反膠束體系中漆酶催化愈創(chuàng)木酚的研究

劉 歡，袁興中，彭 馨，包 姍，馬玉杰，吳秀蓮，曾光明

（湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082）

反膠束體系中漆酶催化愈創(chuàng)木酚的研究

劉 歡，袁興中*，彭 馨，包 姍，馬玉杰，吳秀蓮，曾光明

（湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410082）

采用4種不同屬性類型的表面活性劑（CTAB，Tween-80， AOT以及鼠李糖脂）構(gòu)建反膠束體系，以木質(zhì)素模式物愈創(chuàng)木酚為底物，研究了漆酶在反膠束環(huán)境中催化愈創(chuàng)木酚的特性，通過對(duì)不同反膠束環(huán)境中漆酶酶活的對(duì)比，確定在4種反膠束體系中，適合酶解反應(yīng)的最佳表面活性劑濃度和對(duì)應(yīng)的最佳含水率w0.分別為：CTAB濃度20mmol/L，w0=20；Tween 80濃度50mmol/L，w0=25；AOT濃度30mmol/L，w0=10；鼠李糖脂濃度10mmol/L，w0=30.并考察了表面活性劑類型屬性對(duì)愈創(chuàng)木酚在反膠束體系中酶解行為的影響和底物動(dòng)力學(xué).結(jié)果表明，最佳表面活性劑濃度以及對(duì)應(yīng)的最適含水率條件下，陰離子表面活性劑AOT和鼠李糖脂的反膠束體系中愈創(chuàng)木酚底物的催化效果較好，鼠李糖脂反膠束體系中底物的催化率最高，反應(yīng)6h后分別比 CTAB、Tween-80以及AOT反膠束體系中的轉(zhuǎn)化率高44.12%、34.6%、29.43%.

反膠束；漆酶；愈創(chuàng)木酚；表面活性劑；鼠李糖脂

木質(zhì)素是一種大量存在于植物秸稈、木材中的第二大天然有機(jī)物質(zhì)，是一種由愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)、紫丁香基結(jié)構(gòu)和對(duì)羥苯基結(jié)構(gòu)通過醚鍵和碳碳鍵連接而成的聚酚類三維網(wǎng)狀不溶性聚合物［1］.木質(zhì)素的這種復(fù)雜結(jié)構(gòu)使木質(zhì)素在自然界中的降解困難且緩慢，制約了水稻秸稈等農(nóng)業(yè)固體廢物的減量化、資源化和再利用.國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，白腐真菌產(chǎn)生的漆酶（Laccase）、木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）和錳過氧化物酶（Mnp）具有高效降解木質(zhì)素和其他多種有機(jī)污染物的能力［2-4］.其中漆酶是單電子多酚氧化還原酶，具有在沒有H2O2和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物存在下，直接催化木質(zhì)素等有機(jī)污染物氧化的優(yōu)勢(shì)［5］.

反膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)是表面活性劑超過其臨界膠束濃度時(shí)自組裝形成納米尺寸的聚集體，能夠模擬生物細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境，由于表面活性劑膠團(tuán)的屏蔽作用，反膠束中包裹的酶不會(huì)接觸有機(jī)溶劑，從而能夠有效保持酶的活性［6］.因此，反膠束在酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用越發(fā)廣泛［7］.相比化學(xué)表面活性劑，生物表面活性劑是一種環(huán)境友好型的天然表面活性劑，具有低毒、可降解、生態(tài)相容和高效等優(yōu)勢(shì).近年來，關(guān)于木質(zhì)素在反膠束體系中降解的研究在國(guó)內(nèi)外逐漸展開，然而對(duì)于在生物表面活性劑所構(gòu)建反膠束體系中木質(zhì)素降解機(jī)制的研究，國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道［6-8］.

木質(zhì)素在自然界中存在方式特殊，不能把整個(gè)木質(zhì)素分子以其完整狀態(tài)分離出來，因此本研究選擇木質(zhì)素分子愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)的模式物質(zhì)——愈創(chuàng)木酚進(jìn)行漆酶催化木質(zhì)素的研究.本研究采用不同濃度的陽離子表面活性劑CTAB、非離子表面活性劑Tween 80、以及陰表面活性劑鼠李糖脂和AOT分別構(gòu)建反膠束體系.考察含水率w0、表面活性劑濃度及屬性、愈創(chuàng)木酚濃度對(duì)白腐菌漆酶催化木質(zhì)素反應(yīng)行為的影響.同時(shí)，評(píng)估各類反膠束體系中漆酶催化愈創(chuàng)木酚的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，以期為了解木質(zhì)素在反膠束體系中的降解和進(jìn)一步探討酶在反膠束體系中的應(yīng)用提供更多依據(jù)，明確反膠束體系中木質(zhì)素的酶解機(jī)制提供理論依據(jù)，也為生物表面活性劑在反膠束體系中的應(yīng)用提供參考.

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

紫外分光光度計(jì)（Shimadzu UV-2552，Japan）；高效液相色譜儀（Agilent Technologies， California，USA）；氣質(zhì)聯(lián)用儀（Thermo Finnigam-TRACE GC， Polaris Q， USA）；電熱恒溫水浴鍋（DSY-1-4孔）；水浴恒溫振蕩器（WHY-2）；超聲波清洗儀；pH計(jì)（PHS-2F，上海雷磁儀器廠）.

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，天津市博迪化工有限公司）、吐溫80（Tween 80，天津市博迪化工有限公司）、雙（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸鈉（AOT，Sigma試劑）；鼠李糖脂（RL，湖州紫金生物科技有限公司）；白腐菌漆酶（Sigma試劑）；愈創(chuàng)木酚（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）； ABTS （Sigma試劑）；0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH4.5），異辛烷、正己醇及實(shí)驗(yàn)過程中所用的其他試劑均為分析純，使用過程中無需進(jìn)一步純化，水為超純水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最適含水率w0的測(cè)量 采用ABT法測(cè)定漆酶在反膠束體系中的酶活性［7］.首先將一定量表面活性劑加入體積比為1：1的正己醇/異辛烷混合液制成CTAB、Tween 80、AOT和鼠李糖脂濃度為10，20，30，40，50mmol/L的有機(jī)溶液，再加入1mol/L的ABTS的緩沖溶液超聲震蕩混合均勻，配制成含ABTS反膠束溶液.采取同樣方法配制含1mg/L漆酶緩沖液的反膠束溶液.取2mL漆酶混合液與一定量的緩沖液（最適w0設(shè)置一系列值）混合均勻后，加入2mL ABTS混合液，超聲振蕩數(shù)秒后于UV420nm下測(cè)定120s內(nèi)的吸光度的變化，定義單位時(shí)間里單位mol愈創(chuàng)木酚吸光度變化0.001所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U），計(jì)算其酶活，得到酶活隨含水率w0變化的關(guān)系，以確定酶活最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的表面活性劑濃度和相應(yīng)的含水率w0.

1.2.2 反膠束體系漆愈創(chuàng)木酚的酶降解 將一定量的愈創(chuàng)木酚溶解于上述表面活性劑/異辛烷/正己醇混合液制成不同愈創(chuàng)木酚濃度的有機(jī)溶液，超聲振蕩至澄清透明；取漆酶緩沖液（根據(jù)最適w0）加入有機(jī)溶液混合，于30℃， 120r/min的振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)6h，每小時(shí)取樣1次，用高效液相色譜測(cè)定愈創(chuàng)木酚含量變化.根據(jù)前1h的反應(yīng)計(jì)算反應(yīng)的初始速率，用每秒鐘消耗的愈創(chuàng)木酚量mol/（L·s）表示.

1.2.3 愈創(chuàng)木酚濃度測(cè)定（液相色譜分析） 取離心后有機(jī)相過0.45μm濾膜，用色譜純乙腈稀釋10倍，采用HPLC測(cè)定.色譜條件：色譜柱C18（250mm× 4.6mm，5μm，Agilent）；流動(dòng)相，V（甲醇）：V（水）=1：1；流速0.8mL/min；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)285nm.

1.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析（GC-MS） GC測(cè)試條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30mm× 0.25mm×0.25mm）.柱溫45℃下停留4min，以3℃/min升溫至280℃ ，停留15min.進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器溫度為280℃ .He柱流量1.0L/min；進(jìn)樣量1.0μL；載氣為氦氣.MS測(cè)試條件：電離方式EI，電離源的電子能量為70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍（m/z）為15～500.

2 結(jié)果和討論

2.1 反膠束體系最適佳含水率

在反膠束酶催化反應(yīng)中，適量水的存在是維持酶的催化活性及穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素.反膠束中的水通常以自由水和結(jié)合水兩種形式存在［9］.反膠束體系中水的含量，通常用含水率w0來表示：

w0與反膠束形成膠團(tuán)的大小間存在著線性關(guān)系，反膠束的半徑隨w0增加而增大，是評(píng)價(jià)反膠束的重要指標(biāo)之一［10-11］.如圖1所示，酶活最大時(shí)的w0即為反膠束酶催化反應(yīng)的最佳含水率.漆酶酶活最大值分別在CTAB濃度為20mmol/L，w0=20時(shí)；鼠李糖脂濃度為10mmol/L， w0=30時(shí)；AOT濃度為30mmol/L， w0=10時(shí)；Tween 80濃度為50mmol/L，w0=25時(shí).對(duì)水的增溶能力，鼠李糖脂＞Tween80＞CTAB＞ AOT，在4種反膠束體系中含水率較低時(shí)， 反膠束體系中膠團(tuán)數(shù)量較少且尺寸較小，納米水核中自由水含量少，不能有效增溶酶分子，從而使漆酶大量暴露于有機(jī)環(huán)境之中而逐漸失活.而且此時(shí)反膠束中的大部分水都是與表面活性劑相結(jié)合的結(jié)合水，自由水含量少，反膠束水核的粒徑較小，限制了酶轉(zhuǎn)化為具有催化活性的構(gòu)象.

圖1 w0對(duì)漆酶酶活的影響Fig.1 Effect of w0 on enzyme activities

隨著w0的增加至超過其最佳含水率，反膠團(tuán)的膠團(tuán)粘度明顯降低，膠束穩(wěn)定性降低，酶分子構(gòu)象受到擾動(dòng)，酶的活性部位也難以有效指向膠束界面，導(dǎo)致漆酶活性顯著下降［11-12］.同時(shí)容納蛋白質(zhì)的有效空間一定程度上會(huì)影響到膠束內(nèi)部的構(gòu)型，通常認(rèn)為只有當(dāng)酶蛋白分子的大小與反膠束內(nèi)核的大小匹配時(shí)，體系中的酶才能表現(xiàn)出較高的活性［13-14］.此外，反膠束中油水界面上表面活性劑單分子層的厚度以及表面活性劑的親水基類型和構(gòu)形都對(duì)酶的催化性能具有一定的調(diào)控作用［6］.在最佳w0時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)剛性和熱力學(xué)穩(wěn)定性之間可以達(dá)到最佳平衡，酶能以最活躍的狀態(tài)參與反應(yīng)，從而使底物的降解率得到提高［7］.圖1中也可以看出，在4種表面活性劑濃度較低時(shí)酶活隨w0變化出現(xiàn)多個(gè)極值的情況，Gazaryan等［13，15］指出，可能與單體、二聚體、四聚體等的膠束尺寸有關(guān)，在檢測(cè)反膠束中漆酶催化雙酚A的反應(yīng)時(shí)也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象.隨著表面活性劑濃度升高，體系中膠團(tuán)數(shù)量增加，形成的膠束水核體積減少，不利于漆酶多聚體的形成，酶活隨之降低.

2.2 反膠束體系最適表面活性劑濃度

在反膠束酶催化反應(yīng)中，表面活性劑濃度是影響酶活性的重要因素［6］.可能是由于漆酶中存在具有疏水性作用的不同類型的錨定基團(tuán)，表面活性劑分子可以和酶分子的疏水性錨定基團(tuán)結(jié)合，當(dāng)表面活性劑濃度改變時(shí)，酶的活性也發(fā)生變化［16］.如圖1所示，在w0值恒定時(shí)，總體上酶活隨著表面活性劑濃度的升高呈鐘罩型變化，其原因可能是在恒定w0條件下表面活性劑濃度增大，反膠束體系中膠團(tuán)內(nèi)的靜電排斥力隨之增大，使得膠團(tuán)數(shù)量不斷增加，膠團(tuán)之間和酶分子與底物之間的接觸和碰撞機(jī)率也更頻繁，同時(shí)反膠束中剛性的表面活性劑外殼包圍并限制著酶分子，使其與外界隔離，保護(hù)漆酶免受周圍有機(jī)溶劑的影響，為酶提供了一個(gè)天然、穩(wěn)定的環(huán)境，使得漆酶可以在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持活性，并保持較高的熱穩(wěn)定性，因此反膠束酶系統(tǒng)中酶活隨著表面活性劑濃度的增加出現(xiàn)增大的趨勢(shì)［17］.當(dāng)濃度繼續(xù)增加，相界面上的表面活性劑分子達(dá)到飽和， 部分底物通過與表面活性劑發(fā)生靜電吸引或疏水性親合而分布于微膠層中，從而與反膠束系統(tǒng)中的表面活性劑“膜”緊密結(jié)合［6］.表面活性劑濃度的增加，抑制了底物在有機(jī)相及反膠束中心水核間的擴(kuò)散，減少了底物與酶的接觸，單位時(shí)間內(nèi)酶和底物的接觸機(jī)率變小引起酶活的下降，同時(shí)高濃度的表面活性劑可能導(dǎo)致酶的變性［6，18］.

對(duì)比可知，4種表面活性劑構(gòu)建的反膠束中，在鼠李糖脂反膠束體系中較低的表面活性劑濃度下漆酶表現(xiàn)出較高的催化活性.

2.3 反膠束體系催化反應(yīng)行為

圖2 不同反膠束體系對(duì)底物降解的影響Fig.2 Effect of different systems on substract degradation

圖2中，初始濃度為1mmol/L愈創(chuàng)木酚，在CTAB、Tween 80、AOT和鼠李糖脂和4種表面活性劑構(gòu)建的反膠束體系中， 6h后愈創(chuàng)木酚的轉(zhuǎn)化率，分別達(dá)到21.33%、30.85%、36.02%、 65.45%.降解效果生物表面活性劑鼠李糖脂＞陰離子表面活性劑AOT＞非離子表面活性劑Tween80＞陽離子表面活性劑CTAB.由此說明，表面活性劑的類型也是影響反膠束體系中漆酶活性的一個(gè)重要因素，不同屬性的表面活性劑對(duì)漆酶的穩(wěn)定性和活性都有著不同的影響.陰離子表面活性劑（AOT和鼠李糖脂）構(gòu)建的反膠束體系中底物的降解效果優(yōu)于陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑.漆酶的等電點(diǎn)（pI）值為約≤3.5［19］，反應(yīng)體系的水相pH值為4.5，因此，漆酶表面帶負(fù)電荷.在CTAB體系中，可能由于漆酶所帶的負(fù)電荷與陽離子表面活性劑所帶正電荷之間的強(qiáng)大靜電引力作用，致使漆酶的催化活性發(fā)生變化，甚至導(dǎo)致了部分酶的變性，因此木素模式物的降解率較低；而在陰離子表面活性劑AOT和鼠李糖脂中膠束的負(fù)電勢(shì)促使酶-底物復(fù)合物形成幾率增加，有利于漆酶催化底物，相比鼠李糖脂構(gòu)建的反膠束， AOT分子極性頭的靜電作用以及酶分子與反膠束之間的疏水相互作用對(duì)酶活性產(chǎn)生的不利影響，另外，在非離子表面活性劑體系中，漆酶并沒有表現(xiàn)出很高的活性，可以推斷，表面活性劑分子與漆酶分子間的靜電斥力有助于提高漆酶的催化效率，而靜電引力作用對(duì)漆酶的催化降解反應(yīng)有著一定的抑制作用［6］.

2.4 反膠束中酶催化動(dòng)力學(xué)研究

圖3 不同底物濃度下反應(yīng)初始速率的Hanes-Woolf曲線Fig.3 Hanes-Woolf plot of initial velocity at different substrate concentrations

表1 酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)表Table 1 Summary of experimental kinetic parameters of the enzymatic reactions in RMs

由圖3計(jì)算出動(dòng)力學(xué)常數(shù)如表1所示，漆酶在生物表面活性劑鼠李糖脂構(gòu)建的反膠束中的催化效率分別是陽離子表面活性劑CTAB、陰離子表面活性劑AOT、非離子表面活性劑Tween 80的2.04、1.28、1.46倍.

2.5 產(chǎn)物分析

漆酶主要催化愈創(chuàng)木酚碳碳鍵和碳氧鍵的斷裂，參與愈創(chuàng)木酚的解聚和聚合反應(yīng).首先底物結(jié)合于酶活性中心一型銅原子位點(diǎn)，通過Cys-His途徑將電子傳遞給三核位點(diǎn)，該位點(diǎn)又把電子傳遞給氧分子，使其還原成水.同時(shí)底物形成自由基，它們可以自身結(jié)合或相互偶聯(lián)，形成聚合物或偶聯(lián)產(chǎn)物［20］.漆酶催化愈創(chuàng)木酚的底物主要為水溶性的4-鄰甲基苯酚（圖4）.

圖4 漆酶催化愈創(chuàng)木酚的過程Fig.4 Oxidative pathway of laccase catalysis guaiacol

此外，生物表面活性劑構(gòu)建的反膠束體系與化學(xué)表面活性劑構(gòu)建的反膠束體系相比，達(dá)到最佳酶活所需的表面活性劑濃度較低，增溶水的能力比化學(xué)表面活性劑構(gòu)建的反膠束強(qiáng)，漆酶催化效率高.這是由于生物表面活性劑產(chǎn)生于微生物、動(dòng)物或植物的代謝過程中，不僅除具有低毒、選擇性好、環(huán)境友好、易被微生物降解等優(yōu)點(diǎn)，還能夠增強(qiáng)酶與底物的吸附作用［6-7］，使其構(gòu)建的反膠束體系具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性.另外，生物表面活性劑具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，其中一些特殊的官能團(tuán)，使其表現(xiàn)出較強(qiáng)的專一性［21］，從而避免了其他其它因素的干擾.這即體現(xiàn)了生物表面活性劑的優(yōu)勢(shì)所在，說明生物表面活性劑其在構(gòu)建反膠束體系及增強(qiáng)反膠束穩(wěn)定性能上具有著特殊的潛力［22-23］.

3 結(jié)論

3.1 不同種類表面活性劑反膠束體系中，含水率w0對(duì)酶活的影響差別較大，CTAB、Tween 80、 AOT和鼠李糖脂4種表面活性劑構(gòu)建的反膠束體系最佳表面活性劑濃度和對(duì)應(yīng)的最佳含水率分別為為CTAB濃度20mmol/L，w0=20； Tween 80濃度50mmol/L，w0=25；AOT濃度30mmol/L， w0=10；鼠李糖脂濃度10mmol/L， w0=30.

3.2 在最適佳含水率條件下制備構(gòu)建的反膠束體系中，各表面活性劑在底物濃度為1mmol/L時(shí)，CTAB、Tween80、AOT和鼠李糖脂4種反膠束體系中木質(zhì)素模式物的漆酶降解效率分別為21.33%、30.85%、36.02%、65.45%.

3.3 在陽離子、陰離子和非離子幾種類型的表面活性劑中，同屬于陰離子表面活性劑的AOT和鼠李糖脂構(gòu)建的反膠束體系的底物降解率均高于CTAB和Tween 80體系，說明陰離子表面活性劑更適宜漆酶的反應(yīng)，且鼠李糖脂反膠束中漆酶的活性和穩(wěn)定性均高于AOT反膠束，說明使用生物表面活性劑代替化學(xué)表面活性劑有利于提高反膠束體系中酶的催化性能.

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Guaiacol catalysis by laccase in the reverse micellar systems.

LIU Huan， YUAN Xing-zhong*， PENG Xin， BAO Shan，MA Yu-jie， WU Xiu-lian， ZENG Guang-ming
（College of Environmental Science and Engineering， Hunan University，Changsha 410082， China）.

China Environmental Science， 2015，35（2）：493～498

In order to investigate the characteristics of the catalytic activity of laccase， several types of surfactants were adopted to construct reverse micelles， using guaiacol as substrate. The activity of laccase activity was measured to determine the optimum surfactant concentration and corresponding water solubilization w0of CTAB， Tween-80， AOT and rhamnolipid reverse micelle systems. The optimum surfactant concentrations were 20， 50， 30， 10mmol/L with corresponding water content of 20， 25， 10， 30mmol/L for CTAB， Tween-80， AOT and rhamnolipid reverse micellar systems， respectively. Under this condition the effects of surfactant type on the catalytic activity of reverse micellar systems were studied. The transforming rate of substrate in the micellar system constructed by anionic surfactant was higher than these of the others， and the rhamnolipid micelle system performed best. After 6h， the conversion rate of rhamnolipid reverse micellar systems compared with CTAB，Tween-80and AOT reverse micelle systems were 44.12%，34.6% and 29.43% higher， respectively.

reverse micelle；laccase；guaiacol；surfactant；rhamnolipid

X712

A

1000-6923（2015）02-0493-06

劉 歡（1990-），女，湖南寧鄉(xiāng)人，湖南大學(xué)碩士研究生，

2014-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（50978087）

* 責(zé)任作者， 教授， yxz@hnu.edu.com

主要從事固廢資源化方面的研究.