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    脫氧核酶—納米材料復(fù)合物用于生物傳感研究進(jìn)展

    2015-11-16 10:35:22趙旭華孟紅敏龔亮邱麗萍張曉兵譚蔚泓
    分析化學(xué) 2015年11期
    關(guān)鍵詞:生物傳感器評(píng)述納米材料

    趙旭華+孟紅敏+龔亮+邱麗萍+張曉兵+譚蔚泓

    摘 要 脫氧核酶(DNAzyme或DNA酶)是一類具有高效催化活性和特異性識(shí)別功能的DNA分子,可以通過體外篩選方式從隨機(jī)脫氧核苷酸單鏈庫(kù)中獲得,它具有催化效率高、特異性高、穩(wěn)定性好、合成簡(jiǎn)單且修飾方便等優(yōu)點(diǎn)。脫氧核酶與納米材料的結(jié)合, 既保留了脫氧核酶的催化特性和識(shí)別能力, 又引入了納米材料的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,實(shí)現(xiàn)了識(shí)別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的一體化,大大促進(jìn)了生物傳感器的快速發(fā)展。本文主要介紹了金納米顆粒、石墨烯、量子點(diǎn)、磁性納米顆粒等納米材料結(jié)合脫氧核酶用于生物傳感的研究進(jìn)展。

    關(guān)鍵詞 脫氧核酶; 納米材料; 生物傳感器; 評(píng)述

    1 引 言

    納米材料是由粒徑小于100 nm的超細(xì)顆粒構(gòu)成的零維、一維、二維、三維材料的總稱。由于納米材料具有獨(dú)特的尺寸結(jié)構(gòu),所以有著傳統(tǒng)材料不具備的一些特征[1]:(1)表面效應(yīng) 指隨著微粒粒徑的變小, 其表面原子數(shù)與總原子數(shù)之比急劇增大, 從而引起納米微粒性質(zhì)的變化。由于這些納米微粒表面原子處于嚴(yán)重的缺位狀態(tài), 使得它易與其它原子結(jié)合, 達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),故具有很高的化學(xué)活性。(2)小尺寸效應(yīng) 指由于納米顆粒的尺寸變小所引起的光、力、熱、電、磁等宏觀物理性質(zhì)的變化。如納米顆粒的熔點(diǎn)遠(yuǎn)低于塊狀金屬的熔點(diǎn); 當(dāng)金屬納米顆粒的直徑小于10 nm時(shí),就會(huì)失去原有的金屬光澤,呈現(xiàn)出黑色。(3)量子尺寸效應(yīng) 指當(dāng)顆粒的尺寸下降到納米級(jí)時(shí),費(fèi)密能級(jí)附近的電子能級(jí)就會(huì)由準(zhǔn)連續(xù)態(tài)變?yōu)榉至⒛芗?jí),能級(jí)間的間距隨顆粒尺寸的減小而增大。當(dāng)熱能、磁場(chǎng)能或電場(chǎng)能比平均的能級(jí)間距還小時(shí),納米微粒就會(huì)呈顯出一些與宏觀物體截然不同的特性,如由導(dǎo)電的金屬制備的納米顆??梢宰?yōu)榻^緣體。(4)宏觀量子隧道效應(yīng) 是指微觀粒子貫穿勢(shì)壘的能力。納米材料的這些特征使其表現(xiàn)出一系列獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)、磁學(xué)以及催化性能[2,3]。目前, 納米材料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于信息工程、能量?jī)?chǔ)存、生物傳感、分子器件及選擇性催化等研究領(lǐng)域, 并逐漸成為科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)[4~7]。

    脫氧核酶(DNAzyme或DNA酶)是一類具有高效催化活性和特異性識(shí)別功能的DNA分子,可以通過體外篩選方式從隨機(jī)脫氧核苷酸單鏈庫(kù)中獲得[8~12]。脫氧核酶可以催化DNA或RNA切割、DNA水解以及DNA連接等多類反應(yīng)[7,12~15],但常見的脫氧核酶主要包括RNA切割型脫氧核酶與G四聚體脫氧核酶兩大類。與傳統(tǒng)蛋白酶相比,脫氧核酶具有以下優(yōu)點(diǎn): 首先,它的穩(wěn)定性高,在較高溫度下其活性不受影響;其次,脫氧核酶的相對(duì)分子量比較小且具有很高的催化效率; 此外,脫氧核酶的合成簡(jiǎn)單、修飾方便并且受酸度等環(huán)境因素影響比較小。脫氧核酶的上述優(yōu)點(diǎn)使其受到了越來越多研究者的關(guān)注,并且已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域[16~20]。如脫氧核酶可以作為一種工具酶,用于細(xì)胞水平上的基因敲除,即特異性地使某一基因失活, 然后觀察該基因在細(xì)胞生理、生化中的作用,研究該基因的功能,以便用于抗病毒、抗腫瘤的基因治療[19,20]。由于具有高效催化活性和對(duì)輔因子依賴性的特異性識(shí)別功能,脫氧核酶也可用于生物傳感器的構(gòu)建[21~23],但如何將脫氧核酶與目標(biāo)物的識(shí)別信息轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的物理信號(hào),一直是生物傳感研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

    脫氧核酶與納米材料的結(jié)合既保留了脫氧核酶的催化特性和識(shí)別能力, 又引入了納米材料的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,實(shí)現(xiàn)了識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的一體化,有利于設(shè)計(jì)出高靈敏度、高選擇性及高效的生物傳感體系,從而為分析化學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展提供了新動(dòng)力?;谏鲜鰞?yōu)點(diǎn),脫氧核酶已與石墨烯、納米金、量子點(diǎn)和磁性納米顆粒等納米材料廣泛結(jié)合,發(fā)展了一系列新型生物傳感器。本文將圍繞各種新型納米材料在脫氧核酶生物傳感器中的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)述。

    2 脫氧核酶-納米金復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

    納米金顆粒(Gold nanoparticles, AuNPs)又稱膠體金或金溶膠,具有大的比表面積、高催化活性以及尺寸依賴的光學(xué)性質(zhì)等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)[24]。納米金顆粒的制備技術(shù)與表面修飾技術(shù)的發(fā)展提高了它的穩(wěn)定性、水溶性和生物相容性,拓寬了其在生物分子標(biāo)記和檢測(cè)、納米生物傳感器以及納米生物芯片等方面的應(yīng)用[25~27]。

    2.1 基于脫氧核酶-納米金顆粒的比色型傳感器的研究

    納米金顆粒是在比色傳感器中常用的一種信號(hào)探針,其表面等離子體效應(yīng)與自身粒徑的大小以及顆粒之間的距離有關(guān)。當(dāng)納米金顆粒由分散狀態(tài)變?yōu)閳F(tuán)聚狀態(tài)時(shí),其顏色會(huì)由紅色變?yōu)樗{(lán)色或紫色。基于上述原理, 科研工作者發(fā)展了一系列比色型的脫氧核酶?jìng)鞲衅鱗28~33]。

    Lu研究組[29]首次將DNAzyme通過SAu鍵共價(jià)修飾于納米金表面構(gòu)建了一種可用于檢測(cè)Pb2+的比色傳感器。如圖1A所示,底物鏈的兩端延長(zhǎng), 便于與金納米顆粒表面修飾的DNA以頭對(duì)尾的方式雜交。當(dāng)不存在Pb2+時(shí),底物鏈與酶鏈以及納米金表面修飾的DNA之間形成穩(wěn)定雜交,納米金顆粒團(tuán)聚,溶液顯示藍(lán)色。當(dāng)加入Pb2+后,底物鏈被切斷, 抑制了納米金的團(tuán)聚,溶液顯紅色。該傳感器的檢出限為100 nmol/L,可用于油漆中Pb2+的檢測(cè)。然而該傳感器采用頭對(duì)尾的雜交方式會(huì)產(chǎn)生很大的空間位阻,因此需要復(fù)雜的加熱-冷卻過程。為了解決這個(gè)問題,該小組又采用了尾對(duì)尾的雜交方式, 降低了雜交產(chǎn)生的空間位阻, 并使反應(yīng)可以在室溫下進(jìn)行[30](圖1B)。此外,他們又引入了一段可與切割后的底物鏈片段雜交的DNA序列, 用于促進(jìn)納米金的釋放,使得傳感器的響應(yīng)時(shí)間只需5 min[30]。由于上述DNA酶?jìng)鞲衅鞫夹枰獙NAzyme共價(jià)修飾在納米金表面,過程復(fù)雜、成本較高, 且耗時(shí)長(zhǎng),因此該小組又基于DNA酶切割底物鏈可產(chǎn)生單鏈DNA,而單鏈DNA能保護(hù)納米金顆粒在較高鹽離子條件下不會(huì)團(tuán)聚,設(shè)計(jì)了一種非標(biāo)記的比色傳感器用于Pb2+和UO2+2的檢測(cè)[32](圖1C)。與此同時(shí),Wang研究組[33]也報(bào)道了類似的無標(biāo)記檢測(cè)Pb2+的比色型DNA酶?jìng)鞲衅?。除此之外,Lu研究組[34]還基于脫氧核酶的催化連接活性, 設(shè)計(jì)了一種比色型傳感器, 用于Cu2+的檢測(cè),該傳感器的背景干擾小,靈敏度高。上述結(jié)果表明,標(biāo)記型傳感器需要較長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行預(yù)處理和制備,但是當(dāng)制備好傳感器后更易endprint

    圖1 DNA酶比色傳感器設(shè)計(jì)原理圖(A) 納米金以“頭對(duì)尾”的方式連接[29];(B)納米金以“尾對(duì)尾”的方式連接[30];(C)非標(biāo)記策略用于引發(fā)納米金的團(tuán)聚[32]

    Fig.1 Schematic illustration of the DNAzyme based colormetric sensors. (A) Gold nanoparticles were aligned in a “head-to-tail” manner[29]; (B) Gold nanoparticles were aligned in a “tail-to-tail” manner[30]; (C) Label-free strategies of recognition-triggered aggregation state change of gold nanoparticles [32]于操作和檢測(cè);而非標(biāo)記型傳感器的靈敏度更高,且無需長(zhǎng)時(shí)間制備、更加經(jīng)濟(jì),然而在檢測(cè)過程中易受到離子強(qiáng)度及其它一些因素的影響。

    2.2 基于脫氧核酶-納米金顆粒的熒光傳感器的研究

    納米金顆粒除了可以作為信號(hào)報(bào)告基團(tuán)用于比色分析外,還可用于熒光檢測(cè)。人們利用納米金顆粒作為熒光猝滅劑, 發(fā)展了一系列DNA酶熒光傳感器[35~38]。Wang等[35]設(shè)計(jì)了一條底物鏈與酶鏈一體化的探針,并將該探針通過SAu鍵共

    圖2 A 基于納米金作熒光猝滅劑的DNAzyme熒光傳感器[36]; B 基于熒光偏振技術(shù)的DNA酶生物傳感器原理示意圖[38]

    Fig.2 (A) Schematic illustration of DNAzyme-based fluorescent biosensors using gold nanoparticles as fluorescence superquencher[36] and (B) Schematic illustration of DNAzyme-based fluorescence anisotropy assay[38]

    價(jià)修飾于納米金顆粒表面。由于標(biāo)記在底物鏈末端的熒光團(tuán)會(huì)靠近納米金,故熒光被猝滅。當(dāng)加入Pb2+后, 底物鏈被切斷,標(biāo)記有熒光團(tuán)的部分底物片段游離出來,熒光得以恢復(fù),從而實(shí)現(xiàn)了Pb2+的定量檢測(cè)(圖2A)。此外,Malashikhina等[36]發(fā)展了一種DNA酶與納米金結(jié)合的熒光生物傳感器, 用于抗壞血酸的檢測(cè)。Yin等[37]基于熒光偏振的方法設(shè)計(jì)了一種可以檢測(cè)金屬離子的DNA酶?jìng)鞲衅鳎▓D2B)。標(biāo)記有熒光團(tuán)的底物鏈與共價(jià)修飾在納米金上的酶鏈雜交,由于大分子在溶液中運(yùn)動(dòng)慢,故熒光各向異性值大。Pb2+存在時(shí), 底物鏈被切割,標(biāo)有熒光團(tuán)的部分底物片段與納米金分離,導(dǎo)致熒光各向異性值變小。然而, 上述傳感器都僅限于體外生物分子的檢測(cè),構(gòu)建可高靈敏和特異性檢測(cè)體內(nèi)生物分子的脫氧核酶生物傳感器已成為近年來研究的熱點(diǎn)。Lu課題組基于金納米顆粒高的熒光猝滅率構(gòu)建了一種可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)UO2+2的生物傳感器[38]。DNA酶鏈共價(jià)修飾于納米金表面,底物鏈兩端分別標(biāo)記有Cy3熒光團(tuán)和BHQ猝滅團(tuán)。當(dāng)酶鏈與底物鏈雜交后,由于雙重猝滅作用,Cy3的熒光被有效猝滅。當(dāng)加入U(xiǎn)O2+2后,UO2+2催化底物鏈的RNA水解,從而使標(biāo)記有熒光團(tuán)的部分底物片段游離出來,熒光得到恢復(fù)。該熒光納米探針經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后,可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)UO2+2的成像檢測(cè)。

    2.3 納米金顆粒作為信號(hào)放大基團(tuán)在生物分析中的應(yīng)用

    傳統(tǒng)的檢測(cè)方法中,探針的一端只能標(biāo)記一個(gè)生物分子,

    其靈敏度受到限制。而納米金具有比較大的比表面積,作為探針載體其表面可標(biāo)記多個(gè)生物分子,從而可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大[39~42]。

    圖3 基于樹枝狀納米結(jié)構(gòu)引發(fā)的放大傳感策略用于Pb2+檢測(cè)原理示意圖[40]

    Fig.3 Schematic of the amplified sensing strategy of DNA-Au dendrimer-based SERS biosensor for Pb2+ detection[40]

    本研究組發(fā)展了一種基于樹枝狀納米結(jié)構(gòu)信號(hào)放大技術(shù)的新型SERS傳感器[39](圖3)。其底物鏈和酶鏈通過10個(gè)聚

    T堿基連接在一起,且底物鏈的末端標(biāo)記有巰基,可通過SAu鍵組裝在金電極表面。當(dāng)加入Pb2+后,底物鏈中RNA堿基被水解,使其被切割為兩部分,與酶鏈連接的部分底物序列從金電極表面脫落下來,而金電極表面剩余的底物片段可與納米金標(biāo)記的報(bào)告探針雜交,然后通過層層自組裝形成樹枝狀納米結(jié)構(gòu),SERS信號(hào)得到顯著增強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)Pb2+的高靈敏檢測(cè)。而Shen等[40]構(gòu)建了一種以DNA功能化納米金作為信號(hào)放大基團(tuán)的DNA酶電化學(xué)傳感器。標(biāo)記有巰基的DNA酶鏈?zhǔn)紫缺唤M裝在金電極表面,而報(bào)告DNA 探針標(biāo)記在納米金顆粒表面,底物鏈則分別與酶鏈和報(bào)告DNA探針雜交形成三明治結(jié)構(gòu)。由于電活性物質(zhì)六氨合釕可以嵌入報(bào)告DNA 探針中從而獲得較大的電流信號(hào)。Pb2+的加入使得底物鏈被切斷,導(dǎo)致標(biāo)記有報(bào)告DNA 探針的納米金顆粒從電極表面脫離,導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)減小,由此可以放大檢測(cè)Pb2+,與不用納米金放大基團(tuán)相比,其靈敏度提高了5倍。

    3 脫氧核酶-石墨烯復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

    石墨烯(Graphene)是一種由碳原子通過sp2雜化構(gòu)成的單層蜂窩狀的平面薄膜,它可以折疊成零維的富勒烯,卷曲成一維的碳納米管或堆垛形成三維的石墨,因此石墨烯是構(gòu)成其它碳質(zhì)材料的基本結(jié)構(gòu)單元[43]。石墨烯具有比表面積大、機(jī)械強(qiáng)度高、導(dǎo)電性和導(dǎo)熱性好且表面修飾方便等優(yōu)點(diǎn), 因而受到了很多科研工作者的關(guān)注。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的衍生物,由于其表面含有很多羧基、羥基和環(huán)氧基等含氧活性基團(tuán),所以具有良好的水溶性和生物相容性。將石墨烯及其衍生物與脫氧核酶結(jié)合, 用于構(gòu)建高效的生物傳感器, 引起了科研人員的廣泛關(guān)注[44~49]。endprint

    Wen等[44]利用氧化石墨烯對(duì)單雙鏈DNA的吸附能力不同, 設(shè)計(jì)了一種DNA酶熒光探針, 用于Pb2+檢測(cè)(圖4A)。不存在Pb2+時(shí),由于雜交探針的剛性雙鏈結(jié)構(gòu)使其與氧化石墨烯之間的吸附力比較弱,所以底物鏈上標(biāo)記的熒光團(tuán)的熒光不能被猝滅; 加入Pb2+后,底物鏈中RNA堿基被水解,使其被切割為兩部分,此時(shí)標(biāo)記有染料的部分底物片段與酶鏈解鏈并游離出來。由于游離的底物片段與氧化石墨烯之間吸附能力強(qiáng),因此染料的熒光被猝滅,從而實(shí)現(xiàn)了Pb2+的定量檢測(cè)。由于上述傳感器是猝滅型的DNA酶?jìng)鞲衅?,其檢測(cè)的靈敏度受到限制。為了提高傳感器的靈敏度,本研究組[45]基于氧化石墨烯對(duì)不同長(zhǎng)度的單鏈DNA具有不同的吸附能力, 設(shè)計(jì)了一種熒光增強(qiáng)型的DNA酶生物傳感器, 用于Pb2+的高靈敏檢測(cè)(圖4B)。由于底物鏈和酶鏈的雜交探針中含有一段單鏈DNA序列,故該探針可以吸附在GO上,并使底物鏈5′端標(biāo)記的熒光團(tuán)靠近GO,導(dǎo)致熒光被猝滅。Pb2+的加入使DNA酶的催化活性被激活,底物鏈被切割為兩段。標(biāo)記有熒光團(tuán)部分底物片段(5個(gè)堿基)與酶鏈解鏈。釋放出的酶鏈可繼續(xù)與未反應(yīng)的底物鏈雜交,同時(shí)誘發(fā)下一輪反應(yīng)。如此循環(huán), 傳感體系中就含有很多標(biāo)記有熒光團(tuán)的短鏈DNA。加入GO后,由于短鏈DNA與GO的結(jié)合力弱,故熒光團(tuán)遠(yuǎn)離GO,其熒光不被猝滅。該傳感器的靈敏度高,其檢出限為300 pmol/L。此外,Yu等[46]基于氧化石墨烯可以增強(qiáng)熒光各向異性的策略發(fā)展了一種DNA酶?jìng)鞲衅?。上述傳感器雖然靈敏度比較高,但是底物鏈都需要標(biāo)記熒光團(tuán),故合成復(fù)雜且成本較高?;诖?,Liu等[47]將核酸嵌入劑GelRed和氧化石墨烯結(jié)合構(gòu)建了一種非標(biāo)記的DNA酶熒光傳感器, 用于Cu2+的檢測(cè)。除了基于DNAzyme的催化作用檢測(cè)其輔助因子外,DNAzyme

    Fig.4 (A) schematic illustration of graphene-DNAzyme-based fluorescent turn-off biosensors[44] and (B) schematic illustration of graphene-DNAzyme based fluorescent turn-on biosensors[45] 在基因治療中也顯示出巨大的潛力。Kim等[48]利用氧化石墨烯作為載體將標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM的DNA酶非共價(jià)吸附在石墨烯上, 并用于細(xì)胞內(nèi)丙型肝炎病毒(HCV)基因的檢測(cè)與沉默。

    石墨烯除了可與RNA切割型脫氧核酶結(jié)合設(shè)計(jì)生物傳感器外,也可與G四聚體脫氧核酶結(jié)合設(shè)計(jì)一些生物傳感器[49~51],從而進(jìn)一步拓寬可檢測(cè)靶分子的類型,豐富傳感器的設(shè)計(jì)模式。Luo等[50]將可識(shí)別目標(biāo)序列的探針DNA與G-四聚體序列整合到一條鏈上,沒有目標(biāo)物存在時(shí),探針DNA通過π-π鍵的相互作用吸附在GO上,從而使G四聚體-魯米諾復(fù)合體靠近GO,導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光信號(hào)很弱; 加入目標(biāo)DNA后,目標(biāo)DNA與探針DNA雜交形成雙鏈剛性結(jié)構(gòu),從而遠(yuǎn)離GO, G四聚體-魯米諾復(fù)合體的化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng),由此可以定量檢測(cè)目標(biāo)DNA。為了進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度,Yuan等[51]將功能化的石墨烯作為G四聚體-Hemin復(fù)合體的納米載體, 設(shè)計(jì)了一個(gè)可以放大檢測(cè)凝血酶的電化學(xué)傳感器。

    4 脫氧核酶-量子點(diǎn)復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

    量子點(diǎn)(Quantum dots, QDs) 又稱為半導(dǎo)體納米晶,通常是由Ⅱ~Ⅵ或Ⅲ~Ⅴ族元素組成的新型半導(dǎo)體納米材料, 直徑在2~10 nm,由于電子和空穴被量子限域,其連續(xù)能帶結(jié)構(gòu)變成分立能級(jí)結(jié)構(gòu),故受激發(fā)后可以產(chǎn)生熒光。與傳統(tǒng)有機(jī)染料相比,量子點(diǎn)具有激發(fā)譜帶寬、發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)、發(fā)光壽命長(zhǎng)、熒光量子產(chǎn)率高及光化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)良的光學(xué)特性[53~56],并成為化學(xué)與生物傳感領(lǐng)域中很有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N熒光納米材料。目前,研究人員將脫氧核酶與量子點(diǎn)結(jié)合并在生物分析領(lǐng)域做了一系列工作[57~59]。Wu等[57]利用發(fā)光為530 nm和625 nm兩種量子點(diǎn)構(gòu)建了可同時(shí)檢測(cè)Pb2+與Cu2+的DNA酶熒光傳感器(圖5A)。具體檢測(cè)原理是標(biāo)記有猝滅團(tuán)的底物鏈共價(jià)修飾到量子點(diǎn)表面,而同樣標(biāo)記有猝滅團(tuán)的DNA酶則與底物鏈雜交,由于量子點(diǎn)與猝滅團(tuán)靠近, 發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移, 導(dǎo)致量子點(diǎn)的熒光被猝滅。當(dāng)加入目標(biāo)物后,DNA酶的催化活性被激活, 并將底物鏈上RNA堿基水解,使其被切割為兩部分,故猝滅團(tuán)遠(yuǎn)離量子點(diǎn),量子點(diǎn)的熒光恢復(fù),實(shí)現(xiàn)了Pb2+與Cu2+的同時(shí)檢測(cè)。與傳統(tǒng)的熒光染料相比,靈敏度分別提高了50倍和70倍。Sharon等[58]則基于G-四聚體脫氧核酶與血紅素結(jié)合后可以通過電荷轉(zhuǎn)移猝滅CdSe/ZnS量子點(diǎn)熒光, 設(shè)計(jì)了一種可以檢測(cè)DNA和腺苷的熒光傳感器(圖5B)。

    圖5 基于脫氧核酶與量子點(diǎn)結(jié)合的生物傳感器檢測(cè)原理圖[57,58,60]

    Fig.5 Schematic illustration of DNAzyme-quantum dots-based biosensors[57,58,60]

    除了可以利用量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)設(shè)計(jì)生物傳感器外, 也可以利用其電化學(xué)性質(zhì)檢測(cè)多種目標(biāo)物[60~62]。 Zhang等[60]利用標(biāo)記有鏈霉親和素的PbS量子點(diǎn)與DNA酶結(jié)合, 構(gòu)建了一種高靈敏的電化學(xué)生物傳感器(圖5C)。Pb2+的存在激活了DNA酶的活性,故底物鏈被切割為兩段并游離出來。游離出來的標(biāo)記有生物素的底物鏈片段可與組裝在金電極表面的捕獲探針雜交,然后標(biāo)記有鏈霉親和素的PbS量子點(diǎn)通過親和素與生物素的特異性識(shí)別作用被固定在電極表面,最后通過電化學(xué)溶出法就可以測(cè)定Pb2+含量,其檢出限為0.6 nmol/L。Tang等[61]將量子點(diǎn)作為標(biāo)記物并利用滾環(huán)擴(kuò)增原理設(shè)計(jì)了一種可高靈敏檢測(cè)Pb2+的電化學(xué)型DNA酶?jìng)鞲衅?。此外,量子點(diǎn)還可以與脫氧核酶結(jié)合作為一個(gè)信號(hào)放大基團(tuán)用于其它物質(zhì)的檢測(cè)。如Zhang等[62]將PbS量子點(diǎn)標(biāo)記在二抗上,有目標(biāo)物AFP存在時(shí),PbS量子點(diǎn)就可以通過夾心結(jié)構(gòu)固定在標(biāo)記有一抗的微孔板中。然后量子點(diǎn)中的Pb2+可以通過酸溶出法釋放出來,被釋放的Pb2+就可以激活組裝在電極表面的DNA酶的活性并使底物鏈被切割,導(dǎo)致標(biāo)記在酶鏈上的電化學(xué)活性物質(zhì)二茂鐵靠近電極并產(chǎn)生強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)了AFP的高靈敏檢測(cè)。endprint

    5 脫氧核酶-磁性納米顆粒復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

    磁性納米材料是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種新型納米材料,由于其具有優(yōu)異的磁學(xué)性能、良好的生物相容性以及簡(jiǎn)單的表面修飾等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、磁共振成像、細(xì)胞分離以及生物檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域[63~65]。磁性納米顆粒與脫氧核酶結(jié)合在生物傳感中也得到了廣泛應(yīng)用[66~71]。Nie等[66]基于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法構(gòu)建了一種DNA酶生物傳感器, 用于Pb2+的檢測(cè)(圖6A)。其中GR-5DNAzyme的一端標(biāo)記有熒光團(tuán),另一端則共價(jià)修飾于磁珠上,加入Pb2+后,兩端標(biāo)記有猝滅團(tuán)的底物鏈被切割并與酶鏈分離,致使傳感器的熒光恢復(fù),由此可以定量檢測(cè)Pb2+。

    使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法可以降低Pb2+檢測(cè)過程中光散射造成的干擾。Ge等[67]將捕獲探針共價(jià)修飾于磁珠上,Cu2+的存在使底物鏈被切割為兩段,其中的一段底物片段就可以作為催化劑引發(fā)兩條信號(hào)探針在磁珠上的自組裝,

    圖6 基于脫氧核酶與磁性納米顆粒結(jié)合的生物傳感器檢測(cè)原理圖[66,68]

    Fig.6 Schematic illustration of DNAzyme-magnetic bead based biosensors[66,68]

    最后通過SYBR Green Ⅰ嵌入核酸雙鏈實(shí)現(xiàn)Cu2+的無酶、無標(biāo)記熒光放大檢測(cè)。該傳感器設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、花費(fèi)低廉且靈敏度高,其檢出限是12.8 pmol/L。除了利用RNA切割型脫氧核酶設(shè)計(jì)生物傳感器外,也可基于G四聚體脫氧核酶的信號(hào)放大作用設(shè)計(jì)一些高靈敏度的傳感器。Du等[68]在磁性納米顆粒上共價(jià)修飾了可卡因核酸適配體的一個(gè)片段,當(dāng)有可卡因存在時(shí),與另外一條連接有G四聚體脫氧核酶的核酸適配體片段形成夾心復(fù)合物,然后通過磁性分離與脫氧核酶催化TMB顯色來比色檢測(cè)可卡因(圖6B)。Tang等[69]則依據(jù)上述夾心法原理并采用滾環(huán)放大策略擴(kuò)增G四聚體脫氧核酶片段最后實(shí)現(xiàn)PDGF的超靈敏檢測(cè)。磁性納米顆粒的磁性富集和分離功能可以有效的降低背景信號(hào),實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的高靈敏檢測(cè),此外還可以減少實(shí)際樣品中非目標(biāo)物的干擾。

    6 脫氧核酶-其它納米材料復(fù)合物在生物傳感中的應(yīng)用

    脫氧核酶除了與上述幾種納米材料結(jié)合外,其它納米材料如水凝膠、樹枝狀DNA納米材料等也可以用來

    圖7 基于脫氧核酶與水凝膠結(jié)合的生物傳感器檢測(cè)原理圖 [73]

    Fig.7 Schematic illustration of DNAzyme-hydrogel-based biosensors [73]

    與DNA酶結(jié)合發(fā)展各種生物傳感器[72~74]。例如Lin等[72]利用DNA酶為水凝膠的交聯(lián)劑構(gòu)建了可檢測(cè)金屬離子的傳感平臺(tái)(圖7)。當(dāng)存在Cu2+時(shí),水凝膠從凝膠狀態(tài)變?yōu)槿苣z狀態(tài),此時(shí)包裹在凝膠中的納米金被釋放出來,因此可以根據(jù)納米金的釋放量來比色檢測(cè)Cu2+。本研究組[73]將DNA酶通過堿基互補(bǔ)組裝在DNA樹枝狀納米材料中,并構(gòu)建了生物相容性好、膜穿透能力強(qiáng)、高靈敏、高選擇性的熒光納米探針,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)組氨酸的成像檢測(cè)。

    7 總結(jié)與展望

    生命科學(xué)與納米材料是21世紀(jì)最前沿的兩大學(xué)科,納米材料的介入為生物傳感器的發(fā)展提供了無窮的空間。目前基于脫氧核酶和納米材料結(jié)合的生物傳感器已經(jīng)得到快速的發(fā)展,并深入到多個(gè)分析領(lǐng)域,展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。但是要進(jìn)一步將其用于臨床和實(shí)際檢測(cè),還有許多方面有待優(yōu)化。

    首先,當(dāng)前大部分文獻(xiàn)報(bào)道的傳感器都僅限于在緩沖溶液中檢測(cè),沒有真正應(yīng)用到實(shí)際樣品及生物體內(nèi)。事實(shí)上,在實(shí)際環(huán)境檢測(cè)和醫(yī)療診斷中其樣品成分非常復(fù)雜,故DNA酶?jìng)鞲衅髟趯?shí)際應(yīng)用中其性能容易受生物介質(zhì)的干擾。因此,可以考慮將DNA酶組裝在介孔納米材料的內(nèi)部,從而進(jìn)一步減少生物樣品分析中核酸酶等非目標(biāo)組分的干擾。其次,將DNA酶?jìng)鞲衅饔糜隗w內(nèi)生物分子檢測(cè)時(shí),納米材料的生物安全性是需要考慮的問題。因此需要研發(fā)新型安全無毒的納米材料作為DNA酶的運(yùn)載體。DNA作為一種天然生物分子,具有良好的生物相容性,將DNA納米材料如四面體DNA和DNA納米花等作納米載體用于構(gòu)建DNA酶?jìng)鞲衅骺梢越档洼d體對(duì)細(xì)胞或組織的毒性,從而推進(jìn)傳感器真正應(yīng)用于臨床檢測(cè)。最后,目前用于傳感器設(shè)計(jì)的DNA酶主要是RNA切割型脫氧核酶與G四聚體脫氧核酶,其檢測(cè)目標(biāo)范圍有限。如果研究和篩選針對(duì)更多特定靶分子的脫氧核酶并將其用于傳感器的構(gòu)建,可以大大拓展脫氧核酶?jìng)鞲衅鞯倪m用范圍。隨著研究的不斷深入,脫氧核酶與納米材料結(jié)合的生物傳感器將被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境檢測(cè)與食品安全等與生活息息相關(guān)的領(lǐng)域。

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