細(xì)葉百合鱗莖多酚類(lèi)物質(zhì)組成及其抗氧化活性

靳磊 劉師源 張萍

摘要：對(duì)野生細(xì)葉百合（Lilium pumilum DC.）鱗莖多酚類(lèi)物質(zhì)組成及其抗氧化能力進(jìn)行研究，為野生百合資源的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。以寧夏羅山野生細(xì)葉百合鱗莖為材料，比較經(jīng)D-101大孔樹(shù)脂純化處理前后細(xì)葉百合總多酚含量的變化，使用高效液相色譜法檢測(cè)分析細(xì)葉百合鱗莖內(nèi)多酚類(lèi)物質(zhì)的組成與含量，采用清除DPPH、超氧根離子和羥基自由基3種方法對(duì)百合多酚提取物的總抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，經(jīng)D-101大孔樹(shù)脂純化后其多酚含量有所降低，但回收率高達(dá)92.51%；經(jīng)高效液相檢測(cè)分析，11種單體酚化合物在細(xì)葉百合鱗莖中被檢出，其中楊梅酮和表兒茶素的含量相對(duì)較高，分別達(dá)到了4.48 mg/100 g和2.91 mg/100 g；細(xì)葉百合多酚提取物對(duì)DPPH、超氧根離子和羥自由基均具有良好的清除能力，可作為天然抗氧化劑被開(kāi)發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：細(xì)葉百合（Lilium pumilum DC.）；鱗莖；多酚；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.2+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）20-5103-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.045

Polyphenolic Composition and Antioxidant Activities in Bulbs of Lilium pumilum DC.

JIN Lei，LIU Shi-yuan，ZHANG Ping

（School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021，China）

Abstract： The composition of polyphenols in bulb of L. pumilum DC. were identified and characterized， and its antioxidant activities were studied， in order to obtain the scientific data for wild Lilium resources development and rational utilization. L. pumilum DC.， collected from Luoshan Mountain in Ningxia Autonomous region， was used as metarial， mainly compared to the contents of polyphenols in the bulb before and after purification by using D-101 macroporous resin. Meantime， the composition and content of monomeric phenolic compounds in bulb of L. pumilum DC were analysed by High Performance Liquid Chromatography （HPLC）， and its scavenging abilities to 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals （DPPH）， superoxide anion （O2-·）， and hydroxyl radical （·OH） were respectively determined. The results showed that the content of polyphenols in bulb of L. pumilum DC. was reduced after purification by using D-101 macroporous resin， but with a high recovery rate as 92.51%. HPLC analysis showed that 11 monomeric phenolic compounds were detected in the bulb， and the contents of myricetin and （-） epicatechin were relatively higher， which reached to 4.48 mg/100 g and 2.91 mg/100 g， respectively. The polyphenolic extract of the bulb had strong scavenging abilities to DPPH radical， superoxide anion， and hydroxyl radical， which were always stronger than those of rutin at the same degree of concentration. It is indicated that the bulb of L. pumilum DC.， which not only contained rich phenolic compounds， but also presented high antioxidant activities， may be used as a good natural antioxidant.

Key words： Lilium pumilum DC.； bulb； polyphenols； antioxidant activity

細(xì)葉百合（Lilium pumilum DC.）又名山丹，為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生球莖類(lèi)草本植物，分布于中國(guó)寧夏、內(nèi)蒙古、甘肅、陜西、山西、山東、河南、河北、東北、青海等省區(qū)，是百合廣布種之一[1]，多生長(zhǎng)在海拔400～2 600 m的林緣、草原或山坡草地。2010年《中國(guó)藥典》將細(xì)葉百合、百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）和卷丹（Lilium lancifolium Thunb.）一同收錄其中[2]。研究表明，百合中含有生物堿、多糖、甾體皂苷、磷脂、多酚等多種化學(xué)成分，具有抗癌、抗抑郁、抗炎、抗氧化等生物活性[3]。多酚類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)具有一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)，并連接若干羥基的化合物，是植物次生代謝產(chǎn)物中的重要成分，主要包括類(lèi)黃酮、黃烷醇、花青素和酚酸等，具有抗氧化、抗菌消炎、抗衰老等生物活性，對(duì)多種慢性疾病，如糖尿病、心血管疾病和癌癥等起到很好的預(yù)防和治療作用[4-6]。

目前研究表明，卷丹鱗莖中多酚類(lèi)物質(zhì)具有良好的清除自由基能力[7]；對(duì)不同生態(tài)型宜昌百合鱗莖中多酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)宜昌百合對(duì)多種自由基均具有清除作用，并具有良好的銅離子還原能力和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力[8]。然而，就細(xì)葉百合而言，其研究多集中在遺傳多樣性[9，10]、核型分析[11，12]、組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)[13，14]等方面，而對(duì)其多酚類(lèi)物質(zhì)組成和抗氧化活性方面的報(bào)道較少，阻礙了其作為保健食品的開(kāi)發(fā)利用。因此，本研究以寧夏羅山野生細(xì)葉百合為材料，研究其鱗莖中多酚類(lèi)物質(zhì)的組成和抗氧化特性，發(fā)掘野生細(xì)葉百合潛在的生物保健功能，為細(xì)葉百合資源在醫(yī)藥、食品及保健品行業(yè)的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生細(xì)葉百合于2014年采自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市紅寺堡區(qū)羅山地區(qū)（37°18′N(xiāo)，106°16′E，海拔2 504 m）。將百合鱗莖去泥洗凈，超低溫冷凍干燥后粉碎，過(guò)100目篩后待用。

福林-酚試劑由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；D-101大孔樹(shù)脂、色譜甲醇、無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸均購(gòu)自天津博迪化工有限公司，單體酚標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-4803型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；日本島津LC-2010型高效液相色譜儀，武漢頓杰測(cè)量?jī)x器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SENCO-R型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)葉百合多酚類(lèi)物質(zhì)的提取 稱取百合干粉10 g，放入裝有300 mL 70%乙醇的三角瓶中，混勻后于45 ℃下超聲波處理40 min，離心后取上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液，減壓濃縮定容至50 mL。從中移取5 mL，用提取溶劑定容至25 mL，用于純化前多酚含量的測(cè)定。

1.3.2 細(xì)葉百合多酚類(lèi)物質(zhì)的純化 D-101大孔樹(shù)脂使用前用無(wú)水乙醇浸泡24 h，蒸餾水沖洗至無(wú)味，濕法裝柱。將“1.3.1”中獲得的提取液上柱，流速4 BV/h，用蒸餾水淋洗至流出液不再渾濁，與濃硫酸-蒽酮無(wú)顯色反應(yīng)，再用70%乙醇溶液以4 BV/h的流速解吸，直至檢測(cè)不到有多酚類(lèi)物質(zhì)析出，并測(cè)定純化后多酚類(lèi)物質(zhì)的含量。將收集液減壓濃縮，冷凍干燥后制成粉末，備用。

1.3.3 多酚類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定 采用福林-肖卡法[15]測(cè)定，結(jié)果以每百克鱗莖中含有的沒(méi)食子酸質(zhì)量（mg）表示。

1.3.4 單體酚含量的測(cè)定 稱取“1.3.2”中百合多酚提取物0.10 g，用5 mL色譜甲醇溶解。取溶液1 mL，經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)完畢后與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)樣量為10 μL。色譜條件參照J(rèn)in等[16]的方法，結(jié)果以每百克細(xì)葉百合鱗莖中各單體酚質(zhì)量（mg）表示。

1.3.5 清除DPPH能力的測(cè)定 采用Wangensteen等[17]的方法。稱取純化后百合多酚粉末1.00 g，用無(wú)水乙醇分別配制成濃度為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL的溶液。分別吸取待測(cè)液0.5 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液（無(wú)水乙醇溶解）2.5 mL，加蒸餾水定容至10 mL，搖勻后室溫下靜置反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定其吸光度AT?？瞻讓?duì)照A0以0.5 mL無(wú)水乙醇代替待測(cè)液，結(jié)果以自由基清除率表示。

清除率=（1-AT/A0）×100%

1.3.6 清除超氧根離子能力的測(cè)定 采用Robak等[18]方法。稱取純化后百合多酚粉末1.00 g，用無(wú)水乙醇分別配制成濃度為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL的溶液。分別吸取待測(cè)液1.0 mL，依次加入150 μmol/L四唑氮藍(lán)1 mL、468 μmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸1 mL，最后加入60 μmol/L吩嗪硫酸甲脂溶液1 mL，于560 nm處測(cè)定其吸光度AT?？瞻讓?duì)照A0以無(wú)水乙醇代替待測(cè)液，結(jié)果以自由基清除率表示。

清除率=（1-AT/A0）×100%

1.3.7 清除羥基自由基能力的測(cè)定 參考Sroka等[19]的方法。依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵、9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L 雙氧水各1 mL。于37 ℃下反應(yīng)15 min， 4 000 r/min離心6 min，于510 nm下測(cè)定吸光度AT，空白對(duì)照A0以無(wú)水乙醇代替待測(cè)液，結(jié)果以自由基清除率表示。

清除率=（1-AT/A0）×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，圖形利用Excel軟件完成，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)SPSS 16.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物純化前后總多酚含量的比較

純化處理前，細(xì)葉百合總多酚含量為1 564.21 mg/100 g，經(jīng)D-101大孔樹(shù)脂純化后其含量降為1 446.99 mg/100 g（圖1）。大孔樹(shù)脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子之間的范德華引力，使有機(jī)物根據(jù)吸附力及其分子量大小，經(jīng)過(guò)特定溶劑洗脫而達(dá)到分離、純化的目的。本研究中百合鱗莖中多酚類(lèi)物質(zhì)的含量顯著降低，這可能是由于多酚類(lèi)物質(zhì)經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附后無(wú)法完全解析或者在蒸餾水淋洗時(shí)部分易溶于水的多酚類(lèi)物質(zhì)流失所造成的；雖然經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附后，分離純化的多酚類(lèi)物質(zhì)有所降低，但回收率達(dá)到了92.51%，這表明D-101大孔樹(shù)脂表現(xiàn)出較好的吸附性能與解析效果，運(yùn)用大孔樹(shù)脂純化和富集百合多酚類(lèi)化合物是可行的。

2.2 鱗莖中單體酚的含量

為進(jìn)一步探究細(xì)葉百合鱗莖中多酚類(lèi)物質(zhì)組分，本研究通過(guò)高效液相色譜法對(duì)百合鱗莖中11種單體酚的含量進(jìn)行了定性和定量分析（表1），其中包括3種酚酸類(lèi)物質(zhì)（沒(méi)食子酸、對(duì)香豆酸和綠原酸）；5種黃酮醇（蕓香糖苷、楊梅酮、蘆丁、槲皮素和山奈酚）；2種黃烷醇（兒茶素和表兒茶素）及1種查爾酮（根皮素）。測(cè)試的11種單體酚化合物在寧夏羅山野生細(xì)葉百合鱗莖中全部被檢測(cè)出（圖2），其中楊梅酮和表兒茶素的含量相對(duì)較高，分別達(dá)到了4.48 mg/100 g和2.91 mg/100 g。

采用HPLC法對(duì)植物酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定已成為一種可靠、高效的手段。然而由于樣品處理方法、儀器設(shè)備、色譜分析條件等方面的差異，其分離效果和保留時(shí)間也不盡相同，甚至?xí)?dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果有較大差異。Robbins等[20]通過(guò)對(duì)不同色譜柱的選擇，使16種酚類(lèi)物質(zhì)在70 min內(nèi)得到了很好的分離；Guillen等[21]也通過(guò)對(duì)洗脫程序和色譜柱的選擇優(yōu)化，在60 min內(nèi)將25種酚類(lèi)物質(zhì)較好的分離。本研究通過(guò)高效液相色譜法在選定的色譜條件下，測(cè)定的11種單體酚在60 min內(nèi)得到了較好的分離。研究結(jié)果表明，楊梅酮和表兒茶素在細(xì)葉百合鱗莖中相對(duì)含量較高，并且11種單體酚化合物均被檢出。Francis等[22]在麝香百合（L. longiflorum）中也發(fā)現(xiàn)了山奈酚和槲皮素等多酚類(lèi)物質(zhì)，但未對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

2.3 鱗莖中多酚類(lèi)物質(zhì)抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 多酚對(duì)DPPH的清除率 由圖3可知，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，細(xì)葉百合鱗莖多酚提取物和蘆丁對(duì)DPPH的清除率均隨溶液濃度升高而增強(qiáng)，且百合多酚提取物的清除率始終高于蘆丁。差異分析表明，DPPH的清除率與細(xì)葉百合多酚濃度之間存在顯著差異（P<0.05），這表明細(xì)葉百合多酚提取物清除DPPH的活性取決于多酚成分的含量。當(dāng)DPPH的清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)細(xì)葉百合鱗莖多酚和蘆丁的濃度即為IC50，經(jīng)計(jì)算細(xì)葉百合鱗莖多酚和蘆丁對(duì)DPPH的清除率的IC50分別為0.68 mg/mL和1.41 mg/mL。

2.3.2 鱗莖多酚對(duì)O2-·的清除率 細(xì)葉百合鱗莖多酚提取物及蘆丁對(duì)O2-·的清除率在整個(gè)測(cè)試濃度范圍內(nèi)隨溶液濃度的增加而升高，且鱗莖多酚提取物的清除率始終高于蘆丁，在達(dá)到最大測(cè)試濃度2.4 mg/mL時(shí)，細(xì)葉百合鱗莖多酚對(duì)O2-·的清除率高達(dá)86.74%（圖4）。差異分析表明，O2-·的清除率與細(xì)葉百合多酚濃度之間存在顯著差異（P<0.05），這表明細(xì)葉百合多酚提取物清除O2-·的活性取決于多酚成分的含量。植物體內(nèi)多酚類(lèi)化合物含量越高，其體外抗氧化活性越強(qiáng)[23]。經(jīng)計(jì)算細(xì)葉百合鱗莖多酚和蘆丁對(duì)的O2-·的清除率IC50分別為1.14 mg/mL和1.94 mg/mL。

2.3.3 鱗莖多酚對(duì)·OH的清除率 由圖5可知，濃度為0.8～2.4 mg/mL的細(xì)葉百合鱗莖多酚提取物對(duì)·OH的清除率隨其濃度的升高而增強(qiáng)，且整個(gè)測(cè)試濃度范圍內(nèi)細(xì)葉百合鱗莖多酚提取物的清除率顯著高于蘆?。≒<0.05），在達(dá)到最大測(cè)試濃度2.4 mg/mL時(shí)，細(xì)葉百合鱗莖多酚對(duì)·OH的清除率高達(dá)75.59%，表明細(xì)葉百合鱗莖多酚提取物具有良好的體外抗氧化活性。經(jīng)計(jì)算細(xì)葉百合鱗莖多酚和蘆丁對(duì)的·OH的清除率IC50分別為1.38 mg/mL和3.15 mg/mL。

本研究中選取了清除包括羥自由基、超氧根離子自由基和DPPH自由基在內(nèi)的3種自由基來(lái)評(píng)價(jià)野生細(xì)葉百合鱗莖多酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化特性。結(jié)果表明，野生細(xì)葉百合鱗莖多酚提取物對(duì)多種自由基均具有一定的清除能力，并且在整個(gè)測(cè)試濃度內(nèi)，野生細(xì)葉百合的抗氧化能力顯著強(qiáng)于常見(jiàn)抗氧化劑蘆丁。這些研究結(jié)果暗示野生細(xì)葉百合磷莖多酚在天然抗氧化劑和功能性食品開(kāi)發(fā)方面具有廣闊的前景。此外，與常見(jiàn)的蔬菜相比，野生細(xì)葉百合鱗莖多酚類(lèi)物質(zhì)清除自由基的能力強(qiáng)于常見(jiàn)的馬鈴薯和胡蘿卜等蔬菜[24]。本研究結(jié)果不僅可以促進(jìn)百合食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，并為野生細(xì)葉百合資源的有效利用奠定了基礎(chǔ)。

3 小結(jié)

野生細(xì)葉百合鱗莖多酚類(lèi)物質(zhì)經(jīng)D-101大孔樹(shù)脂純化后其含量有所降低，但回收率高達(dá)92.51%；經(jīng)HPLC檢測(cè)分析，11種單體酚化合物在細(xì)葉百合鱗莖中均被檢出，其中楊梅酮和表兒茶素的含量相對(duì)較高，分別達(dá)到了4.48 mg/100 g和2.91 mg/100 g；野生細(xì)葉百合鱗莖多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)多種自由基均具有一定的清除能力，且在整個(gè)測(cè)試濃度范圍內(nèi)，其抗氧化活性始終高于對(duì)應(yīng)濃度下蘆丁的抗氧化活性。研究表明，野生細(xì)葉百合鱗莖可作為天然抗氧化活性劑資源被開(kāi)發(fā)利用。

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