中央內(nèi)側(cè)丘腦核中NMDA受體參與丙泊酚致意識(shí)消失的作用

張益，羅竺欣，王袁，段自坤，李佳

中央內(nèi)側(cè)丘腦核中NMDA受體參與丙泊酚致意識(shí)消失的作用

張益1，2，羅竺欣2，王袁2，段自坤2，李佳2

目的探討中央內(nèi)側(cè)丘腦核（CMT）中N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸（NMDA）受體在全身麻醉意識(shí)消失中的作用。方法60只大鼠微注射模型隨機(jī)均分為4組：NMDA10 mmol/L組、NMDA20 mmol/L組、NMDA40 mmol/L組及對(duì)照組（C組），丙泊酚麻醉后分別于前3組CMT內(nèi)微量泵注10、20和40 mmol/L的NMDA以及等體積生理鹽水（C組）。觀察微注射后自主體動(dòng)反應(yīng)的發(fā)生率以及翻正反射恢復(fù)時(shí)間，并通過(guò)組織學(xué)對(duì)微注射位點(diǎn)進(jìn)行定位。結(jié)果當(dāng)注射位點(diǎn)在CMT中時(shí)，與C組相比，各濃度NMDA組大鼠麻醉后翻正反射恢復(fù)時(shí)間均明顯縮短；其中NMDA20 mmol/L與40 mmol/L組恢復(fù)時(shí)間短于NMDA10 mmol/L組，且NMDA20 mmol/L與40 mmol/L組大鼠麻醉中自主體動(dòng)的發(fā)生率顯著高于C組（均P＜0.05）。當(dāng)注射部位在CMT外時(shí)，各濃度NMDA組翻正反射恢復(fù)時(shí)間均明顯長(zhǎng)于注射部位在CMT內(nèi)者（P＜0.05），而各組間比較自主體動(dòng)發(fā)生率與翻正反射恢復(fù)時(shí)間均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論CMT中的NMDA受體參與了丙泊酚所導(dǎo)致的全身麻醉效應(yīng)。

麻醉藥，全身；丘腦中央核；受體；N-甲基-D-天冬氨酸；二異丙酚；中央內(nèi)側(cè)丘腦；NMDA受體；意識(shí)消失；腦區(qū)微注射

丘腦皮質(zhì)環(huán)路在睡眠與覺(jué)醒過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其中的中線核群、板內(nèi)核群等均屬于非特異性的覺(jué)醒系統(tǒng)［1］。板內(nèi)核群中的中央內(nèi)側(cè)丘腦核（central medial thalamus，CMT）含有多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，接受來(lái)自皮質(zhì)下的多條投射，并發(fā)出纖維投射至廣泛的皮質(zhì)和皮質(zhì)下腦區(qū)，是全身麻醉藥作用的關(guān)鍵區(qū)域之一［2］。然而，對(duì)于CMT中哪種受體在全身麻醉導(dǎo)致意識(shí)消失的過(guò)程中發(fā)揮主要作用，目前尚無(wú)定論。谷氨酸（glutamate，Glu）是中央神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，Glu受體是其作用靶點(diǎn)。在眾多Glu受體中，以N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸（N-methyl-D-aspartale，NMDA）受體與全身麻醉的關(guān)系最為緊密［3］。腦內(nèi)NMDA受體分布廣泛，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及功能維持中均發(fā)揮著關(guān)鍵的作用［4］。CMT中也含有大量NMDA受體，但其是否參與了全麻藥致意識(shí)消失的作用，目前鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究于CMT內(nèi)注射特異性NMDA受體激動(dòng)劑，觀察其對(duì)丙泊酚全身麻醉作用的影響，探討CMT中NMDA受體在全麻藥導(dǎo)致意識(shí)消失中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，250～350 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）2007-0005。常規(guī)飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，12 h白天/夜晚輪換人工光照，自由飲水、進(jìn)食。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（C組）、NMDA10 mmol/L組、NMDA20 mmol/L組和NMDA40 mmol/L組，每組15只。

1.2主要試劑丙泊酚（阿斯利康公司，1%，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030427）；NMDA（SIGMA公司，美國(guó)）。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型建立參考文獻(xiàn)［5］中的方法建立標(biāo)準(zhǔn)CMT微注射模型，戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上（Stoelting公司，美國(guó)），1%利多卡因皮下注射后切開(kāi)頭皮，分離組織暴露顱骨，按腦立體定位圖譜確定CMT的位置，坐標(biāo)為：前囟后3.1 mm，中線旁開(kāi)1.7 mm并傾斜13°，深度4.5 mm。用顱骨鉆鉆開(kāi)頭骨，按坐標(biāo)放置微注射套管至距中央丘腦0.2 mm處，并用牙科水泥固定。術(shù)后恢復(fù)1周開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.3.2腦區(qū)微注射各組大鼠均放入透明實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，以2%異氟醚麻醉，翻正反射消失后用24號(hào)靜脈留置針置入大鼠尾靜脈，取出大鼠頭部套管管芯，將一根比套管長(zhǎng)0.2 mm的注射針插入套管，另一端以延長(zhǎng)管連接微量注射泵（RWD202，深圳瑞沃德公司）。然后停止異氟醚麻醉，吸入空氣。待大鼠自主活動(dòng)恢復(fù)后20 min，于尾靜脈單次注射10 mg/kg丙泊酚，待翻正反射消失后1 min開(kāi)始腦區(qū)微注射。NMDA10 mmol/L組、NMDA20 mmol/L組和NMDA40 mmol/L組分別泵入0.5 μL濃度為10、20、40 mmol/L的NMDA，C組泵入相同體積的生理鹽水，泵注時(shí)間1 min。記錄腦區(qū)微注射后短時(shí)間內(nèi)自主體動(dòng)的發(fā)生率和翻正反射完全恢復(fù)的時(shí)間。

1.3.3組織染色定位實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，通過(guò)微注射導(dǎo)管，將0.1 μL 2%滂胺天藍(lán)溶液以0.2 μL/min速率緩慢注入CMT中，留針2 min，使溶液完全被吸收。用剪刀剪開(kāi)大鼠胸腔，充分暴露心臟，將灌流針從心尖插入主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，快速注入200 mL生理鹽水，再緩慢注入4%多聚甲醛300 mL，持續(xù)2～3 h。隨后斷頭，迅速取出腦組織，將標(biāo)本放入10%福爾馬林溶液中固定48 h后，浸泡于4℃20%蔗糖溶液中脫水直至沉底。截取含微注射進(jìn)針處的腦組織，行冠狀冰凍切片，厚25 μm，收集注射部位附近的切片進(jìn)行中性紅染色、制片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，相同濃度組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較行Fisher確切概率法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1組織學(xué)定位結(jié)果C組、NMDA10 mmol/L組、NMDA20 mmol/L組、NMDA40 mmol/L組微注射部位在CMT范圍內(nèi)的例數(shù)分別為：10（66.7%）、7（46.7%）、11（73.3%）和9（60.0%）例。15例發(fā)生自主體動(dòng)，其中14例的微注射點(diǎn)位于CMT內(nèi)，1例位于CMT外，見(jiàn)圖1。

Fig.1Histological localizations of NMDA microinfusion tips圖1 NMDA注射位點(diǎn)的組織學(xué)定位結(jié)果

2.2腦區(qū)微注射后自主體動(dòng)反應(yīng)的發(fā)生率與C組相比，CMT內(nèi)微注射20、40 mmol/L NMDA可導(dǎo)致大鼠發(fā)生明顯的自主體動(dòng)反應(yīng)（P＜0.05）；當(dāng)藥物注射于CMT外時(shí)，各濃度NMDA組的自主體動(dòng)發(fā)生率與C組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相同濃度組內(nèi)微注射部位在CMT范圍內(nèi)和CMT范圍外的自主體動(dòng)發(fā)生率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2.3大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間比較與C組相比，在CMT內(nèi)注射NMDA后大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間明顯縮短（P＜0.05），NMDA 20 mmol/L組與NMDA 40 mmol/L組的翻正反射恢復(fù)時(shí)間少于NMDA 10 mmol/L組，但NMDA 20 mmol/L組與NMDA 40 mmol/L組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)NMDA注射在CMT外時(shí)，各組間的翻正反射恢復(fù)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相同濃度組內(nèi)比較：除C組外，各濃度NMDA組注射于CMT內(nèi)的翻正反射恢復(fù)時(shí)間均短于注射于CMT外者（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1The response time and recovery time after microinfusion in six groups表1 各組微注射后反應(yīng)及翻正反射恢復(fù)時(shí)間

3 討論

CMT屬于丘腦非特異性投射系統(tǒng)，是中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的延伸，在維持覺(jué)醒和全身麻醉的過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用［3，6］。研究顯示，CMT中的N型乙酰膽堿受體［7］和Kv1家族鉀通道［5］不同程度地參與了全身麻醉導(dǎo)致意識(shí)消失的過(guò)程。而關(guān)于CMT中NMDA受體與全身麻醉的關(guān)系，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。從中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)至CMT的投射主要為谷氨酸能系統(tǒng)，丙泊酚可對(duì)NMDA受體激活后的電流產(chǎn)生可逆性的抑制，而對(duì)NMDA受體親和力無(wú)明顯影響［8］；因此，在CMT中注射NMDA可在局部激活NMDA受體，逆轉(zhuǎn)丙泊酚的抑制作用，從而維持覺(jué)醒系統(tǒng)的部分功能，而正是這部分功能在本實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)致大鼠從全身麻醉中產(chǎn)生行為覺(jué)醒和自主運(yùn)動(dòng)。這一結(jié)果說(shuō)明CMT中的NMDA受體至少參與了丙泊酚麻醉所導(dǎo)致的鎮(zhèn)靜和制動(dòng)兩個(gè)方面的麻醉效果。本研究結(jié)果還提示，20 mmol/L和40 mmol/L的NMDA對(duì)丙泊酚麻醉的催醒作用顯著強(qiáng)于10 mmol/L的NMDA，說(shuō)明其逆轉(zhuǎn)效應(yīng)具有一定的濃度依賴性。然而，NMDA 20 mmol/L和40 mmol/L兩個(gè)濃度所產(chǎn)生的效應(yīng)卻沒(méi)有明顯差別，這主要是由于在20～40 mmol/L的濃度區(qū)間微注射范圍內(nèi)CMT的NMDA受體已經(jīng)飽和，增加NMDA的量不會(huì)再引起效應(yīng)的增強(qiáng)。

另一方面，NMDA的注射部位與其作用之間存在著密切的關(guān)系。本研究中15例發(fā)生自主體動(dòng)大鼠的微注射位點(diǎn)有14例位于CMT內(nèi)，而NMDA注射部位在CMT外時(shí)，大鼠發(fā)生自主體動(dòng)的例數(shù)減少（差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可能主要是由于樣本量少所致），同時(shí)對(duì)翻正反射恢復(fù)時(shí)間的縮短作用消失，進(jìn)一步說(shuō)明了CMT在全身麻醉作用中發(fā)揮效應(yīng)部位的特異性。

綜上所述，CMT中NMDA受體參與了丙泊酚所導(dǎo)致的全身麻醉效應(yīng)。

［1］Van der Werf YD，Witter MP，Groenewegen HJ.The intralaminar and midline nuclei of the thalamus.Anatomical and functional evi?dence for participation in processes of arousal and awareness［J］. Brain Res Brain Res Rev，2002，39（2-3）:107-140.

［2］Baker R，Gent TC，Yang Q，et al.Altered activity in the central me?dial thalamus precedes changes in the neocortex during transitions into both sleep and propofol anesthesia［J］.J Neurosci，2014，34（40）: 13326-13335.doi:10.1523/JNEUROSCI.1519-14.2014.

［3］Petrenko AB，Yamakura T，Sakimura K，et al.Defining the role of NMDA receptors in anesthesia:are we there yet［J］？Eur J Pharma?col，2014，723:29-37.doi:10.1016/j.ejphar.2013.11.039.

［4］Chen XJ，Li X.Anti?N?methyl?D?aspartate receptor encephalitis:a new autoimmune encephalitis［J］.Chin J Contemp Neurol Neurosurg，2013，13（1）:12-15.［陳向軍，李翔.抗N?甲基?D?天冬氨酸受體腦炎：一種新型自身免疫性腦炎［J］.中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2013，13（1）:12-15］.

［5］Lioudyno MI，Birch AM，Tanaka BS，et al.Shaker-related potassi?um channels in the central medial nucleus of the thalamus are im?portant molecular targets for arousal suppression by volatile general anesthetics［J］.J Neurosci，2013，33（41）:16310-16322.doi:10.1523/ JNEUROSCI.0344-13.2013.

［6］Saper CB，Scammell TE，Lu J.Hypothalamic regulation of sleep and circadian rhythms［J］.Nature，2005，437（7063）:1257-1263.

［7］Alkire MT，McReynolds JR，Hahn EL，et al.Thalamic microinjec?tion of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat［J］.Anesthesiology，2007，107（2）:264-272.

［8］Zhou C，Liu J，Chen XD.General anesthesia mediated by effects on ion channels［J］.World J Crit Care Med，2012，1（3）:80-93.doi: 10.5492/wjccm.v1.i3.80.

（2015-02-02收稿 2015-03-10修回）

（本文編輯 閆娟）

NMDA receptors in central medial thalamus participate in propofol-induced unconsciousness

ZHANG Yi1，2，LUO Zhuxin2，WANG Yuan2，DUAN Zikun2，LI Jia2
1 Department of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou 563000，China；2 Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection，Zunyi Medical University

ObjectiveTo investigate the role of NMDA receptors in central medial thalamus（CMT）in the unconscious?ness induced by general anesthesia.MethodsA total of 60 rat models for microinfusion were assigned into 4 groups（n=15 for each group）.After induction with propofol，10 mmol/L（NMDA10 group），20 mmol/L（NMDA 20 group）and 40 mmol/L（NMDA40 group）of NMDA and normal saline（group C）with equal volume were microinfused into CMT.The incidence of purposeful movement and recovery time of righting reflex were observed in each group respectively.Infusion sites were local?ized by histological method.ResultsWhen the microinfusion site localized within CMT，comparing with group C，the recov?ery time of righting reflex reduced notably in three NMDA groups（P＜0.05）.The recovery time was significantly shorter in NMDA20 group and NMDA40 group than that of NMDA10 group.The incidence of purposeful movement during propofol an?esthesia was higher in NMDA20 group and NMDA40 group than that of group C（P＜0.05）.When the microinfusion site lo?calized out of CMT，the recovery time of righting reflex was remarkably longer than that within CMT in three NMDA groups（P＜0.05），and there was no significant difference in the incidence of purposeful movement and recovery time between four group（P＞0.05）.ConclusionMicroinfusion of NMDA agonist into CMT reverses propofol anesthesia，indicating that NMDA receptor in CMT may contribute to the propofol-induced unconsciousness.

anesthetics，general；midline thalamic nuclei；receptors；N-methyl-D-aspartate；propofol；central thala?mus；NMDA receptor；loss of consciousness；intracranial microinjection

R614.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.010

貴州省教育廳項(xiàng)目（黔科合J字LKZ［2011］06號(hào)）

1貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科（郵編563000）；2遵義醫(yī)學(xué)院麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

張益（1983），男，主治醫(yī)師，博士在讀，主要從事全身麻醉機(jī)制研究