周旺洋 賀秀云 劉夢婷 呂秋菊 秦海燕 李越蘭 宋捷民△
(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院,浙江 杭州 310005;2.浙江中醫(yī)藥大學,浙江 杭州310053)
不同比例附子配黃連在Caco-2細胞模型中跨膜轉(zhuǎn)運研究*
周旺洋1賀秀云2劉夢婷2呂秋菊2秦海燕2李越蘭2宋捷民2△
(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院,浙江 杭州 310005;2.浙江中醫(yī)藥大學,浙江 杭州310053)
目的 通過Caco-2細胞模型,研究不同比例的附子配黃連在Caco-2細胞中主要成分的吸收和轉(zhuǎn)運情況。方法 利用Caco-2細胞模型和高效液相色譜法,研究附子配黃連比例為1∶1、1∶2、2∶1時的吸收和轉(zhuǎn)運,計算跨膜轉(zhuǎn)運量和表觀滲透系數(shù),3種比例藥物配伍對吸收和轉(zhuǎn)運的影響。結果 附子∶黃連比例為1∶1、1∶2、2∶1時,鹽酸小檗堿在150min時的跨膜轉(zhuǎn)運量AP→BL側(cè)分別為0.625,0.161,0.055μg,BL→AP側(cè)分別為1.308,0.178,0.064μg,表觀滲透系數(shù)分別為2.095,1.107,1.172μg,次烏頭堿在150min時的跨膜轉(zhuǎn)運量AP→BL側(cè)分別為0.634,0.401,0.204μg,BL→AP側(cè)分別為0.534,0.108,0.067μg,表觀滲透系數(shù)分別為0.842,0.268,0.328。結論 附子配黃連1∶1用量比優(yōu)于1∶2、2∶1的用量比,證明臨床用量比的最佳性。
附子配黃連 比例 Caco-2細胞 跨膜轉(zhuǎn)運
附子配黃連,出自《傷寒論》附子瀉心湯。后世醫(yī)家在治寒熱錯雜的方劑中每每用之,附子黃連,一熱一寒,寒溫并用。臨床上常用于寒熱互結所致的心下痞滿,寒熱夾雜之瀉痢,上熱下寒之口瘡足冷等證。但在諸方劑中,二藥配伍比例各不相同。有文獻報道,黃連與附子不同配伍比例對小鼠胃腸運動影響各異[1]。為此本研究選用目前應用最佳的體外吸收Caco-2細胞模型,測定二藥不同配伍的吸收、轉(zhuǎn)運特征,以研究附子配黃連之間的相互作用和生物利用度?,F(xiàn)報告如下。
1.1 細胞與試藥 Caco-2細胞株購自上海細胞庫,傳代數(shù)為25~50代。RPMI-1640細胞培養(yǎng)液(吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司,產(chǎn)品型號:GNM31800-S);0.25%胰酶(凱基生物醫(yī)藥技術有限公司,產(chǎn)品型號:KGM27250);D-Hanks緩沖液(吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司,產(chǎn)品型號:GNM14175);胎牛血清(產(chǎn)品型號:Gibco,16000044);MEMNEAA非必需氨基酸溶液100X(產(chǎn)品型號:Gibco,11140050);L-谷氨酰胺 (杭州昊天生物技術有限公司,產(chǎn)品型號:PYG21051);堿性磷酸酶ALP/AKP試劑盒 (南京建成生物工程研究所);MTT(產(chǎn)品型號:Amresco 0793);二氯甲烷(天津市永大化學試劑有限公司);次烏頭堿標準品 (中國食品藥品檢定研究院,110798-201106);鹽酸小檗堿(中國藥品生物制品檢定所,批號:110713-200911)。藥材附子選自四川綿陽市江油恒源藥業(yè)有限公司附子GAP基地,黃連購自重慶市石柱縣黃水鎮(zhèn)黃連GAP基地,藥材經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室張水利教授鑒定,附子為毛莨科植物烏頭(AconiLum carmichaeli Debx.)的子根的加工品,黃連為毛茛科植物黃連(Coptis chinensis Franch)的干燥根莖。經(jīng)學院制劑室提取得附子提取物 (自制,13011706,烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的含量分別為2.29、2.76、2.02mg/g)、黃連提取物(自制,12122110)。分別精密稱取黃連自制品、附子自制品適量,折合藥材質(zhì)量比例,制得附子∶黃連分別為1∶1(藥對1),1∶2(藥對2),2∶1(藥對3)的溶液,0.22μm微孔濾膜過濾除菌,存于4℃冰箱待用。
1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱 Thermo scientific;SWCJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司;TE-2000-S倒置顯微鏡,日本尼康;LDZ5-2低速自動平衡醫(yī)用離心機,北京醫(yī)用離心機廠;R502B SENCO恒溫水浴,上海森信實驗儀器有限公司;YXQ-280SD型蒸汽滅菌器,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;680型酶標儀,Thermo scientific;十萬分之一天平,Mettler Toledo;DGG 9240B型電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司;跨膜電阻儀,Millicell-ERS,Millipore corporation,USA;24孔Transwell小室,Greiner;24孔貼壁細胞培養(yǎng)板,Greiner;96孔細胞培養(yǎng)板,Corning;25 cm2細胞培養(yǎng)瓶,Corning;0.22μm微孔濾器,Corning;島津LC高效液相色譜儀(日本島津公司);色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm× 150mm,5μm)。
1.3 確定附子黃連的配伍比例 從轉(zhuǎn)化醫(yī)學角度出發(fā),附子配黃連用量比例應來自于臨床。筆者整理研究了歷代著名方書中129張含有附子、黃連的方劑,分析研究后,結果表明:有59張方附子配黃連用量比是為1∶1;10張方附子配黃連為2∶1;16張方附子配黃連為1∶2。確定臨床使用較多的3種附子配黃連用量比例1∶1、1∶2、2∶1,作為在Caco-2細胞模型中吸收和轉(zhuǎn)運情況用藥配伍比例。
1.4 建立細胞單層模型 在接種細胞前1 d將24孔Transwell小室置于4.5%CO2,37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化一夜。取對數(shù)生長期細胞按細胞傳代的方法消化離心,加培養(yǎng)液稀釋成細胞混懸液,按1×105個/mL,300μL接種到Transwell聚酯(PET)上,另取RPMI-1640細胞培養(yǎng)液1500μL于24孔板中。接種后前14 d每隔1 d換1次液,以后每天換液,培養(yǎng)21 d左右[2-3]。
1.5 轉(zhuǎn)運實驗 待Caco-2細胞在Transwell培養(yǎng)板上形成緊密、完整的單細胞層后,吸去培養(yǎng)液。各孔貼壁加入37℃的D-Hanks液,在不破壞細胞層的條件下,蕩洗細胞3次,吸干各孔內(nèi)D-Hanks液。當研究藥物從AP側(cè)→BL側(cè)轉(zhuǎn)運時,在24孔Transwell培養(yǎng)板上AP側(cè)加入0.3mL藥物,BL側(cè)加入1.5mLD-Hanks緩沖液;當研究藥物從BL側(cè)→AP側(cè)轉(zhuǎn)運時,在AP側(cè)加入0.3 mL D-Hanks緩沖液,BL側(cè)加入1.5 mL藥物;然后把Transwell培養(yǎng)板放在37℃,4.5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng),分別在90、120、150min從接收側(cè)(加D-Hanks緩沖液一側(cè))吸取0.1mL接收液于EP管中,并放置于-80℃冰箱待測,每次補足相應量的D-Hanks緩沖液[4]。
HPLC檢測各成分含量。色譜條件為,色譜柱:A-gilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm,5μm),流動相:甲醇(B相)-0.1%甲酸(A相),總流速:1.00mL/min,檢測波長:237 nm,柱溫:(25±1)℃,進樣量:20μL。見表1。
表1 色譜條件
轉(zhuǎn)運試驗中加入空白轉(zhuǎn)運液的一側(cè)為接收室,接收室的藥量視為吸收量(Qri)。AP-BL轉(zhuǎn)運試驗中,BL室藥量為吸收量;BL-AP轉(zhuǎn)運試驗中,AP室藥量為吸收量,由于雙向轉(zhuǎn)運空白轉(zhuǎn)運液體積不同,累計吸收量的計算公式略有差異。每個時間點取樣后,樣品不再返還Transwell系統(tǒng),但要補加相同體積的空白轉(zhuǎn)運液,以保持溶液體積不變。具體計算方法見以下公式:
AP→BL QrB=0.1(Qr1+Qr2+……+Qr(i-1))+1.5Cri,
BL→AP QrA=0.1(Qr1+Qr2+……+Qr(i-1))+0.3Cri,
上式中,1.5、0.3分別為接收室所加D-Hanks液體積(mL),0.1為取樣體積(mL),Cri為接受室第i個時間點實測藥物濃度(i=1~3)。
藥物透過Caco-2細胞單層的表觀穿透系數(shù)用Papp(cm/s)值作為參考,按下式進行藥物轉(zhuǎn)運率計算:
其中△Q(μg)為△t(s)內(nèi)的轉(zhuǎn)運量,A(0.33 cm2)為細胞單層膜面積,Co(μg/mL)為供給室藥物初濃度。兩側(cè)轉(zhuǎn)運率比值Pratio的計算公式:
其中Papp(BL-AP)和Papp(AP-BL)分別為雙向表觀滲透系數(shù)[5]。
1.6 方法學考察
1.6.1 線性關系考察[6]精密稱取鹽酸小檗堿標準品0.21mg于10mL容量瓶中,用二氯甲烷溶解稀釋至刻度,用D-Hanks緩沖液稀釋成13.12,26.25,52.5,105,210 ng/mL的溶液;精密稱取次烏頭堿標準品1.05mg于10mL容量瓶中,用二氯甲烷稀釋至刻度,再用DHanks分別稀釋成65.62,131.25,262.5,525,1050 ng/mL的溶液;其中二氯甲烷的濃度小于0.5%將不會影響單細胞層的完整性。進行HPLC色譜分析,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,分別做標準曲線。鹽酸小檗堿的標準曲線為:y=473.89x-473.08(r=0.9997),次烏頭堿的標準曲線為:y=220.75x-1648.8(r=0.9991)。鹽酸小檗堿在13.125~210 ng/mL,次烏頭堿在65.625~1050 ng/mL的范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關系。
1.6.2 穩(wěn)定性考察[7]精密吸取鹽酸小檗堿、次烏頭堿標準溶液20μL,分別于0、2、4、6、8、10 h進行測定,計算各峰面積標準偏差。鹽酸小檗堿、次烏頭堿標準偏差分別為2.76%、1.19%。
1.6.3 精密度考察[8]分別精密吸取鹽酸小檗堿、次烏頭堿標準溶液20μL,各重復進樣6次,計算各峰面積標準偏差。鹽酸小檗堿、次烏頭堿標準偏差分別為1.80%、0.42%。
1.6.4 專屬性實驗[9]分別精密吸取D-Hanks緩沖液(含0.25%二氯甲烷)、鹽酸小檗堿標準品、次烏頭堿標準品20μL,進行HPLC分析,考察分析方法專屬性。結果溶劑對成分檢測無干擾。
1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以(±s)表示,采用方差分析和t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 MTT實驗結果 藥對1、藥對2、藥對3分別在2.18~34.80、4.44~71.00、1.15~18.4(μg/mL,以鹽酸小檗堿計)內(nèi)對Caco-2細胞為非細胞毒性計量,選取安全濃度進行吸收與轉(zhuǎn)運實驗,分別為34.80、71.00、18.4μg/mL。
2.2 3個比例藥對在各個時間段的跨膜轉(zhuǎn)運量 見表2~4。利用HPLC方法測定3個比例藥對在各個時間段的跨膜轉(zhuǎn)運量。結果顯示鹽酸小檗堿和次烏頭堿的跨膜轉(zhuǎn)運量隨時間的增加而不斷增加。在不同時間點,藥對1中鹽酸小檗堿和次烏頭堿的轉(zhuǎn)運量大于另外兩個藥對。
表2 藥對1主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q(μg,±s)
表2 藥對1主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q(μg,±s)
藥物 轉(zhuǎn)運方向 90min 120min 150min鹽酸小檗堿AP→BL 0.039±0.006 0.540±0.186 0.625±0.170(n=3)BL→AP 0.033±0.012 0.862±0.059 1.308±0.613次烏頭堿AP→BL 0.241±0.029 0.546±0.014 0.634±0.031(n=3)BL→AP 0.060±0.012 0.382±0.006 0.534±0.033
表3 藥對2主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q(μg,±s)
表3 藥對2主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q(μg,±s)
藥物 轉(zhuǎn)運方向 90min 120min 150min鹽酸小檗堿AP→BL 0.027±0.006 0.119±0.009 0.161±0.026(n=3)BL→AP 0.074±0.010 0.146±0.006 0.178±0.008次烏頭堿AP→BL 0.335±0.042 0.339±0.056 0.401±0.044(n=3)BL→AP 0.045±0.006 0.081±0.011 0.108±0.007
表4 藥對3主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q(μg,±s)
表4 藥對3主要成分在不同時間的跨膜轉(zhuǎn)運量△Q(μg,±s)
藥物 轉(zhuǎn)運方向 90min 120min 150min鹽酸小檗堿AP→BL 0.037±0.002 0.048±0.005 0.055±0.007(n=3)BL→AP 0.024±0.007 0.039±0.008 0.064±0.015次烏頭堿AP→BL 0.152±0.015 0.176±0.004 0.204±0.036(n=3)BL→AP 0.034±0.001 0.046±0.005 0.067±0.003
2.3 鹽酸小檗堿和次烏頭堿的表觀轉(zhuǎn)運系數(shù)(Papp)和雙向轉(zhuǎn)運率(Pratio) 見表5,表6。根據(jù)公式計算鹽酸小檗堿和次烏頭堿的Papp和Pratio。結果鹽酸小檗堿在藥對1中以主動轉(zhuǎn)運為主,而在藥對2和藥對3中則表現(xiàn)為以被動轉(zhuǎn)運為主。次烏頭堿表現(xiàn)為以被動轉(zhuǎn)運為主。
表5 鹽酸小檗堿的Papp和Pratio比較(±s)
表5 鹽酸小檗堿的Papp和Pratio比較(±s)
藥對n Papp(AP→BL)Papp(BL→AP)Pratio(×10-6cm/s) (×10-6cm/s) (BL→AP/AP→BL)藥對1 3 6.043±1.640 12.659±5.9352.095藥對2 3 0.765±0.125 0.846±0.0401.107藥對3 3 0.998±0.122 1.169±0.2781.172
表6 次烏頭堿的Papp和Pratio比較(±s)
表6 次烏頭堿的Papp和Pratio比較(±s)
藥對n Papp(AP→BL)Papp(BL→AP)Pratio(×10-6cm/s) (×10-6cm/s) (BL→AP/AP→BL)藥對1 3 15.705±0.759 13.216±0.8260.842藥對2 3 9.925±1.094 2.662±0.1620.268藥對3 3 5.069±0.880 1.663±0.0640.328
Caco-2細胞于1977年由Fogh等首次分離自人類結腸腺癌細胞,其結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞,具有微絨毛,緊密連接等結構,并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系和一定程度的蛋白表達,因此Caco-2細胞模型的跨膜轉(zhuǎn)運實驗,可以用來模擬藥物在體內(nèi)的經(jīng)小腸上皮吸收過程。本研究采用Caco-2單細??稍诩毎缴咸峁┧幬锓肿油高^小腸黏膜的吸收、分布、代謝、轉(zhuǎn)運以及毒性的綜合信息。
中醫(yī)臨床上不少急癥處方有寒性熱性藥物合用,如治蛔厥腹痛的烏梅丸,治肝火內(nèi)郁、胃脘劇痛、嘔吐酸水的連附六一湯等,中藥“寒熱并用”在機體內(nèi)的作用機制如何,尚不完全清楚。本實驗借助寒熱藥性有代表性的附子配黃連為載體,通過建立Caco-2細胞模型,研究不同比例附子黃連配伍后在Caco-2細胞中的吸收與轉(zhuǎn)運機制,以探究的寒藥熱藥配伍后對機體的影響。附子味辛、甘,大熱,有毒,功效回陽救逆、補火助陽、散寒止痛。其中烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿被證實是附子發(fā)揮強心、抗炎、鎮(zhèn)痛功效的有效成分。黃連味苦性寒,能清熱燥濕,瀉火解毒,含有多種生物堿,其中主要生物堿為小檗堿。其具有廣譜抗生素的作用,在臨床上長期以來用于降熱鎮(zhèn)痛、抗腸道細菌感染。目前關于附子黃連配伍在細胞層面研究尚未見報道。鑒于二者配伍之主治多在胃腸,而Caco-2細胞又能模擬小腸上皮細胞之功能,故利用其研究甚為合適。
本文首次報道關于利用Caco-2細胞模型研究附子黃連不同配伍后的成分吸收變化。通過建立Caco-2細胞模型,研究不同比例附子黃連配伍后在Caco-2細胞中的吸收與轉(zhuǎn)運機制。實驗結果提示:鹽酸小檗堿、次烏頭堿作為附子黃連配伍后的主要有效成分,性質(zhì)穩(wěn)定,建立的檢測方法穩(wěn)定可靠,可作為檢測指標說明實驗結果。其次,小檗堿和次烏頭堿的轉(zhuǎn)運量大小依次為1∶1>1∶2>2∶1。結果顯示附子配黃連比例為1∶1最有利于有效成分的吸收及利用。與歷代方書中1∶1使用最多相合,證明了中醫(yī)歷代以來附子配黃連1∶1配伍的科學性,為臨床中附子黃連配伍比應用提供了實驗室依據(jù)。有實驗表明,單用黃連,其所含的小檗堿在胃腸道吸收不好[10]。在Caco-2細胞模型中藥物分子的Papp與口服吸收相關聯(lián),因為Papp的大小直接反映藥物經(jīng)腸道的吸收能力。吸收良好藥物的Papp大于1×10-6cm/s,而吸收差的藥物,其Papp小于1×10-7cm/s[11]。本實驗中不同配比的附子配黃連中,小檗堿和次烏頭堿的Papp均大于1×10-6cm/s,說明附子配黃連用量比例1∶1、1∶2、2∶1均具有良好的口服吸收性。鹽酸小檗堿在藥對1∶1中表現(xiàn)為以主動轉(zhuǎn)運為主,在藥對1∶2、2∶1表現(xiàn)以被動轉(zhuǎn)運為主。提示附子配黃連的寒熱偏性對物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運方式有一定的影響,具體機制有待更深入研究。
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Research of Transmembrane Transport of Different Proportions of Fuzi(Aconitum carmichaeli debx.)with Huanglian(Coptis chinensis)in Caco-2 Cells Model
ZHOU Wangyang1,HE Xiuyun2,LIU Mengting2,et al. 1 The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang,Hangzhou 310005,China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang,Hangzhou 310053,China
Objective:To study the absorption and transport condition of the main components of different proportions of Fuzi(Aconitum carmichaeli debx.)with Huanglian(Coptis chinensis)in Caco-2 cells model.Methods:The Caco-2 cells model and high performance liquid chromatography (HPLC)method were establish to study the absorption and transport condition when the aconite-coptis ratio was 1∶1,1∶2,2∶1.The transmembrane transport amount and the apparent permeability coefficients were calculated the influence of the 3 ratios of the two drugs on absorption and transport.Results:When the aconite-coptis ratio was 1∶1,1∶2,2∶1,respectively,the transmembrane transport amounts(μg)at 150min of berberine hydrochloride on AP→BL side are 0.625,0.161,0.055.On BL→AP side were 1.308,0.178,0.064,and the apparent permeability coefficients were 2.095,1.107,1.172,the transmembrane transport amounts(μg)at 150min of hypaconitine on AP→BL side were 0.634,0.401,0.204,on BL→AP side were 0.534,0.108,0.067,and the apparent permeability coefficients were 0.842,0.268,0.328.Conclusion:The aconite-coptis ratio of 1∶1 was better than the ratio of 1∶2 and 2∶1.It is proved the best clinical ratio.
Fuzi(Aconitum carmichaeli debx.)with Huanglian (Coptis chinensis);Ratio;Caco-2 cell;Trans-membrane transport
R289.5
A
1004-745X(2015)05-0753-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.001
2015-02-01)
國家自然科學基金面上項目(81073067)
△通信作者(電子郵箱:ssc3631@163.com)