵抗血清對mRNA的降解而起到穩(wěn)定作用［5］。一些研究發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白與mRNA結(jié)合的復(fù)合體通過TLRs受體作用，對人和小鼠的免疫細(xì)胞有很強(qiáng)的活化作用［17］。

本研究參照RNA穩(wěn)定性理論及前期研究基礎(chǔ)，通過對載體pT7TS進(jìn)行加5′UTR、3′UTR、polyA等結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以及適當(dāng)調(diào)整酶切位點(diǎn)，獲得了優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄載體。選用pT7TS是由于該質(zhì)粒含有能被噬菌體RNA聚合酶特異性識別的T7啟動(dòng)子，T7較其他如SP6啟動(dòng)子等有更好的轉(zhuǎn)錄速率。pT7TS通過其酶切位點(diǎn)能夠保證3′、5′UTR、polyA序列的加入，也能確保后期單酶切使質(zhì)粒線性化，滿足轉(zhuǎn)錄的要求。在此基礎(chǔ)上插入GC含量增加、密碼子優(yōu)化并二級結(jié)構(gòu)初步分析后的FGF1序列，聚合酶轉(zhuǎn)錄合成的同時(shí)加入了5′cap結(jié)構(gòu)，在序列設(shè)計(jì)上保證了目的mRNA在細(xì)胞內(nèi)外的相對穩(wěn)定性，5′cap結(jié)構(gòu)保證識別核糖體和啟動(dòng)合成蛋白。純化后的mRNA與魚精蛋白結(jié)合后，抵抗RNA酶的消化［5］，進(jìn)一步增加了mRNA體內(nèi)穩(wěn)定。通過電泳及ELISA結(jié)果看到，研究中成功合成了目的mRNA并在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。

在合成穩(wěn)定mRNA自身安全性的基礎(chǔ)上，通過氯化鋰沉淀法可以去除寡核苷酸、無機(jī)鹽和大部分蛋白。而用HPLC方法［18］對產(chǎn)物進(jìn)一步純化，可以適應(yīng)更高純度mRNA使用的需求。

本研究成功完成了FGF1穩(wěn)定性mRNA的體外合成并在體內(nèi)表達(dá)出目的蛋白。獲得的FGF1蛋白是機(jī)體自身翻譯產(chǎn)物，與異體甚至原核表達(dá)的蛋白相比，避免了MHC限制等排斥反應(yīng)以及其他不安全因素。盡管FGF1作用機(jī)制尚未完全明確，且本研究表達(dá)的FGF1蛋白是否具有功能尚待進(jìn)一步深入論證，但該方法的表達(dá)成功以及mRNA自身所具有的特質(zhì)，為FGF1治療糖尿病以及其他疾病的基因治療提供了一種新的途徑，為找到FGF1調(diào)節(jié)血糖作用的信號路徑和受體提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（2015-03-17）

Preliminary study on the construction，the synthesis of FGF-1 mRNA in vitro and its expression in vivo

WU Zhi-min，LI Guang-ming，BAI Jie，WANG Jin-xin，JIA Xin-yu，DU Xiao-ling，ZHU Ze
（Department of Microbiology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

Objective：To optimize and synthesize FGF-1 mRNA by in vitro transcription and investigate its stability and expression both in vitro and in vivo.Methods：Poly A and β globin 3′and 5′UTR on pT7TS were added.FGF1 sequence were optimized by increasing GC content and analyzing its stability with the secondary structure of mRNA.Constructed pT7TS-FGF1 then verified it correction by agarose gel electrophoresis（AGE）and sequencing.After the in vitro transcription FGF1 mRNA，its concentration was measured by Narnodrop and its size was analysed by polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）.The expression of mRNA in vivo was detected by ELISA in mice assay. Results：The optimized FGF1 was more stable after being predicted and analyzed by secondary structure.Double digestion verification of agarose gel electrophoresis and the sequencing showed that pT7TS-FGF1 had been constructed successfully.The band on PAGE verified that the mRNA size was correct.ELISA assay result showed the expression of the FGF1 protein in serum in the test group（92.48 pg/mL）was higher than that of the control group（13.59 pg/mL and 15.54 pg/mL）（P＜0.01）.No significant difference was found in the expression of the FGF1 protein in serum between the control groups（P＞0.05）.Conclusion：FGF1 mRNA can be successfully constructed and synthesized by in vitro transcription.mRNA bounding with protamine can be expressed in the injected mice.

in vitro transcription；mRNA stability；FGF1；in vivo expression

Q7

A

1006-8147（2015）05-0375-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81402215）；天津醫(yī)科大學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013KYQ13）

吳志敏（1990-），男，碩士在讀，研究方向：轉(zhuǎn)錄機(jī)制及疾病的生物治療；通信作者：朱澤，E-mail:zhuze@tmu.edu.cn。