豬輪狀病毒VP7蛋白模擬表位的噬菌體展示技術(shù)篩選與鑒定

?

豬輪狀病毒VP7蛋白模擬表位的噬菌體展示技術(shù)篩選與鑒定

任曉峰，秦昭恒，曹麗艷，葛旭穎

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：豬輪狀病毒（PoRV）是引起仔豬腹瀉的重要病原之一，其主要結(jié)構(gòu)蛋白衣殼蛋白VP7可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體。文章以制備的抗PoRV VP7單克隆抗體（MAb）3B6作為靶分子，利用噬菌體十二肽庫展示技術(shù)對其模擬表位進行篩選。四輪篩選后隨機挑取陽性克隆擴增后進行ELISA鑒定，同時提取其基因組DNA測序，10個陽性噬菌體親和肽擁有共同的外源肽序列“VPLGTDNGDIWV”，而且與靶分子有很高親和力。陽性噬菌體親和肽與VP7蛋白進行序列比對，結(jié)果表明，十二肽中有4個氨基酸（第167位P、第178位T、第179位D和第184位W）與VP7蛋白167~184位氨基酸有一定的相似性。競爭抑制ELISA證明親和多肽降低PoRV與抗VP7單克隆抗體之間的作用，病毒競爭抑制試驗表明親和多肽可以競爭性地抑制PoRV感染細胞。因此由這4個氨基酸構(gòu)成的基序很有可能作為豬輪狀病毒VP7蛋白的一個模擬表位。

關(guān)鍵詞：豬輪狀病毒；VP7蛋白；噬菌體篩選；模擬表位

任曉峰,秦昭恒,曹麗艷,等.豬輪狀病毒VP7蛋白模擬表位的噬菌體展示技術(shù)篩選與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2015, 46(2): 11-17.

Ren Xiaofeng, Qin Zhaoheng, Cao Liyan, et al. Identification and characterization of porcine rotavirus VP7 protein mimotope by phage screening technique[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(2): 11-17. (in Chinese with English abstract)

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-1-27 15:59:35

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1559.002.html

1.2.2親和能力檢測與測序

第四輪的洗脫物進行滴度測定，在藍斑數(shù)小于100的板中，隨機挑取10個藍斑進行噬菌體擴增并測定滴度。用0.1 mol·L-1NaHCO3（pH 8.6）將純化后的單克隆抗體腹水稀釋至200 μg·mL-1，酶標板每孔加入100 μL，4℃包被過夜；棄去包被液，0.05% PBST洗板3次；分別加入10份待檢的噬菌體及原始文庫陰性對照，投入量均為1.5×1011PFU·孔-1，室溫緩慢震蕩1 h；TBST洗板3次，再加入1?1 000倍稀釋的抗M13噬菌體的商品化多抗，37℃慢搖1 h；TBST洗板3次，再加入1?5 000倍稀釋的HRP標記羊抗小鼠IgG二抗，37℃靜止避光孵育1 h；TBST洗板3次，OPD顯色，490 nm處讀取OD值。提取親和能力高的噬菌體DNA：向500 μL噬菌體上清中加入200 μL PEG8000/NaCl，混勻后4℃靜置10 min；4℃條件下13 000 r·min-1離心10 min，棄去上清后沉淀徹底重懸于100 μL碘化物緩沖液進行快速裂解，釋放出其基因組DNA；加入250 μL無水乙醇沉淀DNA，室溫靜置孵育10 min；4℃條件下13 000 r·min-1離心10 min，棄去上清；加入70%的乙醇洗滌沉淀，棄去后再加入30 μL TE溶液溶解沉淀；PCR擴增噬菌體靶向序列[8]。

PCR反應(yīng)參照NEB試劑盒說明書進行。取少量PCR產(chǎn)物進行鑒定，其余PCR產(chǎn)物待純化后進行測序，噬菌體測序引物序列P3 5' GTATGGGATT TTGCTAAACAAC 3'，P4 5' CCCTCATAGTTAGCG TAACG 3'。

PCR反應(yīng)體系10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 2.5 μL，上下游引物各1 μL，Ex-Taq酶0.2 μL，噬菌體DNA 5 μL，補水至25 μL。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，55℃3 s，72℃30 s進行30個循環(huán)，72℃延伸10 min[9-11]。

將靶向序列測序結(jié)果轉(zhuǎn)換成氨基酸格式，并與PoRV VP7蛋白氨基酸序列進行比對（http://www. ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）。

1.2.3“P-TD-W“氨基酸基序與VP7蛋白三維結(jié)構(gòu)的關(guān)系

為使噬菌體展示的多肽模擬表位更加形象化，從蛋白數(shù)據(jù)庫（Protein data bank，PDB）得到猿猴輪狀病毒A株（C3RX25）與PoRV（DN30209）VP7蛋白最相似，可作為一個模板，然后用Modeller程序（http://www.salilab.org/modeller/）分析蛋白分子模型[12-13]。與PoRV VP7蛋白同源性最高的氨基酸被標記出所在位置。

1.2.4多肽與MAb 3B6的結(jié)合ELISA試驗

合成多肽P-VP7（純度為30%）由ChinaPeptides（強耀生物科技有限公司，上海）合成，提前一天包被ELISA板，用包被液稀釋為10 μg·mL-1，每孔50 μL，過夜。然后用封阻液封閉，分別用MAb 3B6和無關(guān)的鼠源IgG室溫孵育1 h，HRP標記的山羊抗鼠的二抗（1?5 000稀釋），最后加入OPD顯色液，用于ELISA檢測，最后在OD490nm條件下讀值。同時設(shè)立無關(guān)多肽為陰性對照，每個設(shè)3個復(fù)孔，用于誤差計算。

1.2.5多肽的競爭性抑制ELISA試驗

合成的多肽（10 μg·mL-1）與MAb 3B6（3 μg·mL-1）室溫下孵育1.5 h。在已經(jīng)包被感染了PoRV的細胞ELISA板上加入多肽和抗體的混合物，37℃作用1 h，PBST洗3次，二抗為1?5 000稀釋的HRP標記羊抗小鼠IgG；最終進行OPD顯色，并讀取490 nm處OD值。無關(guān)多肽作為陰性對照，同時設(shè)立復(fù)孔。

1.2.6多肽與病毒的競爭抑制試驗

多肽與病毒的競爭抑制試驗通過病毒的蝕斑減少中和試驗檢測（PRNT），將MA104細胞傳到24孔板內(nèi)，細胞計數(shù)每孔細胞5×104個，待長滿單層后，把P-VP7多肽從對細胞的最大無毒濃度連續(xù)兩倍稀釋加入孔內(nèi)，無關(guān)多肽組（Irrelevant peptide）稀釋相同的倍數(shù)作為陰性對照，每稀釋度3復(fù)孔，每孔500 μL，37℃孵育45 min，用胰酶處理的PoRV（100 PFU）接種到24孔板中，37℃孵育1 h，然后換1%營養(yǎng)性甲基纖維素覆蓋，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出培養(yǎng)板，10%甲醛固定30 min，流水沖去孔中的甲基纖維素凝膠；0.5%結(jié)晶紫染色5 min，水洗；倒置顯微鏡下進行空斑計數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1噬菌體篩選與富集

以純化后的抗PoRV VP7蛋白單克隆抗體為靶分子進行四輪噬菌體篩選，將每一輪篩選過程中的包被量、噬菌體投入量、產(chǎn)出量進行統(tǒng)計，并比較每一輪的產(chǎn)出/投入比，結(jié)果見表1。在靶分子包被量遞減、投入量不變的情況下，每一輪的噬菌體洗脫量及洗脫量/投入量均呈遞增趨勢。因此經(jīng)過四輪篩選噬菌體得到明顯富集。

表1　純化的單克隆抗體3B6的噬菌體篩選Table 1　Biopanning to purified monoclonal antibody 3B6

2.2親和能力的鑒定與測序

對第四輪篩選的洗脫產(chǎn)物進行滴度測定，選取藍斑數(shù)小于100的平板，隨機挑取10個單克隆噬菌體藍斑進行擴增，并通過間接EILSA方法檢測與靶分子的親和能力。結(jié)果表明，與原始文庫對照相比，10個隨機噬菌體均與靶分子即純化的單克隆抗體3B6，具有較高的親和能力，如圖1所示。隨后，以10個隨機噬菌體的基因組DNA為模板進行PCR，均擴增出長度約為250 bp的特異性條帶（見圖2）。將PCR產(chǎn)物純化回收并進行核酸序列測定，并得出最終的12肽“VPLGTDNGDIWV”，命名為P-VP7。應(yīng)用在線序列比對軟件clustalw2，將篩選出的P-VP7的12肽序列與PoRV VP7蛋白進行氨基酸序列比對。結(jié)果如圖3所示，P-VP7 的12肽與VP7蛋白第167至184位氨基酸具有一定的相似性，其中有四個位點的氨基酸完全一致（第167位P、第178位T、第179位D和第184 位W）。

圖1　噬菌體親和力試驗ELISA結(jié)果Fig. 1　Binding analysis of phages displayed peptides to MAb 3B6 by ELISA

2.3“P-TD-W“氨基酸基序在VP7蛋白三維結(jié)構(gòu)的位置

由圖4可知，從PoRV VP7蛋白三維立體模型中可以看出167（P），178（T），179（D）或184（W）在VP7蛋白的位置。這些氨基酸殘基與MAb 3B6結(jié)合的位置用黑色箭頭標記突出顯示。蛋白分子模型模擬結(jié)果顯示，包含假定基序“P-TD-W”多肽可作為VP7蛋白第167~184個氨基酸位置的一個模擬表位。

圖2　10個隨機噬菌體的PCR擴增產(chǎn)物Fig. 2　PCR amplifying genes encoding heterologous peptides in the recombinant phages

圖3　P-VP7與PoRV VP7 VP7蛋白氨基酸序列比對Fig. 3　Alignment of deduced amino acids between P-VP7 and PoRV VP7

圖4　PoRV VP7 protein 3D結(jié)構(gòu)模型Fig. 4　The 3D model of PRV VP7 protein 3D

2.4多肽與MAb 3B6的結(jié)合試驗結(jié)果

包被合成多肽與MAb 3B6進行ELISA反應(yīng)，結(jié)果P-VP7與MAb 3B6發(fā)生特異性反應(yīng)，而對照孔包被的無關(guān)多肽與單抗不發(fā)生反應(yīng)（見圖5）。表明所合成的多肽能結(jié)合MAb 3B6，所篩的噬菌體是特異性針對MAb 3B6的陽性噬菌體克隆，而不是噬菌體本身蛋白發(fā)生的非特異性反應(yīng)。

2.5多肽的競爭抑制ELISA結(jié)果

用合成的多肽進一步做PoRV競爭抑制試驗，由圖6可見，多肽能夠抑制PoRV與單克隆抗體3B6的結(jié)合，抑制率達82%。證明噬菌體攜帶多肽形成的表位與單抗3B6識別的PoRVVP7的抗原表位相同或相似。

2.6多肽競爭抑制病毒的結(jié)果

由圖7可知，P-VP7肽在一定濃度能競爭抑制PoRV感染MA104細胞的作用，而且從總體趨勢上，P-VP7多肽濃度越高，對病毒競爭抑制作用越強，P-VP7多肽濃度為50、25和12.5 μg·mL-1時，在MA104細胞上的競爭抑制率為50%以上。

圖5　合成多肽與單克隆抗體3B6的結(jié)合ELISAFig. 5　Combination ELISA of 3B6 IgG on synthesized peptide P-VP7

圖6　P-VP7合成多肽抑制單克隆抗體3B6結(jié)合PoRV的ELISA試驗Fig. 6　Inhibition of MAb 3B6 binding to PoRV in the presence of P-VP7 peptide

圖7　多肽競爭抑制病毒試驗Fig. 7　Inhibition test of PoRV propagation by high affinity peptide

3　討論

豬輪狀病毒引起的仔豬腹瀉在英、美、澳大利亞等國家均有報道。作為腹瀉的主要病原之一的輪狀病毒給畜牧業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。我國豬輪狀病毒感染很普遍，幾乎所有豬場的母豬血清中均可檢測到輪狀病毒抗體。根據(jù)對我國部分豬場PoRV的流行病學(xué)調(diào)查表明，PoRV G5型是我國A群豬輪狀病毒主要流行的血清型之一，DN30209毒株屬于PoRV G5型[14]，VP7蛋白在相同血清型不同毒株之間高度保守[15]，因此本試驗選擇該毒株的VP7蛋白進行抗原模擬表位篩選。

利用噬菌體篩選方法及多肽結(jié)合和競爭試驗確定PoRV VP7蛋白上潛在的抗原表位：167P-TDW184，有助于深入了解的抗原或抗原-抗體相互作用的結(jié)構(gòu)和功能，其對疫苗和診斷試劑的研發(fā)具有重要意義?？乖员砦豢煞譃榫€性表位和構(gòu)象表位。線性表位是抗原上彼此相鄰的一級結(jié)構(gòu)的幾個氨基酸；構(gòu)象表位是抗原上不連續(xù)的一級結(jié)構(gòu)，或者是一些氨基酸殘基彼此靠近的空間結(jié)構(gòu)[16]。肽合成和蛋白質(zhì)降解方法可用于確定線性表位，但未能確定構(gòu)象表位。大多數(shù)抗原表位是構(gòu)象表位。在噬菌體展示文庫中，短肽隨機片段插入絲狀噬菌體蛋白PⅢ的N-末端，其已被成功地用于篩選由抗體或其他配體蛋白識別的抗原表位。采用這種技術(shù)，不僅可篩選線性表位，也可篩選潛在構(gòu)象表位[17]。

在多肽與病毒競爭抑制試驗中，多肽能抑制PoRV感染細胞，推測可能由于多肽具有與PoRV VP7蛋白中抗原表位相似的結(jié)構(gòu)，多肽接觸細胞后，可能占據(jù)細胞表面一部分受體，從而阻斷一部分病毒侵染細胞，多肽抑制病毒感染的具體作用機制，還有待進一步研究。

然而，所述肽庫具有小于10E9容量并不能掩蓋一個十二肽（12E20組合）所有氨基酸組合。表明，十二肽庫缺少理想的復(fù)合片段，除這些肽庫庫容量限制，其他因素包括密碼子和氨基酸的修飾均受限于宿主菌。因此，建設(shè)具有大容量和良好多樣性肽庫是噬菌體展示肽庫中的一個發(fā)展方向。另外，可誘變VP7上已被鑒定為模擬表位氨基酸，檢測誘變前后PoRV活性，確定更關(guān)鍵位點?，F(xiàn)有針對仔豬輪狀病毒的疫苗不理想，評估模擬表位疫苗的臨床應(yīng)用需進一步探討。

[參考文獻]

[1]邊亞娟,林長水,王玉玲,等.抗豬輪狀病毒VP6單克隆抗體的制備與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2006, 37(4): 489-491.

[2]Neog B K, Barman N N, Bora D P, et al. Experimental infection of pigs with group A rotavirus and enterotoxigenic Escherichia coli in India: gross, histopathological and immunopathological study[J]. Vet Ital, 2011, 47(2): 117-128.

[3]師東方,李一經(jīng),王君偉,等.豬輪狀病毒與傳染性胃腸炎病毒核酸免疫研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2006, 36(5): 605-610.

[4]Tatte V S, Rawal K N, Chitambar S D. Sequence and phylogenetic analysis of the VP6 and NSP4 genes of human rotavirus strains: evidence of discordance in their genetic linkage[J]. Infection, Genetics and Evolution, 2010, 10(7): 940-949.

[5]Wang L F, Yu M. Epitope identification and discovery using phage display libraries: applications in vaccine development and diagnostics[J]. Current Drug Targets, 2004, 5(1): 1-15.

[6]Jiang L, Zhou J M, Yin Y, et al. Selection and identification of B-cell epitope on NS1 protein of dengue virus type 2[J]. Virus Research, 2010, 150(1): 49-55.

[7]徐和敏,王琴,徐璐,等.豬瘟病毒E2基因噬菌體展示多肽庫的構(gòu)建及表位鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2010, 41(1): 71-76.

[8]Pedroza-Roldan C, Charles-Ni?o C, Saavedra R, et al. Variable epitope library-based vaccines: Shooting moving targets[J]. Molecular Immunology, 2009, 47(2): 270-282.

[9]楊巍,李廣興,孟凡丹,等.豬流行性腹瀉病毒N基因克隆及原核表達[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 42(6): 81-85.

[10]洪琴,任曉峰,李廣興.雞痘DNA疫苗Pvax-env構(gòu)建及其體內(nèi)表達[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 42(6): 105-108.

[11]石娜,李廣興,任曉峰,等.豬IL-15與PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 41(1): 97-102.

[12]Eswar N, Webb B, Marti-Renom M A, et al. Comparative protein structure modeling using Modeller[J]. Current Protocols in Bioinformatics, 2006: 5.6. 1-5.6. 30.

[13]Martí-Renom M A, Stuart A C, Fiser A, et al. Comparative protein structure modeling of genes and genomes[J]. Annual review of biophysics and biomolecular structure, 2000, 29(1): 291-325.

[14]趙高偉,任曉峰.輪狀病毒感染機制及防治的研究進展[J].世界華人消化雜志, 2013, 1: 021.

[15]時洪艷,馮力,陳建飛,等.豬輪狀病毒OSU強毒株VP7基因的克隆及其抗原表位原核表達和免疫學(xué)活性分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2008,30(2):136-140.

[16]Jiang L, Zhou J M, Yin Y, et al. Selection and identification of B-cell epitope on NS1 protein of dengue virus type 2[J]. Virus research, 2010, 150(1): 49-55.

[17]Malhotra U, Nolin J, Horton H, et al. Functional properties and epitope characteristics of T-cells recognizing natural HIV-1 variants[J]. Vaccine, 2009, 27(48): 6678-6687.

Identification and characterization of porcine rotavirus VP7 protein

mimotope by phage screening technique/

Liyan, GE Xuying

(School of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:Porcine rotavirus (PoRV) causes diarrhea, vomit, dehydration, acid-base imbalance and death in piglets. PoRV VP7 is the outer capsid glycoprotein that is highly immunogenic and induce the production of neutralizing antibody. A prepared monoclonal antibody (MAb) 3B6 against PoRV VP7 protein was used as immobilized target in a subtract biopanning process using a 12-mer phage display random peptide library. After four rounds of pannings, 10 phages bearing the consensus peptide VPLGTDNGDIWV and having a specific binding activity to the target were identified. Sequence alignment between positive phage-displayed 12-mer peptide and VP7 protein suggested that a potential motif that is identical with 167(P), 178(T), 179(D) or 184(W) aa in the VP7 protein. Competition ELISA

豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）屬呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus，RV），是引起幼齡仔豬病毒性腹瀉的主要病源之一[1]。PoRV在世界范圍內(nèi)廣泛流行，斷奶仔豬最為易感，主要臨床癥狀為嚴重腹瀉，部分感染PoRV的仔豬會出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂等癥狀，而且容易繼發(fā)其他細菌性感染[2]，導(dǎo)致仔豬病死率升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失[3]。輪狀病毒是由11個不連續(xù)的雙股RNA組成，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白（VPs）和6種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSPs）[4]。VP7蛋白作為輪狀病毒外層最多的成分，是一種N-聯(lián)低聚甘露糖糖蛋白，決定病毒的血清型，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。

噬菌體展示技術(shù)是從隨機肽庫中篩選出能和靶蛋白發(fā)生特異性結(jié)合的表位，基本原理是將外源蛋白或多肽的基因與噬菌體外殼蛋白基因融合，以融合蛋白的形式在噬菌體表面表達出多肽序列，保持特定的空間構(gòu)象，利用特異性親和作用來篩選特異性蛋白或多肽的一項技術(shù)[5]?？乖砦皇强烧T導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的基本單位，也是抗原分子中與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合的部位，抗原表位的確定對疫苗設(shè)計，藥物開發(fā)、以及相應(yīng)免疫診斷方法的選擇等具有指導(dǎo)意義[6]。本試驗利用抗PoRV VP7單克隆抗體通過噬菌體展示技術(shù)鑒定出一個PoRV VP7蛋白一個抗原表位，有利于了解VP7蛋白抗原結(jié)構(gòu)，為探究PoRV結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供理論依據(jù)，也為研制PoRV新型表位疫苗及診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

噬菌體展示隨機肽庫Ph.D.-12TM試劑盒購自New England BioLabs公司，肽庫的滴度為1.5×1013PFU·mL-1，宿主菌為E. coli ER2738；IPTG、X-gal、PEG8000、四環(huán)素（Tet）等化學(xué)試劑購自哈爾濱無限峰科技有限公司，為國產(chǎn)分析純試劑；辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗M13單克隆抗體為NEB公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗PoRV VP7單克隆抗體3B6株。

1.2方法

1.2.1驗噬菌體篩選與擴增

應(yīng)用噬菌體展示12肽篩選試劑盒對PoRV VP7單克隆抗體進行配體篩選，共進行四輪篩選，前三輪包括洗脫和擴增；第四輪僅進行洗脫。用0.1 mol·L-1NaHCO3（pH 8.6）將純化后的單克隆抗體腹水稀釋至200 μg·mL-1，取100 μL加入到酶標孔中，4℃包被過夜；第二天棄去包被液，0.01% PBST洗孔3次，然后用5% BSA在4℃條件下封閉4 h；棄去封閉液，0.1% TBST洗孔6次后，加入1.5×1011PFU·100 μL-1噬菌體原始文庫，室溫緩慢震蕩10 min，靜止10 min，再震蕩10 min，靜止10 min；棄去未結(jié)合的噬菌體，0.1% TBST洗孔10次，后加入100 μL洗脫液（0.2 mol·L-1glycine-HCl pH 2.2），室溫緩慢震蕩30 min；加入15 μL 1 mol·L-1Tris-HCl中和洗脫液；收獲的洗脫液用于噬菌體擴增及滴度測定；將宿主菌ER2738 在LB培養(yǎng)板上劃線并在37℃過夜培養(yǎng)。第二天挑取單個菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4.5 h，取200 μL宿主菌ER2738的菌液加入到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，并加入每一輪篩選時未擴增的洗脫產(chǎn)物50 μL，37℃條件下劇烈震搖擴增4.5 h；菌液經(jīng)10 000 r·min-1離心20 min，向上清中加入1/6體積的20% PEG8000/NaCl，混勻后4℃正立靜置過夜；4℃，10 000 r·min-1離心15 min，棄去上清，沉淀重懸于1 mL TBS中；4℃，10 000 r·min-1離心5 min去除沉淀，上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP中，加入1/6體積的20% PEG8000/NaCl，混勻后4℃正立靜置1 h；4℃，10 000 r·min-1離心15 min，棄去上清，用200 μL TBS重懸沉淀，此溶液為擴增后產(chǎn)物；滴度測定：用低鹽LB 10倍倍比稀釋待測噬菌體；每個稀釋度取10 μL加入到200 μL宿主菌ER2378的新鮮菌液中，混勻后再轉(zhuǎn)移

showed that the high affinity peptide reduced the combination of PoRV with anti-VP7 MAb. Moreover, this peptide could significantly inhibit PoRV propagation in cell culture. In conclusion, the 4 amino acid motif (P-TD-W) functions as a spatial conformation epitope of PoRV VP7 protein.

Key words:porcine rotavirus; VP7 protein; phage screening; mimic peptidebook=2,ebook=13至預(yù)熱的液體頂層瓊脂中混勻，混勻后的液體平鋪于預(yù)熱的LB/IPTG/X-gal固體平板上；待液體頂層瓊脂冷卻凝固后，將所有平板倒置于37℃溫箱中避光培養(yǎng)過夜；第二天檢查平板，第一個小于100的平板藍斑數(shù)即為每10 μL噬菌體的PFU[7]。

作者簡介：任曉峰（1974-2014），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與分子病毒學(xué)。E-mail: renxf@neau. edu. cnREN Xiaofeng, QIN Zhaoheng, CAO

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31300758; 31340003）；“十二五”國家科技支撐項目（2013BAD12B04）；哈爾濱科學(xué)技術(shù)局項目（RC2012XK002003）；教育部重點項目（212038）

收稿日期：2014-04-03

文章編號：1005-9369（2015）02-0011-07

文獻標志碼：A

中圖分類號：S828；S851