脾切除對重度熱傷誘導(dǎo)的大鼠腸黏膜屏障破壞的影響

柳向東 李 衛(wèi) 黎 明 陳振勇

(1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院燒傷整形外科 上海 200540;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外科 武漢 430030)

嚴(yán)重?zé)醾笪改c道屏障功能下降，其原因是多方面的［1－2］。它誘發(fā)全身嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)、白介素(interleukin，IL)、核因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等。這些炎性因子相互作用，形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及“瀑布樣”效應(yīng)，損害腸黏膜屏障［3］。阻斷炎性因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以恢復(fù)胃腸道屏障。

正常情況下，脾臟可通過其釋放的細(xì)胞因子直接或間接影響、調(diào)節(jié)腸道的免疫功能，影響腸黏膜屏障功能［4］。在應(yīng)激狀況下，如急性胰腺炎等，脾臟巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素作用下可產(chǎn)生大量的TNF-α、IL-6、IL-1等促炎細(xì)胞因子，參與機(jī)體的過度炎癥反應(yīng)［5］。研究發(fā)現(xiàn)［5］，切脾后血清TNF-α、IL-1 含量和細(xì)菌移位率顯著降低，減輕腸黏膜屏障損傷，提示脾切除在阻止急性胰腺炎病情的發(fā)展中具有一定作用。

我們前期的研究顯示［2］，脾切除在短期內(nèi)能降低大鼠腸黏膜通透性，對應(yīng)激所導(dǎo)致的腸黏膜屏障破壞具有保護(hù)作用。本研究探討在重度熱傷時(shí)脾臟的保護(hù)作用。推測脾切除后，由于其分泌的細(xì)胞因子減少，能減緩嚴(yán)重?zé)醾竽c屏障功能障礙。

材料和方法

動(dòng)物模型制備及分組 健康Wistar大鼠80只，雌雄不限，體質(zhì)量200～300 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按隨機(jī)數(shù)字表法分成對照組、熱傷組(B組)，熱傷+脾切除7天組(B+SP7組)和熱傷+脾切除14天組(B+SP14組)，每組20只。大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，10%水合氯醛(0．3 g/kg)腹腔注射麻醉，背部剃毛。對照組置剃毛區(qū)于25℃水浴18 s;實(shí)驗(yàn)組92℃水浴18 s，造成30%III度燙傷(病理證實(shí))［6］;熱傷 +脾切除組在制造熱傷模型同時(shí)左肋緣下切口(1．5 cm)行脾切除，雙層關(guān)閉切口，傷后立即以40 mL/kg等滲鹽水腹腔注射抗休克，清醒后均經(jīng)口給與廣譜抗生素治療。脾切除組大鼠分別于傷后7天及14天腔靜脈抽血后處死。

血清內(nèi)毒素水平測定 取上述血液標(biāo)本1 mL，2 000 r/min離心15 min，置于無熱原肝素抗凝試管中，通過鱟試驗(yàn)動(dòng)態(tài)濁度法(動(dòng)態(tài)測定試劑盒，上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所)測定血清內(nèi)毒素水平(所有器皿均去內(nèi)毒素處理)，按說明書并參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行操作。

血清炎癥因子的檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各血清標(biāo)本內(nèi)TNF-α和NF-κB含量，按照試劑盒 (北京晶美生物工程有限公司)說明書逐步操作。

腸黏膜形態(tài)學(xué)分析 無菌條件下距回盲部10 cm處環(huán)形切取回腸，一部分于40 g/L甲醛中固定，石蠟包埋切片，光鏡下觀察腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)。用高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(HPIAS 1000型，武漢千葉公司)，在計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)的高倍視野(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，用目鏡測微器測量絨毛高度及黏膜厚度。每個(gè)標(biāo)本觀察2張切片，每張切片測量3個(gè)絨毛，最后取平均值。

ZO-1和閉鎖蛋白Western blot檢測 備用的黏膜組織100 mg，加入1 mL裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7．5，1%Triton X-100，5 mmol/L EGTA，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF)和10 mL緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 7．5，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，0．1%SDS，1 mmol/L脫氧膽酸鈉，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF)，組織粉碎，勻漿，冰浴30 min;4℃ 2 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA法用紫外可見分光光度儀測定蛋白濃度，并用蒸餾水將各樣本統(tǒng)一稀釋為5 μg/μL，－70℃保存。各取樣本10 μL及5 μL的預(yù)染 Marker，加入上樣緩沖液;混合后100℃煮沸蛋白變性5 min，分別經(jīng)7．5%和12%SDS-PAGE凝膠電泳分離1 h或2 h。電轉(zhuǎn)30 min;取出硝酸纖維膜，轉(zhuǎn)移至染色液中染色1 min，標(biāo)記，用含5%脫脂奶粉的TBS-T(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7．2，150 mmol/L NaCl，0．1%Tween 20)洗膜數(shù)次。浸入封閉液中封閉1 h。分別加一抗ZO-1和Occludin抗體(均購自北京晶美生物工程有限公司)，均以1∶1 000稀釋;以βactin(武漢博士德產(chǎn)品)為內(nèi)參，1∶2 000稀釋，4℃孵育過夜。加入1∶2 000的二抗［四甲基異硫酸羅丹明(TRITC)-山羊抗兔IgG］室溫下孵育1 h。將膜放入顯色液中，震蕩孵育5～10 min，暗室下膠片顯影，掃描。Olympus BX41圖像采集系統(tǒng)收集圖片信息，Photoshop軟件定量測量平均吸光度(D)值，以樣本D值/同一樣本內(nèi)β-actin蛋白D值來代表樣本的相對表達(dá)量。

結(jié) 果

脾切除前后熱傷大鼠血清內(nèi)毒素的變化 實(shí)驗(yàn)過程中熱傷組死亡1只，熱傷+脾切除組各死亡2只。由于血清內(nèi)毒素能間接反映腸黏膜通透性，我們通過血清內(nèi)毒素進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)熱傷組較對照組上升301%，而B+SP7組僅上升226%(P＜0．01)，B+SP14組的上升幅度(264%)接近熱傷組(P＞0．05)。說明脾切除7天后降低了內(nèi)毒素水平，且B+SP14組的內(nèi)毒素高于B+SP7組(表1)。

表1 脾切除前后熱傷大鼠血清內(nèi)毒素的變化差值Tab 1 The change value of serum endotoxin levels in thermal trauma rats after splenectomy (±s)

表1 脾切除前后熱傷大鼠血清內(nèi)毒素的變化差值Tab 1 The change value of serum endotoxin levels in thermal trauma rats after splenectomy (±s)

(1)vs．Control group，P＜0．01;(2)vs．Burn group，P＜0．05．

Serum endotoxin(EU/mL) 0．267 ±0．06 1．071 ±0．29(1)0．872 ±0．18(1)(2)0．972 ±0．17(1)

血清NF-κB和TNF-α檢測結(jié)果 參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子較多，其中內(nèi)毒素可激活單核或巨噬細(xì)胞的NF-κB，啟動(dòng) TNF、IL-6等基因轉(zhuǎn)錄，參與對炎癥反應(yīng)和腸黏膜屏障的調(diào)控，我們選擇NF-κB和TNF-α作為脾臟參與應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)機(jī)制的研究對象。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接受熱傷刺激后大鼠血清NF-κB和TNF-α 均明顯升高(247%，607%，P＜0．01)，B+SP7組NF-κB和TNF-α的升高幅度(173%，370%)均低于B組 (P＜0．01)，而B+SP14組僅TNF-α上升幅度高于B+SP7組(P＜0．01，表2)。

表2 脾切除對熱傷大鼠血清TNF-α和NF-κB的影響Tab 2 The levels of NF-κB and TNF-α in thermal trauma rats after splenectomy (±s)

表2 脾切除對熱傷大鼠血清TNF-α和NF-κB的影響Tab 2 The levels of NF-κB and TNF-α in thermal trauma rats after splenectomy (±s)

(1)vs．Control group，P＜0．01;(2)vs．Burn group，P＜0．01;(3)vs．B+SP7 group，P＜0．05．

TNF-α(μg/mL) 14．0 ±3．03 99．1 ±18．1(1))65．8 ±19．2(1)(2))76．3 ±14．3(1)(2)(3

小腸黏膜形態(tài)學(xué)的改變 光鏡下觀察對照組黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，熱傷后各實(shí)驗(yàn)組小腸黏膜都有不同程度的萎縮，以B組更加明顯(圖1)。各組平均腸絨毛高度和黏膜厚度與對照組相比下降明顯(P＜0．01)，其中 B+SP7組和 B+SP14組下降幅度均較B組小(P＜0．01)，但B+SP7組與B+SP14組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。說明切脾對腸黏膜形態(tài)的破壞具有保護(hù)作用，但腸黏膜形態(tài)的破壞短期內(nèi)無法恢復(fù)(表3)。

圖1 小腸黏膜形態(tài)學(xué)改變(HE×20)Fig 1 Histologic sections of distal ileum mucosa(stained with HE×20)

表3 脾切除大鼠小腸黏膜形態(tài)學(xué)改變Tab 3 The changes of morphology of intestine inburned-rats after splenectomy (±s)

表3 脾切除大鼠小腸黏膜形態(tài)學(xué)改變Tab 3 The changes of morphology of intestine inburned-rats after splenectomy (±s)

(1)vs．Control group，P＜0．01;(2)vs．Burn group，P＜0．01．

ZO-1和閉鎖蛋白的Western blot檢測結(jié)果腸黏膜的通透性與腸上皮的緊密連接蛋白有關(guān)，我們通過對緊密連接蛋白的研究進(jìn)一步探討脾臟對腸黏膜屏障的影響機(jī)制。以β-actin為內(nèi)參，ZO-1蛋白條帶相對分子質(zhì)量(Mr)約為210×103，閉鎖蛋白條帶為80×103(圖2)。用圖像分析儀測量條帶的平均吸光度值(D)，定量結(jié)果分析表明，B組的ZO-1和閉鎖蛋白的D值較對照組分別下降53．3%、46．3%(P＜ 0．01)，B+SP7 組僅下降36．7%、30．2%，B+SP14組下降30%、36%，下降幅度均小于B組(P＜0．01)，其中B+SP7組的閉鎖蛋白下降值高于B+SP14組(表4)。

圖2 ZO-1和閉鎖蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig 2 The expression of intestinal ZO-1 and occludin after burn and splenectomy by Western blot

表4 各組ZO-1和閉鎖蛋白平均吸光度值比較Tab 4 The values of optical density of ZO-1 and occludin protein in different groups (±s)

表4 各組ZO-1和閉鎖蛋白平均吸光度值比較Tab 4 The values of optical density of ZO-1 and occludin protein in different groups (±s)

(1)vs．Control group，P＜0．01;(2)vs．Burn group，P＜0．01．

Values of optical density(D)Occludin 2．42 ±0．23 1．30 ±0．27(1)1．69 ±0．28(1)(2)2．06 ±0．30(1)(2)

討 論

嚴(yán)重?zé)醾麜?huì)導(dǎo)致急性胃腸黏膜缺血及內(nèi)臟血流減少，由此引起胃腸道功能障礙，表現(xiàn)為麻痹性腸梗阻、胃擴(kuò)張、胃分泌增多和潰瘍形成［5］，并進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙的發(fā)生。熱傷后腸道屏障功能受損的機(jī)制包括缺血缺氧性損害、缺血再灌注、內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)產(chǎn)生、營養(yǎng)代謝障礙等，其中炎性介質(zhì)具有重要作用。熱傷能激活巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌大量炎性介質(zhì)如 TNF-α、IL-6、血小板 活化因 子、NO 等［6］。這些炎性因子相互作用，形成網(wǎng)絡(luò)，造成“瀑布樣”效應(yīng)。

從我們的實(shí)驗(yàn)來看，重度熱傷后7天和14天，血清內(nèi)毒素水平明顯升高，而血清內(nèi)毒素反映腸黏膜通透性，因此傷后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸黏膜屏障受損，通透性增加。B+SP14組的內(nèi)毒素增加值小于B+SP7組，即B+SP14組的腸黏膜屏障受損較輕，也說明熱傷后腸黏膜的損傷隨時(shí)間的推移而恢復(fù)。同時(shí)血清NF-κB和TNF-α較對照組明顯上升。從形態(tài)上看，熱傷后腸絨毛高度和黏膜厚度也明顯下降，說明熱傷后血漿內(nèi)毒素、NF-κB、TNF-α和腸絨毛形態(tài)的變化具有一致性，也進(jìn)一步證實(shí)了重度熱傷引起的腸黏膜形態(tài)和功能的改變與炎癥介質(zhì)有關(guān)［6］。

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB通過誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(IL-6、TNF等)、黏附分子、趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)［5］，促進(jìn)TNF激活炎性細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬殺傷功能，誘導(dǎo)它們釋放炎性蛋白和炎性介質(zhì)如NO、氧自由基等，參與炎性反應(yīng)放大與延續(xù)。本研究表明TNF也介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的通透性增加。

既然熱傷引起的腸黏膜通透性的改變與炎性介質(zhì)有關(guān)，因此阻斷炎性介質(zhì)的釋放能改善受損的腸黏膜［8］。本實(shí)驗(yàn)中大鼠脾切除7天后，其內(nèi)毒素水平也較對照組升高，但升高幅度小于有脾動(dòng)物(即熱傷組);術(shù)后14天升高幅度進(jìn)一步減少。說明脾切除對腸黏膜屏障有保護(hù)作用。研究脾切除后細(xì)胞因子的變化，NF-κB、TNF-α 均較有脾動(dòng)物下降，說明脾臟對腸黏膜屏障的調(diào)整部分是通過細(xì)胞因子NF-κB、TNF-α 而實(shí)現(xiàn)的。

同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)B+SP14組TNF-α上升幅度高于B+SP7組，說明脾切除對TNF-α上升的抑制是短時(shí)間的，而NF-κB的變化兩組間沒有差異，可能的原因是血清TNF-α主要來源于脾臟，而NF-κB來源更廣泛［4］。脾切除對腸黏膜的保護(hù)僅僅是短期效應(yīng)，可能在于切脾后雖然近期內(nèi)炎性因子釋放減少，腸道屏障損傷和腸源性感染的發(fā)生率降低，但切脾后機(jī)體丟失大量的免疫細(xì)胞，阻礙了抗體和免疫調(diào)節(jié)因子的形成，使機(jī)體處于一種免疫功能低下的狀態(tài)，脾臟免疫因子對腸道免疫功能的調(diào)節(jié)、協(xié)同作用減弱，因此一段時(shí)間后脾切除的不良作用即呈現(xiàn)出來。

我們通過對腸上皮緊密連接蛋白的研究進(jìn)一步探討脾臟對腸黏膜屏障的影響機(jī)制。腸黏膜通透性的維持依賴腸上皮細(xì)胞間的緊密連接［6］。腸黏膜上皮緊密連接是由一系列的細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞骨架元素和幾種跨膜蛋白組成，包括 ZO-1、Occludin、Claudin家族等［9］。其中ZO-1與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白相連，使細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架與胞外連接蛋白實(shí)現(xiàn)信號(hào)溝通，腸上皮Occludin的檢測不僅可以反映腸道屏障的破壞情況，還可以反映外科創(chuàng)傷后腸道屏障的恢復(fù)程度。應(yīng)激狀況下，腸緊密連接蛋白的分布和數(shù)量均發(fā)生改變［10］。我們選擇其中關(guān)鍵的緊密連接蛋白ZO-1和Occludin作為研究對象。研究發(fā)現(xiàn)，重度熱傷后ZO-1和Occludin均明顯下降。而切脾動(dòng)物的下降值較少，其下降幅度與TNF-α的上升呈正相關(guān)，說明脾切除后，減少了炎性因子的釋放，減弱了炎性反應(yīng)，恢復(fù)了腸上皮緊密連接蛋白的分布和數(shù)量，對腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。

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