應用高內涵分析技術進行藥物肝毒性風險評估的研究

高　陽，胡宇馳，左澤平，王志斌，金家金，王立娜，程　源

（1.中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京市保健食品化妝品檢驗中心，北京市藥品檢驗所，北京　100035；2.北京中醫(yī)藥大學，北京　100102）

·實驗研究·

應用高內涵分析技術進行藥物肝毒性風險評估的研究

高陽1，胡宇馳1，左澤平1，王志斌1，金家金2，王立娜2，程源2

（1.中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京市保健食品化妝品檢驗中心，北京市藥品檢驗所，北京100035；2.北京中醫(yī)藥大學，北京100102）

目的研究嘗試應用高內涵分析技術建立藥物肝毒性高內涵毒性評價指數測定的標準方法。方法采用ToxInsight藥物肝毒性檢測試劑盒，利用對多靶點的特異性染色，結合高內涵活細胞成像分析平臺考察4種藥物對人源性肝癌細胞HepG2的細胞毒性作用，包括對該細胞的細胞數、核DNA含量、細胞質內谷胱甘肽降低水平、活性氧水平、線粒體膜電位的改變等5個指標進行綜合分析，擬對受試樣品的肝毒性進行評估。結果氟西汀和羅格列酮的肝毒性評估結果為陰性；甲芬那酸和噻氯匹定的肝毒性評估結果為陽性，提示具有肝毒性風險，且甲芬那酸的肝毒性風險比噻氯匹定的高。結論應用高內涵分析技術評估藥物肝毒性的方法基于活細胞、多參數、實時、高通量，能夠實現(xiàn)藥物多種生物活性、毒性的早期、快速檢測，并且靈敏穩(wěn)定，簡便可行，可嘗試用于對藥物進行體外肝毒性的安全風險評估。

高內涵分析；藥物肝毒性；毒性評估

高內涵分析技術（High content analysis，HCA）是一種基于細胞表型分析的高效篩選技術，能夠在保持細胞結構和功能完整的前提下，同時檢測待測樣品對細胞形態(tài)、生長、周期、遷移、凋亡、代謝途徑及信號傳導等方面的影響，從單一試驗中獲取大量有關信息，從而確定化合物的生物活性以及潛在毒性［1，2］。

藥物肝毒性的評價在新藥研發(fā)及藥物安全風險評估中占重要地位。目前HCA能夠實時監(jiān)測體外肝細胞與毒性機制相關的多個重要標志分子，包括細胞核的形態(tài)和數量、線粒體膜電位以及氧化應激狀態(tài)、凋亡與早期DNA損傷的變化等，是體外評價化合物潛在肝毒性和從機制上預測候選藥物安全性的高效手段。該方法能夠彌補動物實驗靈敏度低、周期長、不能量化的缺點，因此，HCA已成為藥品質量風險與安全風險評估的新技術趨勢［3～5］。

本試驗采用 ToxInsight藥物肝毒性試劑盒，利用對多靶點的特異性染色，結合高內涵活細胞成像分析平臺考察4種藥物對人源性肝癌細胞HepG2的細胞毒性作用，包括對該細胞的細胞數、核DNA含量、細胞質內谷胱甘肽（GSH）降低水平、細胞內活性氧（ROS）水平、線粒體膜電位（MMP）的改變等5個指標進行綜合分析，擬對受試樣品的肝毒性進行評估。嘗試建立藥物肝毒性高內涵毒性評價指數測定的標準方法，以期實現(xiàn)利用HCA對藥物進行體外肝毒性的安全風險評估。

1　材料與方法

1.1細胞人肝癌細胞系HepG2細胞，購自中國細胞庫（上海），本實驗室細胞庫保存；細胞用DMEM完全培養(yǎng)基［含15％的胎牛血清（FBS，V/ V），100 U·mL-1的青鏈霉素］培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2。

1.2藥物和對照品氟西?。ㄅ枺篧XBB5990V）、羅格列酮（批號：034M4736V）、噻氯匹定（批號：101296953）、甲芬那酸（批號：MKBR7799V）均購于Sigma公司。陰性對照品阿司匹林（批號：00209，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.3主要儀器與試劑體外毒性分析平臺（美國Thermo Scientific Cellomics），該系統(tǒng)主要組成部分是：熒光顯微系統(tǒng)、自動化熒光圖像獲取系統(tǒng)、檢測儀器、圖像處理分析軟件、結果分析和數據管理系統(tǒng)等；Vortex Genie-2型渦流振蕩器；超凈工作臺；倒置顯微鏡；臺式離心機；電子天平；Napco Model 5410型CO2培養(yǎng)箱；全自動細胞計數儀。

高內涵肝毒性試劑盒（批號：0k192906，Thermo Scientific Cellomics）；Ⅰ型膠原蛋白包被的96孔細胞培養(yǎng)板（批號：354407，BD公司）；DMEM培養(yǎng)基（批號：1294154，Gibco公司）；標準胎牛血清（批號：20130726，天津市灝洋生物制品科技有限公司）；青鏈霉素（批號：1308300，Gibco公司）；胰蛋白酶（批號：2035B358-0458，Amresco公司）；PBS（NaCl 8 g·L-1，KCl 0.2g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3.4g·L-1，KH2PO40.2g·L-1，pH 7.2）；二甲基亞砜（DMSO）（批號：2035B358-0231，Amresco公司）等。

1.4HepG2細胞準備HepG2細胞復蘇傳代生長至70％～90％后，棄去培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)基，PBS清洗2 ～3次，0.25％胰蛋白酶覆蓋細胞約30 s后吸去胰酶，37℃放置2～3 min，加入含15％FBS的 DMEM完全培養(yǎng)基終止消化并吹打細胞，制備細胞混懸液并計數。完全培養(yǎng)基調整細胞濃度至2.0× 105·mL-1。將調整好密度的細胞液接種到Collagen-Ⅰ包被的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL（即20 000個/孔）。將培養(yǎng)板置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h。

1.5樣品配制無菌條件下配制。陰性對照品和各樣品均以200×Cmax（最大血藥濃度）為最高劑量，在無菌EP管內用無血清DMEM培養(yǎng)基依次向下倍比稀釋7個濃度，振蕩混勻備用。終濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.6Cmax。陰性對照品阿司匹林的Cmax為0.995 μg·mL-1；各樣品Cmax分別為：氟西汀0.015 μg·mL-1、羅格列酮0.373 μg·mL-1、噻氯匹定2.13μg·mL-1、甲芬那酸6.5μg·mL-1（藥物肝毒性試劑盒說明書提供）。

1.6加樣操作無菌條件下操作，依次將各樣品和陰性對照品加入培養(yǎng)板孔內，每個濃度重復3孔，每塊培養(yǎng)板設溶媒對照（即無血清培養(yǎng)基）24孔，每孔100 μL。將加樣后培養(yǎng)板置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.7染色測試當天，按藥物肝毒性試劑盒說明書配制Monochlorobimane（mBCl）染色液、ROS染色液、Hoechst 33342及Mito染色液。小心吸去培養(yǎng)板內的液體，加入配制好的染液，每孔100 μL。培養(yǎng)板置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min。將板孔內液體小心吸去，用放置至室溫的PBS溶液清洗1遍，再在每孔中加入100 μL PBS，待測。

1.8肝毒性檢測采用高內涵分析平臺的DILIAcqonly模塊采集圖像。采集條件如下：第一通道波長為360 nm/460 nm檢測Hoechst 33342標記的細胞核DNA并記錄細胞數，第二通道波長為380 nm/ 461 nm檢測mBCl標記的GSH，第三通道波長為504 nm/529 nm檢測 ROS Dye標記的ROS，第四通道波長為584 nm/606 nm檢測Mito Dye標記的線粒體膜電位；選擇20倍物鏡，每孔采集9個視野的圖像，存儲信息用于圖像分析。

1.9肝毒性分析采用DILI-HepG2-HELLY分析軟件對細胞核數量、核面積、核DNA、谷胱甘肽（GSH）、過氧化物（ROS）、線粒體膜電位（MMP）進行定位和定量分析，并以細胞數量、核DNA含量、GSH水平、ROS水平和MMP改變參數形式表示。最終數據在Excel工作表的DILI模塊中計算匯總，以統(tǒng)計學方式將多個單參數結果匯總成稱為“毒性指標”的多參數計算值，比較不同樣品之間和不同劑量之間的毒性風險。

2　結果

2.1對HepG2細胞凋亡的影響試驗結果顯示，不同濃度的4種藥物與HepG2細胞分別作用24 h后，甲芬那酸和噻氯匹定對細胞存活有明顯的抑制作用，能明顯抑制HepG2細胞的增值。而氟西汀和羅格列酮與陰性對照（阿司匹林）相比，細胞數量無顯著差異。Hoechst 33342染色結果表明，陰性對照的細胞核呈均勻的熒光（E），而甲芬那酸和噻氯匹定分別作用24 h后，隨藥物濃度的增加，出現(xiàn)不同程度的細胞核皺縮，染色質凝集，細胞數量明顯減少，顯示細胞凋亡的特征。如圖1所示。

圖1　4種藥物對HepG2細胞的細胞狀態(tài)和熒光強度的比較結果（200×Cmax）

2.2對HepG2細胞GSH和ROS的影響如圖2所示，甲芬那酸隨劑量的增加，GSH水平基本呈現(xiàn)下降趨勢，同時，ROS水平則呈上升趨勢。200× Cmax濃度時，GSH水平降至陰性對照的閾值以下，顯示出毒性預警。而氟西汀各劑量組的GSH和ROS均在陰性對照的安全閾值以內，提示無毒性風險。

2.3對HepG2細胞線粒體膜電位的影響高內涵熒光成像系統(tǒng)結果顯示，陰性對照的細胞膜電位最高，呈現(xiàn)紫紅色熒光，熒光強度較強。甲芬那酸和噻氯匹定細胞紅色熒光逐漸減弱。隨濃度的增加，對應的紅色熒光強度的細胞群比例有所下降，且熒光強度降低。甲芬那酸隨濃度的增加，線粒體膜電位的水平顯著降低，超出陰性對照的安全閾值的下限范圍，提示具有毒性風險。如圖2、3所示。

2.4肝毒性風險評估DILI-HepG2-HELLY分析軟件對細胞數量、核DNA含量、GSH水平、ROS水平和MMP改變5項參數匯總，以統(tǒng)計學方式將多個單參數結果匯總成“毒性指標”的多參數總結果，氟西汀和羅格列酮5項檢測指標均為陰性，提示無肝毒性風險。噻氯匹定細胞數量、GSH水平和MMP改變3項檢測指標為陽性，甲芬那酸5項檢測指標也均為陽性，提示噻氯匹定和甲芬那酸具有肝毒性風險，且甲芬那酸的毒性風險比噻氯匹定的高，具有更高的毒性預警，結果見表1。

表1　4種目標藥物肝毒性分析結果（DILI分析模塊）

3　討論

以陰性對照（阿司匹林）確定毒性閾值（細胞增值不認為是一種毒性反應，不設上限；低水平的ROS不認為是一種毒性反應，不設下限），分析各個靶點上的毒性反應，運用多個參數進行肝毒性預測及等級排序。藥物的毒性反應是根據所有濃度下各個靶點的毒性結果的綜合評價。通過對5個測量靶點的觀察，若有一個靶點的任何一個濃度反應超過毒性閾值，則確定該藥物有毒性，從而解決沒有直接量效曲線的問題。本試驗中，氟西汀和羅格列酮結果為陰性，提示在試驗劑量下無肝毒性風險。高劑量的甲芬那酸和噻氯匹定能顯著抑制HepG2細胞的增值，誘導其凋亡，檢測結果為陽性，表現(xiàn)出一定的肝毒性風險，且甲芬那酸的毒性風險比噻氯匹定的高。試驗結果與美國Thermo公司提供的國外試驗數據結果基本一致。該方法基于活細胞、多參數、實時、高通量，能夠實現(xiàn)藥物多種生物活性、毒性的早期、快速檢測，并且靈敏穩(wěn)定，簡便可行，可嘗試用于對藥物進行體外肝毒性的安全風險評估［6］。

圖2　甲芬那酸（1）和氟西?。?）抑制HepG2細胞增殖，對HepG2細胞數、DNA損傷、GSH水平、ROS水平和MMP變化的影響（量效曲線）

試驗表明，藥物HCA不但可以闡明被篩樣品與藥靶之間的相互作用關系，而且還能同時了解細胞的其它生物學改變，通過觀察細胞形態(tài)來預測化合物的毒性以及進行相關代謝途徑的研究，彌補了現(xiàn)有毒理學篩選方法在通量、毒性機制檢測、潛在毒性揭示等方面的不足，是毒理學新興和最具效率的技術［7，8］。常規(guī)的細胞毒性檢測內容包括膜完整性的喪失或細胞溶解、凋亡、關鍵大分子損耗、代謝抑制效應和增殖抑制效應等。這些檢測可以初步觀察化合物毒性特點。然而，不同的方法分開進行，既耗時且難以獲得一致的試驗數據。HCA用于細胞毒性測定，在一次試驗中平行監(jiān)測與毒性機制相關的多個參數甚至是信號轉導分子，更能全面準確地反映化合物誘導的毒性特征及潛在機制［9，10］。

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Study on the risk assessment of drug hepatoxicty by high content analysis

GAO Yang1，HU Yu-chi1，ZUO Ze-ping1，WANG Zhi-bin1，JIN Jia-jin2，WANG Li-na2，CHENG Yuan2（1.Beijing Key Laboratory of Analysis and Biological Evaluation of Traditional Chinese Medicine
Composition，Beijing Center for Health Food and Cosmetics Control，Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100035，China；2.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To study a standard method for the determination of drug hepatoxicty evaluation index using high content analysis.Methods To investigate the cytotoxic effect of four drugs on HepG2cells in human hepatocellular carcinoma cells by using ToxInsight Drug Induced Liver Injury Assay Cartridge and combining high content live cell imaging analysis platform.Through the comprehensive analysis of 5 indexes，the number of cells，DNA content，GSH level，ROS level and mitochondrial membrane potential，the liver toxicity of the tested samples were evaluated.Results The results of fluoxetine and rosiglitazone were negative.The results of mefenamic acid and ticlopidine were positive，which indicated that the risk of liver toxicity was high，and the risk of liver toxicity of mefenamic acid was higher than that of ticlopidine.Conclusion HCA was based on living cells，multi parameters，real-time and high content，can achieve a variety of biological activity，drug toxicity of the early and rapid detection.It was sensitive，stable，simple and feasible.HCA can be used to evaluate the risk of drug hepatoxicty in vitro.

High content analysis；Drug induced liver injury；Assessment of toxicity

R965

A

2095-5375（2015）12-0688-005

2013年北京市科技計劃項目（No.Z131100005613032）

高陽，女，研究方向：藥物藥理學與毒理學研究，E-mail：gaoyang527@yeah.net

胡宇馳，男，主管藥師，研究方向：藥物藥理學與毒理學研究，Tel：010-83229474，E-mail：yuchihu@bidc.org.cn