紙基—表面增強拉曼光譜法快速檢測弱主藥信號藥品中的主藥成分

李曉+陳夢云+王磊+張倩倩+方芳+苗麗+陸峰

摘 要 建立了弱主藥信號藥品中主藥成分的紙基-表面增強拉曼光譜（SERS）快速檢測方法。采用浸泡法制備納米銀溶膠濾紙SERS基底（簡稱銀膠紙），將待檢樣品滴加于銀膠紙上進行SERS檢測。通過考察銀膠紙制備條件、銀膠紙增強能力、SERS檢測結果，建立用于弱主藥信號藥品中主藥成分的快速檢測方法。通過本方法獲得弱主藥信號藥品中主藥成分的SERS圖譜，與其對應標準品圖譜的相關系數(shù)大于0.9，較好地檢測出弱主藥信號藥品中的主藥成分，有效克服了常規(guī)拉曼光譜分析的不足之處。新型銀膠紙制備簡單、增強效果明顯，與SERS法結合可簡便、快速、準確地實現(xiàn)對弱主藥信號藥品中主藥信號的檢測，在弱主藥信號藥品快檢中具有廣闊的應用前景。

關鍵詞 銀膠紙； 表面增強拉曼光譜； 弱主藥信號藥品； 相關系數(shù)

1 引 言

近年來，新藥研發(fā)的大方向是高效低毒，因此藥品中主藥成分（API）的含量總體趨勢是越來越低，即主藥含量通常遠低于輔料，主藥基本被掩埋于輔料中。目前針對此類藥品的檢測基本上仍是停留在實驗室分析中，如常用的高效液相色譜法[1]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[2]、光譜成像技術[3]等，但上述分析儀器龐大昂貴、操作復雜、專業(yè)技術要求高、分析耗時長，無法滿足現(xiàn)場快檢分析的需求。然而，當采用基于光譜法，如近紅外光譜法[4，5]、拉曼光譜法[6，7]等快檢分析時，主藥成分信息通常被部分或全部掩蓋于輔料的光譜信息中，呈現(xiàn)弱主藥信號現(xiàn)象，導致假陰性、假陽性或無法判別的情況，從而給藥品監(jiān)督檢驗帶來很大困難。

在常規(guī)拉曼光譜（NRS）基礎上發(fā)展起來的表面增強拉曼光譜（SERS）能較好地彌補NRS的不足。SERS技術更可使NRS信號增強105倍以上，其基底[8]也是多種多樣，尤其是納米銀溶膠濾紙（以下簡稱“銀膠紙”），因其制備簡單、攜帶方便等優(yōu)勢，結合SERS技術在環(huán)境樣品分析[9]、中藥材染色篩查[10，11]等領域得到了應用，但在弱主藥信號藥品研究中尚未見報道。

本研究以新型銀膠紙作為SERS基底，以幾種弱主藥信號藥品（阿司咪唑片、苯磺酸氨氯地平片、鹽酸特拉唑嗪片、鹽酸西替利嗪片）為研究對象，采用研磨、溶解、離心等操作提取主藥成分后， 進行SERS檢測。此類藥品及其標準品NRS圖譜相關系數(shù)小于0.2，而SERS圖譜相關系數(shù)大于0.9，因此 SERS技術能較好地增強弱主藥信號藥品中的主藥成分信號，且方法操作簡單、高效快捷、精密度好，為當前盛行的小劑量、強藥效、弱主藥信號藥品快檢提供了有力支撐，從而較好地保障藥品的質(zhì)量安全。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

BWS415-785H型便攜式拉曼光譜儀（美國B&W Tek 公司），激發(fā)波長785 nm，分辨率3 cm

1，光譜范圍175 ～ 2700 cm；ALPHA型傅立葉變換紅外光譜儀（Bruker 公司），光譜范圍00～4000 cm

，分辨率4 cm1；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG16-WS型高速離心機（上海盧湘儀離心機有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；掃描電子顯微鏡（德國Zeiss EVO MA-10 Carl-Zeiss公司）。

阿司咪唑、苯磺酸氨氯地平、鹽酸特拉唑嗪、鹽酸西替利嗪、對乙酰氨基酚標準品均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為100301-199901， 100374-201204， 100375-201103， 100660-201102， 100018-200408；實驗所用藥品均購自市售藥店。

AgNO3、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、甲醇等試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；定量濾紙（杭州沃華濾紙有限公司）；實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 溶液的配制

2.2.1 標準品溶液

分別準確稱取阿司咪唑、苯磺酸氨氯地平、鹽酸特拉唑嗪、鹽酸西替利嗪標準品適量，加甲醇溶解，分別制成5 mg/mL的溶液，作為標準品溶液備用。

2.2.2 樣品溶液 分別取阿司咪唑片（規(guī)格：3 mg）、苯磺酸氨氯地平片（5 mg）、鹽酸特拉唑嗪片（2 mg）、鹽酸西替利嗪片（10 mg）各1片，研碎，溶于1 mL甲醇中，超聲30 min，離心取上清液，作為樣品溶液備用。

2.3 銀膠紙的制備

將5 mL AgNO3-PVP（0.02 mol/L AgNO3、 9 mg PVP）混合溶液加入至50 mL 沸騰的DMF中，繼續(xù)加熱一段時間后，倒入棕色瓶中，冷卻備用。

將普通濾紙浸泡于上述銀溶膠中，避光放置 22 h后取出，吹干，將上述濾紙裁剪成1 cm×1 cm方形備用。

2.4 SERS檢測

取上述樣品溶液與標準品溶液各10 μL，分別滴加于銀膠紙上，滴加區(qū)立即進行檢測，激光功率為180 mW，積分時間為15 s，得到各自的SERS圖譜并進行比對。

2.5 數(shù)據(jù)處理

利用Matlab2013a對光譜數(shù)據(jù)進行譜段選?。?00～1800 cm1）、基線校正、平滑濾噪，矢量歸一化等預處理后，采用統(tǒng)計學方法計算相關系數(shù)，如公式 （1） 所示。采用Origin 8.0 軟件對最終結果進行繪圖。

R=ni=1（Xi·Yi）ni=1X2i·ni=1Y2i（1）

式中，X和Y分別代表樣品與標準品光譜數(shù)據(jù)，i代表每條光譜的第i個變量，n為該條光譜變量總數(shù)。

圖1 對乙酰氨基酚片（a）與其標準品（b）的拉曼光譜

Fig.1 Raman spectra of paracetamol tablet （a） and its standard （b）endprint

3 結果與討論

3.1 弱主藥信號藥品篩選

3.1.1 弱主藥信號藥品與強主藥信號藥品對比

以對乙酰氨基酚片為例，檢測NRS，并與其標準品NRS進行對比（如圖1），其相關系數(shù)為0.9978，表明樣品常規(guī)拉曼光譜中幾乎完全是主藥信號，輔料對檢測無干擾，故可作為強主藥信號藥品。

將阿司咪唑片、苯磺酸氨氯地平片、鹽酸特拉唑嗪片、鹽酸西替利嗪片及其標準品NRS光譜進行對比（如圖2），得到相關系數(shù)分別為0.1711， 0.1562，

0.0534和0.129，均低于0.2，表明樣品NRS幾乎未檢測出主藥成分圖譜，輔料嚴重干擾檢測，由此可見，此類藥品的檢測難度遠大于強主藥信號藥品。一般情況下，NRS無法達到對此類弱主藥信號藥品快速檢測的目的。

圖2 4種藥品（a）與其標準品（b）的拉曼光譜

Fig.2 Raman spectra of the four drugs （a） and their standards （b）

A： 阿司咪唑片； B： 苯磺酸氨氯地平片； C： 鹽酸特拉唑嗪片； D： 鹽酸西替利嗪片。

A： Astemizole tablet； B： Amlodipine besylate tablet； C： Terazosin hydrochloride tablet； D： Cetirizine hydrochloride tablet.

3.1.2 弱主藥信號藥品解析 經(jīng)過深度剖析，將上述4種藥品與輔料乳糖的NRS圖譜[12]對比（圖3A），相關系數(shù)分別為0.9483， 0.9512， 0.9626和0.9878，表明該類藥品拉曼光譜幾乎反映的是乳糖信號。由于NRS是散射光譜，部分物質(zhì)拉曼極化效應弱，對物質(zhì)檢測有一定局限性，而通常紅外光譜與拉曼光譜能互相補充，互相佐證。因此，將上述4種藥品與乳糖的紅外圖譜對比（圖3B）發(fā)現(xiàn)，相關系數(shù)分別為0.9746， 0.9718， 0.9566和0.9595，該類藥品紅外光譜檢測出的同樣是輔料乳糖的信號，由此可進一步說明，弱主藥信號藥品存在主藥信號被輔料信號覆蓋的問題。

圖3 弱主藥信號藥品及乳糖的拉曼光譜（A）與紅外光譜（B）

Fig.3 Raman spectra （A） and infrared spectra （B） of weak active pharmaceutical ingredient （API） signal drugs and lactose

a： 阿司咪唑片； b： 苯磺酸氨氯地平片； c： 鹽酸特拉唑嗪片； d： 鹽酸西替利嗪片； e： 乳糖。

a： Astemizole tablet； b： Amlodipine besylate tablet； c： Terazosin hydrochloride tablet； d： cetirizine hydrochloride tablet； e： lactose.

3.2 銀膠紙制備條件優(yōu)化

3.2.1 銀溶膠表征 DMF溶劑膠的紫外吸收光譜如圖4A。其最大吸收峰在420 nm處，呈單峰且半峰寬較窄，表明此峰為銀納米粒子的等離子共振吸收峰，呈球形均勻分布。掃描電鏡結果（圖4B）也證明其呈球形均勻分布，且銀納米粒子直徑約為50 nm [13]。

圖4 DMF溶劑膠的紫外-可見吸收光譜（A）及電鏡（B）表征圖

Fig.4 UV-vis spectra （A） and SEM image （B） of silver colloids

圖5 （a） Lee法銀溶膠浸泡的銀膠紙和（b）DMF溶劑膠浸泡的銀膠紙的SERS圖譜

Fig.5 Ag NPs-paper synthesized by Lee method （a） and N，N-dimethylformide （DMF） method （b）

3.2.2 銀溶膠考察 采用Lee法銀溶膠[14]與DMF溶劑膠[15]分別浸泡濾紙相同時間后，以羅丹明（10

4 g/mL）為探針，在相同檢測條件下獲得兩種銀膠紙的SERS圖譜（圖5）。由圖5可知， Lee法銀溶膠制備的銀膠紙的增強效果遠低于DMF溶劑膠制備的銀膠紙，造成該現(xiàn)象可能因為DMF溶劑膠在濾紙上沉積量大。SERS檢測時，待測分子與銀納米粒子間距適宜，且均勻分布，才會有更好的活性及增強效果。如圖6所示，DMF溶劑膠的銀納米粒子在濾紙上沉積量大，且分布均勻（圖6A），而Lee法銀溶膠在濾紙上沉積量較?。▓D6B），故SERS增強效果較差。

圖6 DMF溶劑膠浸泡的銀膠紙（A）與銀溶膠浸泡的銀膠紙（B）的電鏡表征圖

Fig.6 SEM image of Ag NPs-paper synthesized by DMF method （A） and Lee method （B）

3.2.3 浸泡時間考察 DMF膠浸泡濾紙得到的銀膠紙呈棕色，隨著浸泡時間延長，銀膠紙顏色加深，而其增強能力也發(fā)生相應變化，本實驗以羅丹明 （10

g/mL）為探針，考察不同浸泡時間（2， 7， 12， 17， 22， 27和32 h）膠紙的增強能力（圖7A）。選取612 cm

處峰為特征峰，將3次制備的銀膠紙分別進行檢測，以3次峰強的平均值作圖（圖7B），當浸泡時間超過27 h后，增強效果較之前有大幅降低，其原因可能是長期暴露于空氣中的銀溶膠發(fā)生了氧化或團聚，而22 h時增強效果最佳?？紤]到銀膠紙的增強能力與顏色加深易被激光破壞的特點，最終選擇22 h為最優(yōu)浸泡時間。

圖7 銀膠紙不同浸泡時間的增強效果（A）及其散點圖（B）endprint

Fig.7 The enhanced intensity of Ag NPs-paper at different soaking time （A） and its scatterplot （B）

3.3 銀膠紙增強能力考察

3.3.1 銀膠紙與濾紙檢測結果比較 以鹽酸西替利嗪片為例，將樣品溶液直接滴加于濾紙上進行拉曼檢測（圖8A），所得拉曼圖譜中只有濾紙背景信號， 而無樣品信息。將樣品溶液直接滴加于銀膠紙上進行SERS檢測（圖8B）時，SERS圖譜中樣品信息得到充分體現(xiàn)。將濾紙與銀膠紙的背景信號比較，濾紙制備成銀膠紙后，其本身的信號減少減弱，對樣品檢測的干擾也變小。

圖8 普通濾紙（A）與銀膠紙（B）的增強能力

Fig.8 The enhanced intensity of filter paper （A） and Ag NPs-paper （B）

a. 背景信號； b. 樣品信號。

a： Background； b： Sample signal.

圖9 濾紙與銀溶膠不同混合方式的增強效果

Fig.9 Intensity of different mixed pattern of paper and Ag NPs-solution

a. 銀溶膠背景信號； b. 方法三； c. 方法二； d. 方法一。

a： Background signal of Ag NPs， b： method 3， c： method 2， d： method 1.

3.3.2 銀溶膠不同加入方式比較 比較銀溶膠加入方式對檢測的影響，方法一是將濾紙浸泡于銀溶膠中制備銀膠紙，再于銀膠紙上滴加樣品溶液進行SERS檢測； 方法二是在濾紙上先滴加銀溶膠， 再滴加樣品溶液進行SERS檢測； 方法三是在濾紙上先滴加樣品溶液， 再滴加銀溶膠進行SERS檢測。

以鹽酸西替利嗪片為例，3種方式所檢測的結果如圖9所示，結果表明，按方法一操作時，立即可檢測到樣品信號， 而無銀溶膠信息干擾； 但以方法二和方法三操作時，檢測多張圖譜后， 只有銀溶膠信號， 而無樣品信號，可能是在這兩種方法中僅通過滴加銀溶膠，在濾紙上沉積的銀納米粒子遠低于銀膠紙上沉積的銀納米粒子數(shù)，待測物分子很難與銀納米粒子結合成有活性的分子以被檢測。在銀溶膠制備過程中， DMF作為溶劑與還原劑，使得銀溶膠有DMF溶劑背景信號存在。然而，方法一中的銀膠紙通過浸泡后烘干，同時使DMF溶劑揮發(fā)，與方法二和方法三中銀溶膠的簡單滴加而存在的DMF溶劑信號相比，方法一中以銀膠紙檢測樣品時，無銀溶膠背景峰的干擾。

3.4 SERS檢測結果

3.4.1 SERS圖譜的匹配 通過優(yōu)化點樣量與激光功率，選取點樣量10 μL，激光功率180 mW，將滴加于銀膠紙上的樣品溶液與標準品溶液立即檢測，得各自SERS圖譜（圖10），并計算其相關系數(shù)，分別為0.9402， 0.9488， 0.9551和 0.9704。可知弱主藥信號藥品經(jīng)過簡單的研磨、溶解、離心，排除了輔料干擾，使主藥信號得以分離，達到鑒別真?zhèn)蔚哪康摹?/p>

圖10 4種弱主藥信號藥品的NRS譜（a標準品）與SERS譜（b樣品、c標準品）

Fig.10 Raman spectra （a： standard） and surface enhanced Raman scattering （SERS） spectra （b： sample， c： standard） of four weak API signal drugs

A： 阿司咪唑片； B： 苯磺酸氨氯地平片； C： 鹽酸特拉唑嗪片； D： 鹽酸西替利嗪片。

A： Astemizole tablet； B： Amlodipine besylate tablet； C： Terazosin hydrochloride tablet； D： Cetirizine hydrochloride tablet.

SERS技術用于檢測弱主藥信號藥品具有高靈敏性，此外為了進一步驗證，對二者檢測的特征峰進行比對，結果如表1所示。通常SERS位移容差范圍在3個波數(shù)內(nèi)（≤3 cm

可視為同一個峰[16]，上述4種藥品與其標準品的SERS圖譜特征峰匹配度極高，可知SERS技術具有很強的專屬性。同時，經(jīng)過分離提取后， 弱主藥信號藥品SERS峰與其標準品NRS特征峰匹配度也很好。

3.4.2 SERS方法精密度考察 為驗證所用方法的可靠性，以鹽酸西替利嗪片為例，對其樣品與標準品平均檢測6次，并計算兩者相關系數(shù)分別為0.9598， 0.9773， 0.9868， 0.9568， 0.9398和0.9425，以相關系數(shù)差異大小為指標，考察方法的精密度。結果表明， 其RSD為1.9%，能滿足分析要求[17]，且本方法獲得的SERS圖譜的重復性和重現(xiàn)性良好，亦達到常規(guī)分析要求。

綜上所述，本研究制備的新型銀膠紙可有效實現(xiàn)紙基-SERS法對弱主藥信號藥品中主藥成分的快速檢測，其中銀膠紙制備簡單、攜帶方便、增強能力強，同時SERS圖譜專屬性強、準確性高，為藥品監(jiān)管部門檢測此類藥品提供有力保障，同時為此類藥品廠家在生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制奠定良好基礎，可見紙基-SERS法在藥品快檢中對弱主藥信號藥品檢測具有廣闊的應用前景。

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