H PLC-U V測(cè)定歸脾丸（濃縮丸）中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量

趙群濤　楊俊杰　方永凱　盚罡　李丹

（1信陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南信陽(yáng)464000；2信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院生物技術(shù)系）

H PLC-U V測(cè)定歸脾丸（濃縮丸）中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量

趙群濤1楊俊杰2方永凱1盚罡1李丹1

（1信陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南信陽(yáng)464000；2信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院生物技術(shù)系）

目的：建立高效液相色譜紫外檢測(cè)法（HPLC-UV）同時(shí)測(cè)定歸脾丸（濃縮丸）中酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷含量的方法。方法：色譜柱為T(mén)hermo Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水為流動(dòng)相（28∶72），檢測(cè)波長(zhǎng)204 nm；流速1.0 mL/min；柱溫28℃。結(jié)果：酸棗仁皂苷A進(jìn)樣量在2.53～15.18 μg，黃芪甲苷進(jìn)樣量在2.55～15.30 μg范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，回收率分別為99.1%和98.4%。結(jié)論：該方法靈敏、重復(fù)性好，可用于歸脾丸（濃縮丸）的質(zhì)量控制。

歸脾丸（濃縮丸）；酸棗仁皂苷A；黃芪甲苷；高效液相色譜紫外檢測(cè)法

歸脾丸（濃縮丸）由黨參、白術(shù)、黃芪、當(dāng)歸、遠(yuǎn)志、酸棗仁、甘草等13味中藥組成，現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第七冊(cè)》，有益氣健脾、養(yǎng)血安神的功效，用于心脾兩虛，失眠多夢(mèng)，頭昏頭暈，崩漏便血等癥。該制劑中黃芪和酸棗仁分別是補(bǔ)氣和安神的代表性藥物，其主要有效成分分別是黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上考察高效液相色譜紫外檢測(cè)法（HPLCUV）測(cè)定歸脾丸（濃縮丸）中這兩種成分含量的可行性。

1　儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器），Waters高效液相色譜儀（2489紫外檢測(cè)器串聯(lián)2420蒸發(fā)光檢測(cè)器，高效液相色譜-紫外檢測(cè)器聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-UV-ELSD））；METTLER TOLEDO XS205電子天平，基因型1850摩爾超純水機(jī)（重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司）。酸棗仁皂苷A（110734-200407）和黃芪甲苷（110781-201314）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈購(gòu)自TEDIA Company.INC公司，均為色譜純，水為Ⅰ級(jí)超純水，其他試劑均為分析純。歸脾丸（濃縮丸）均為市售，見(jiàn)表1。

表1　樣品含量測(cè)定結(jié)果 （mg/g）

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Agilent 1260色譜儀，Thermo Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-水（28∶72）作流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)204 nm，流速1.0 mL/min；柱溫28℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2試液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取兩種對(duì)照品適量，加甲醇制成含酸棗仁皂苷A 0.506 mg/mL、黃芪甲苷0.51 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液將本品研碎，取約8.0 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，加甲醇適量回流提取6 h，提取液水浴蒸干，殘?jiān)盟?5 mL微熱使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用石油醚（60～90℃）洗滌3次，每次25 mL，水液用水飽和的正丁醇提取3次，每次25 mL，再用正丁醇飽和的0.5%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次25 mL，蒸干正丁醇提取液，殘?jiān)蛹状嫁D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，用0.45 μm濾膜過(guò)濾測(cè)定。

2.2.3陰性樣品溶液根據(jù)歸脾丸（濃縮丸）的處方，制備不含黃芪和酸棗仁的陰性樣品，按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.3專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按“2.1”色譜條件測(cè)定，結(jié)果陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1　HPLC-UV色譜圖

2.4檢測(cè)限和定量限

將各對(duì)照品色譜峰測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，分別以信噪比為3∶1及10∶1時(shí)注入儀器的量確定檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5，10，15，20，30 μL，按“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果以峰面積Y對(duì)對(duì)照品的進(jìn)樣量X（μg）進(jìn)行回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積積分值，酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的RSD分別為0.8%和1.0%，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于0，1，3，6，9，12，24 h測(cè)定，記錄峰面積，酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的RSD分別為1.1%和1.3%，結(jié)果顯示樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（140309）樣品按“2.2”項(xiàng)方法平行制備6份，按“2.1”色譜條件測(cè)定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量，計(jì)算RSD。測(cè)得酸棗仁皂苷A的含量分別為0.293，0.290，0.299，0.296，0.297，0.291 mg/g，RSD為1.2%；黃芪甲苷的含量分別為0.210，0.213，0.217，0.216，0.219，0.215 mg/g，RSD為1.5%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取兩種對(duì)照品適量制成含酸棗仁皂苷A 1.15 mg/mL、黃芪甲苷0.85 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。取同一批（140309）樣品6份，每份約8.0 g，精密稱(chēng)定，精密加入上述混合對(duì)照品溶液2 mL，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備，再按“2.1”色譜條件測(cè)定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.10樣品測(cè)定

按照“2.2.2”方法制備5個(gè)批號(hào)樣品，按“2.1”色譜法測(cè)定酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3　討論

表2　對(duì)照品線(xiàn)性關(guān)系考察

表3　加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

3.1用DAD檢測(cè)器在190～400 nm掃描對(duì)照品溶液，發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷均僅有末端吸收。在Waters色譜儀上用HPLC-UV-ELSD法測(cè)定5個(gè)廠家的樣品，當(dāng)不用石油醚洗滌甲醇提取液［1］時(shí)，紫外檢測(cè)器檢測(cè)的樣品峰太多，兩種待檢測(cè)成分峰響應(yīng)比較低，且不容易與前后峰分開(kāi)，批分析100 min時(shí)上一針未出完峰仍會(huì)淹沒(méi)下一針樣品的這兩種成分峰，導(dǎo)致下針無(wú)待分析成分峰，在Agilent 1260色譜儀DAD檢測(cè)器上也是這種情況，說(shuō)明不能用HPLC-UV法分析；而在蒸發(fā)光檢測(cè)器下樣品峰較少，兩種待測(cè)成分峰較高并與鄰近峰分離良好，可以滿(mǎn)足分析要求。樣品用石油醚洗滌除雜，在兩臺(tái)儀器上經(jīng)方法學(xué)考察，HPLC-UV法可以滿(mǎn)足測(cè)定要求。

3.2樣品處理比較了甲醇常溫超聲30 min、回流4 h和索氏提取6 h［2-3］，結(jié)果超聲和回流不同時(shí)間提取液的酸棗仁皂苷A和黃芪甲苷含量相差不大，均低于索氏提取的含量。經(jīng)試驗(yàn)石油醚索氏提取5 h脫脂［4］后再用甲醇索氏提取或甲醇索氏提取后用石油醚萃取［5］，兩種提取方法測(cè)得的兩種待測(cè)成分的含量沒(méi)有明顯差別，但甲醇提取液蒸干后油脂較大，后者更利于下一步正丁醇的提取且萃取較索氏提取用時(shí)更少。測(cè)試結(jié)果表明用正丁醇飽和的0.5%氫氧化鈉溶液洗滌正丁醇提取液，比用氨試液［6］和1%氫氧化鈉溶液洗滌［3］的兩種待測(cè)成分的含量高。甲醇索氏提取液蒸干后用水轉(zhuǎn)移直接過(guò)D101大孔樹(shù)脂柱處理［1，3］，樣品溶液因油脂太大極難過(guò)濾；用本文方法處理5個(gè)廠家的樣品溶液再經(jīng)D101大孔樹(shù)脂柱處理［3］，有的樣品待測(cè)成分會(huì)比本文的方法略高，但不顯著，有的含量反而沒(méi)有本文的方法高，說(shuō)明增加提取步驟會(huì)加大誤差，經(jīng)考察本文的方法已能滿(mǎn)足分析要求，不同提取方法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　不同提取方法樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

3.3歸脾丸（濃縮丸）原標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)，目前測(cè)定黃芪和酸棗仁藥材及其制劑中黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A含量的文獻(xiàn)多是用HPLC-ELSD［1-4，6］，還未見(jiàn)用HPLC-UV同時(shí)測(cè)定這兩種成分的文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)考察用HPLC-UV也能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)分析要求且HPLC-UV應(yīng)用更廣泛。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾考慮同時(shí)測(cè)定補(bǔ)氣藥黃芪中黃芪甲苷、補(bǔ)血藥當(dāng)歸中阿魏酸、安神藥酸棗仁皂苷A和調(diào)和藥甘草中甘草酸含量，通過(guò)測(cè)定君臣佐使藥以全面控制歸脾丸（濃縮丸）質(zhì)量，為分析不同廠家的產(chǎn)品提供依據(jù)［7］，但研究表明黃芪甲苷和酸棗仁皂苷A的正丁醇提取液不用氨試液等堿液洗滌，樣品干擾成分增多影響分離且導(dǎo)致待測(cè)成分含量降低，用堿液會(huì)破壞酸性成分阿魏酸和甘草酸，這4種成分不能用一種方法進(jìn)行提取，同時(shí)由于HPLC-UV樣品峰較多，即使分別提取也不能用同一分析方法測(cè)定，最終無(wú)法實(shí)現(xiàn)4種成分的同時(shí)測(cè)定。

［1］王景.HPLC測(cè)定歸脾丸（濃縮丸）中黃芪甲苷的含量［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（26）：46-47.

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［3］邢婕，秦雪梅，張麗增.HPLC-ELDS法測(cè)定黃芪甲苷含量供試品溶液制備方法改進(jìn)［J］.山西大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，31（4）：577-579.

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［7］趙群濤，方永凱，楊俊杰，等.不同廠家歸脾丸（濃縮丸）中阿魏酸和甘草酸含量考察［J］.中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2015，12（4）：16-19.

Simultaneous Determination of Jujubosede A and AstragalosideⅣin Guipi Pills（Concentrated Pills）by HPLC-UV

Zhao Quntao1，Yang Junjie2，F(xiàn)ang Yongkai1，Qiu Gang1，Li Dan1
（1 Xinyang Institute for Food and Drug Control，Henan Xinyang 464000，China；2 Biotechnology Department of Xinyang Agriculture and Forestry College）

Objective:To establish a method for the simultaneous determination of the contents of jujuboside A and astragalosideⅣin guipi pills（concentrated pills）by HPLC-UV.Methods:HPLC-UV was performed on Thermo Hypersil BDS C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with a mobile phase of acetonitrile-water（28∶72），detection wavelength was at 204 nm，the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was at 28℃. Results:A good linear relationship was obtained within the range of 2.53～15.18 μg and 2.55～15.30 μg for jujuboside A and astragalosideⅣ，and the recovery rate was 99.1%and 98.4%respectively.Conclusion:The method was sensitive and reproducible and is suitable for the quality control of guipi pills（concentrated pills）.

Guipi Pills（Concentrated Pills）；Jujuboside A；AstragalosideⅣ；HPLC-UV

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.09.008

2015-05-12）

河南省2013年科技發(fā)展計(jì)劃基金資助（132102310265）

趙群濤，男，主管中藥師。研究方向：中藥質(zhì)量分析。E-mail：28843515@qq.com