鞣云實(shí)素對(duì)果糖溶液喂養(yǎng)大鼠血清中IAPP、GLP-1及INS的影響

張建博，陳　平，謝　雨，龔建瑜，范 源

（1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南　昆明　650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南　昆明　650500；3.云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南　昆明　650500）

鞣云實(shí)素對(duì)果糖溶液喂養(yǎng)大鼠血清中IAPP、GLP-1及INS的影響

張建博1，陳平1，謝雨2，龔建瑜1，范 源3

（1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南昆明650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500；3.云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500）

目的果糖溶液喂養(yǎng)Wistar雄性大鼠，注射Wistar大鼠不同濃度的鞣云實(shí)素檢測(cè)大鼠體內(nèi)胰島淀粉樣多肽（IAPP）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）及胰島素（INS）濃度的變化。方法Wistar大鼠給予相同濃度果糖溶液連續(xù)灌胃3周，第4周腹腔注射不同濃度的鞣云實(shí)素溶液，隔1 d注射1次，連續(xù)注射3次，第7天取大鼠血清，利用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中胰島淀粉樣多肽、胰高血糖素樣肽-1及胰島素的濃度。結(jié)果果糖溶液喂養(yǎng)后胰島素分泌減少、胰島淀粉樣多肽濃度降低、胰高血糖素樣肽-1濃度升高；注射20 mg·kg-1鞣云實(shí)素溶液后胰島素分泌增多、胰島淀粉樣多肽濃度明顯降低、胰高血糖素樣肽-1濃度明顯增高；注射40 mg·kg-1鞣云實(shí)素溶液后胰島素分泌與對(duì)照組相比明顯減少、胰島淀粉樣多肽濃度明顯增高且高于對(duì)照組、胰高血糖素樣肽-1濃度明顯降低。結(jié)論低濃度鞣云實(shí)素能夠促進(jìn)胰高血糖素樣肽-1生成、刺激胰島素分泌及抑制胰島淀粉樣多肽的形成，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究鞣云實(shí)素對(duì)胰島素抵抗大鼠模型的相關(guān)激素變化提供一定基礎(chǔ)。

鞣云實(shí)素；Wistar大鼠；果糖；胰島淀粉樣多肽；胰島素；胰高血糖素樣肽-1

近年來(lái)，隨著生活質(zhì)量不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)不斷改變，果糖攝入過(guò)多的現(xiàn)象趨于普遍，代謝綜合征的患病率也隨之升高且趨于早齡化，已嚴(yán)重威脅人類的健康。近期研究表明，健康人群長(zhǎng)期攝入過(guò)多果糖會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗［1］，且胰島素抵抗是代謝綜合征的主要病因之一，此外，長(zhǎng)期攝入果糖會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡率增加。Maiztegui等［2］在研究中，對(duì)成年Wistar大鼠用10％果糖溶液喂養(yǎng)3周，利用碘化丙啶染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，攝入果糖組與正常組相比胰島β細(xì)胞凋亡率明顯增加且有顯著性差異，提示果糖可能具有誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的作用。

鞣云實(shí)素又名柯里拉京（Corilagin.Cor），屬于天然多酚類化合物，白色針形晶體粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)試劑，分子式為C27H22O18，分子量634.46，是余甘子、老鶴草、葉下珠、龍眼等藥材的有效成分。鞣云實(shí)素具有保肝［3］、抑制病毒［4］、降血壓［5］、抗炎［6］、抗腫瘤［7］、抗菌［8］、抗氧化［9］等多種生物活性。關(guān)于鞣云實(shí)素治療糖尿病的相關(guān)報(bào)道較少，

目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用果糖溶液喂養(yǎng)大鼠的相關(guān)文獻(xiàn)不多，果糖所致胰島β細(xì)胞功能障礙與胰島素（INS）、胰島淀粉樣多肽（IAPP）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）之間的關(guān)系需進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)觀察鞣云實(shí)素對(duì)果糖溶液喂養(yǎng)后大鼠血清中INS、IAPP、GLP-1濃度的影響，為研究鞣云實(shí)素對(duì)果糖溶液喂養(yǎng)大鼠的藥理活性提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠（簡(jiǎn)陽(yáng)達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXKC11172013-24）；鞣云實(shí)素（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；果糖（華北制藥華源有限公司）；飼料（昆明醫(yī)科大學(xué)）；酶聯(lián)免疫分析試劑盒96T（上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2儀器離心機(jī)（Hitachi CF16RXII，日本日立）；352型酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan MS，芬蘭）；洗板機(jī)（AC8 Thermo Labsystems，芬蘭）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1建立模型及分組給藥取Wistar大鼠24只隨機(jī)分成4組，即正常組、對(duì)照組、低濃度的鞣云實(shí)素組、高濃度的鞣云實(shí)素組，除正常組外其他3組均用20％濃度的果糖溶液喂養(yǎng)，喂養(yǎng)時(shí)間為3周。根據(jù)低濃度組大鼠腹腔注射20 mg·kg-1，高濃度組40 mg·kg-1，分別配制低濃度的鞣云實(shí)素溶液與高濃度的鞣云實(shí)素溶液：4 mg·mL-1與8 mg·mL-1，腹腔注射鞣云實(shí)素溶液5 mL·kg-1，注射間隔為1 d，第7天目?jī)?nèi)眥取血2 mL于離心管中，10 000 rpm離心10 min，取上清液作為測(cè)定硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（TXNIP）、IAPP、INS指標(biāo)的待測(cè)物。

2.2酶聯(lián)免疫分析測(cè)定INS、IAPP及GLP-1試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)所指示在小試管中進(jìn)行稀釋。分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30 min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。再次培育，再次洗滌，每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

2.3數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，且用表示，組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)，P ＜0.05判定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

喂果糖組（對(duì)照組）與正常組相比，INS呈下降趨勢(shì)，注射20 mg·kg-1鞣云實(shí)素后與對(duì)照組相比，INS有一定的升高，當(dāng)注射40 mg·kg-1鞣云實(shí)素后INS明顯下降且比對(duì)照組INS濃度低，高濃度組與對(duì)照組相比具有差異性，對(duì)照組與正常組相比具有顯著性差異（見(jiàn)圖1）；與正常組相比喂果糖后IAPP有降低的趨勢(shì)，注射20 mg·kg-1鞣云實(shí)素后與對(duì)照組相比IAPP濃度有明顯的下降，當(dāng)注射40 mg·kg-1鞣云實(shí)素時(shí)IAPP濃度有明顯的增高，且比對(duì)照組濃度高，對(duì)照組與正常組相比具有差異性，與低濃度組及高濃度組相比具有顯著性差異（見(jiàn)圖2）；喂果糖組與正常組相比GLP-1濃度升高，注射20 mg·kg-1鞣云實(shí)素后與對(duì)照組相比GLP-1濃度明顯升高，當(dāng)注射40 mg·kg-1鞣云實(shí)素時(shí)GLP-1濃度急劇下降，且比對(duì)照組的濃度低，對(duì)照組與正常組相比具有差異性，對(duì)照組與低濃度組相比具有顯著性差異（見(jiàn)圖3）。表1為胰島素抵抗指數(shù)，其中正常組與對(duì)照組相比、對(duì)照組與低濃度組及高濃度組相比，胰島素抵抗指數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明沒(méi)有產(chǎn)生胰島素抵抗。

4　討論

果糖在體內(nèi)會(huì)代謝成游離脂肪酸和甘油三酯，長(zhǎng)期高濃度游離脂肪酸可抑制胰島素合成與分泌，加速胰島β細(xì)胞凋亡。果糖通過(guò)抑制糖異生作用以及糖原分解作用可導(dǎo)致胰島素抵抗以及代謝綜合征的產(chǎn)生，影響胰島β細(xì)胞功能。高果糖喂養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能紊亂已被廣泛地應(yīng)用于建立胰島素抵抗模型在糖尿病及其并發(fā)癥的相關(guān)研究中。此外，果糖可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)線粒體功能也有一定影響。Jaiswal等［10］在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在大鼠L6骨骼肌細(xì)胞系中加入果糖會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，可導(dǎo)致骨骼肌線粒體功能障礙，產(chǎn)生胰島素抵抗作用。

圖1　酶聯(lián)免疫分析INS的數(shù)據(jù)

表1　胰島素抵抗指數(shù)

圖2　酶聯(lián)免疫分析IAPP的數(shù)據(jù)

圖3　酶聯(lián)免疫分析GLP-1的數(shù)據(jù)

IAPP主要存在于胰島β細(xì)胞中，與胰島素共同由胰島β細(xì)胞合成與分泌，IAPP協(xié)同胰島素可以精準(zhǔn)的調(diào)節(jié)人體血糖。近期研究表明，IAPP具有一定的抑制胰島素分泌的作用，Zhu等［11］在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)Wistar大鼠胰腺中胰島β細(xì)胞分離并培養(yǎng)，加入16.7mmol葡萄糖處理1 h后加入0.5、1.0、5.0、10.0 μmol的IAPP預(yù)處理30 min后對(duì)INS進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IAPP的增多會(huì)減少胰島素的分泌，且在5 μmol及10 μmol時(shí)有明顯的差異性。GLP-1是一種主要由腸道L細(xì)胞分泌的激素，其具有刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素的分泌、減少肝糖元輸出、抑制食欲及攝食、減緩胃排空、改善外周組織對(duì)胰島素的敏感性。近期研究發(fā)現(xiàn)，在健康人體內(nèi)口服果糖后GLP-1濃度有明顯的增高趨勢(shì)［12］。此外，GLP-1類似物能夠抑制IAPP前體的形成，從而減少IAPP的產(chǎn)生及積聚沉積［13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，果糖喂養(yǎng)后可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡率有所增加，致使胰島素分泌減少，此時(shí)大鼠血清中GLP-1的濃度略有升高，其可增加胰島素敏感性、抑制IAPP的產(chǎn)生。腹腔注射20 mg·kg-1鞣云實(shí)素后與對(duì)照組相比，胰島素分泌增加、GLP-1濃度明顯增高、IAPP濃度明顯降低，提示低濃度的鞣云實(shí)素可促進(jìn)GLP-1生成的作用，刺激胰島素的分泌，抑制IAPP的形成。當(dāng)注射40 mg·kg-1鞣云實(shí)素后GLP-1的濃度明顯降低且低于對(duì)照組，IAPP濃度有明顯的增高且高于對(duì)照組的濃度，提示鞣云實(shí)素在高濃度時(shí)可能對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性導(dǎo)致其凋亡，致使GLP-1濃度降低，促進(jìn)IAPP形成，減少胰島素的濃度。

本實(shí)驗(yàn)利用酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定果糖喂養(yǎng)大鼠腹腔注射鞣云實(shí)素對(duì)IAPP、GLP-1及INS的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度的鞣云實(shí)素具有增加GLP-1的生成，促進(jìn)胰島素分泌，抑制IAPP的形成的作用；而高濃度的鞣云實(shí)素會(huì)增加IAPP的形成，減少GLP-1濃度且抑制胰島素的分泌，提示：鞣云實(shí)素在低濃度（20 mg·kg-1）鞣云實(shí)素時(shí)可具有保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用，高濃度（40 mg·kg-1）可能對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。本實(shí)驗(yàn)為探索鞣云實(shí)素對(duì)果糖溶液喂養(yǎng)大鼠的藥理活性實(shí)驗(yàn)提供一定研究基礎(chǔ)，為發(fā)現(xiàn)新的可治療糖尿病的天然活性產(chǎn)物提供一定參考。

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The effect of corilagin for IAPP，GLP-1 and INS of rats which fed by fructose

ZHANG Jian-bo1，CHEN Ping1，XIE Yu2，GONG Jian-yu1，F(xiàn)AN Yuan3
（1.College of TCM，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China；2.College of Basic Medicine，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China；3.College of Clinical Medicine，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China）

Objective To feed male Wistar rats with fructose solution，and inject different concentration of corilagin solution to Wistar rats，determine the changes of the concentration of IAPP，GLP-1）and INS in rats serum.Methods To give same concentration of fructose solution to Wistar rats three weeks by intragastric administration.In the fourth week，different concentration of corilagin solution was admined by intraperitoneal injection，once every two days and three times.In the seventh day，blood serum of rats was collected and the concentrations of IAPP，GLP-1 and INS were determined by ELISA.Results After fed fructose solution，the rats secreted insulin was decreased，the concentration of IAPP was reduced and the concentration of GLP-1 was increased；After injected the concentration of 20 mg·kg-1corilagin，the insulin secretion was increased，the concentration of IAPP was decreased significantly，the concentration of GLP-1 was increased significantly；When injected the concentration of 40 mg·kg-1corilagin，the insulin secretion was decreased significantly to compared with control group，the concentration of IAPP was increased significantly and higher than control group，the concentration of GLP-1 was reduced significantly and lower than control group.Conclusion Corilagin at low concentration can promote the generation of GLP-1，stimulate insulin secretion and inhibit the formation of IAPP.The experiment provided some basis on the further research of corilagin for the hormonal changes related to insulin resistance in rats model.

Corilagin；Wistar rat；Fructose；IAPP；INS；GLP-1

R965

A

2095-5375（2015）12-0699-004

張建博，男，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制，E-mail：284529046@qq.com

范源，男，博士研究生，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物活性及糖尿病研究，Tel：13708874680，E-mail：1647909799@qq.com