黃連上清片中黃芩苷與歐前胡素的含量測定方法研究

張小博　曹恒濤　王小艷

（安陽市食品藥品檢驗所，河南安陽455000）

黃連上清片中黃芩苷與歐前胡素的含量測定方法研究

張小博曹恒濤王小艷

（安陽市食品藥品檢驗所，河南安陽455000）

目的：建立黃連上清片中黃芩苷和歐前胡素的高效液相色譜含量測定方法。方法：采用高效液相色譜儀，Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長：300 nm；柱溫25℃，PDA檢測。結果：黃芩苷在0.083～3.325 μg范圍內呈良好線性關系，r=0.999 9，回收率為103.54%，RSD=1.24%；歐前胡素在0.004～0.160 μg范圍內呈良好線性關系，r=0.999 9，回收率為102.69%，RSD=0.95%。結論：本方法操作簡便，結果準確、可靠，可用于同一波長處同時測定黃芩苷與歐前胡素的含量。

高效液相色譜；黃連上清片；黃芩苷；歐前胡素

黃連上清片是由黃連、梔子、連翹、白芷、防風、大黃、黃芩、黃柏、菊花等17味藥材組成，收載于《中國藥典》2010年版一部［1］，具有疏風清熱，瀉火止痛的功效，用于頭暈目眩、暴發(fā)火眼、牙齒疼痛、口舌生瘡、咽喉腫痛、耳痛耳鳴、大便秘結、小便短赤。其療效可靠，應用面廣，但據(jù)文獻研究，不同廠家生產的黃連上清片所含色譜峰的數(shù)目和峰面積存在很大差異［2］，說明其質量受提取工藝和藥材原料的影響較大，而《中國藥典》中僅對黃連、黃柏中的鹽酸小檗堿進行了含量測定，對大黃和梔子進行了薄層鑒別。近年來，相繼有文獻［3-4］報道，采用高效液相色譜法（HPLC）對黃連上清片中大黃素、大黃酚及連翹苷等有效成分進行含量測定的研究，本研究則對《中國藥典》中未進行檢查的黃芩苷及白芷藥材中香豆素類代表成分歐前胡素的含量測定方法進行了研究，通過對7批不同生產廠家的黃連上清片中黃芩苷及歐前胡素的含量測定，比較其質量，為進一步提高黃連上清片的質量標準提供參考依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1實驗儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），XS205DU型電子天平（METTLER-TOLEDO）。

1.2試劑與樣品

黃芩苷（批號：110715-201117），歐前胡素（批號：110827-201109），乙腈（色譜純，J.T.BAKER）。超純水為Molecular純水機制備。黃連上清片（7批均采購于藥品經(jīng)營企業(yè)）。

2　方法與結果

2.1色譜分析條件

黃芩苷及歐前胡素檢測條件：色譜柱為Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水，流動相梯度見表1；檢測器：waters 2998 PDA檢測器；檢測波長：300 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃。

2.2對照品及供試品溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取黃芩苷和歐前胡素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含黃芩苷83 μg，歐前胡素4 μg的混合溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取黃連上清片10片，除去包衣，研細，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

表1　流動相梯度

2.3陰性樣品溶液的制備

按處方制備工藝制得不含黃芩、白芷的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.4陰性試驗

取陰性對照樣品溶液、對照品溶液和供試品溶液分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果陰性樣品溶液在黃芩苷峰及歐前胡素峰位置處無相應峰出現(xiàn)，陰性對照樣品、對照品和供試品溶液色譜圖見圖1。

2.5線性范圍考察

分別精密吸取上述對照品溶液1，2，5，10，20，30，40 μL，按“2.1”色譜條件測定峰面積，以進樣量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明，黃芩苷在0.083～3.325 μg范圍內呈良好線性關系，回歸方程為：

Y=2 096 961.24 X-37 696.54（r=0.999 9）。

歐前胡素在0.004～0.160 μg范圍內呈良好線性關系，回歸方程為：

Y=2 836 551.80 X-1 759.03（r=0.999 9）。

圖1　HPLC色譜圖

2.6精密度試驗考察

取對照品溶液，分別精密吸取10 μL，連續(xù)進樣6次，按上述色譜條件進樣分析，測定色譜峰面積，黃芩苷的RSD為1.43%，歐前胡素的RSD為1.32%，測定結果表明精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗考察

取供試品溶液，分別在0，2，5，12，24 h，分別進樣分析，測定色譜峰面積，求得黃芩苷的RSD為1.51%，歐前胡素的RSD為1.15%。試驗結果表明供試品溶液在制備24小時內，待測組分化學性質穩(wěn)定。

2.8重復性試驗考察

取同一樣品按“2.2.2”方法制備供試品溶液6份，按上述色譜條件分別測定黃芩苷和歐前胡素的含量，測得黃芩苷的RSD為1.23%，歐前胡素的RSD為0.61%，表明重復性較好。

2.9加樣回收率試驗考察

取樣品6份，每份30片，除去包衣，研細，精密稱取0.45 g，分別精密加入對照品混合溶液（重新配制）1.0 mL（黃芩苷濃度為0.415 6 mg/mL，歐前胡素濃度為0.026 7 mg/mL），精密加入甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，濾過，進樣，計算加樣回收率。結果見表2。

2.10樣品含量測定

取7批不同廠家的黃連上清片，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定樣品含量（mg/g），結果見表3。

3　討論

表2　加樣回收率測定結果

表3　樣品含量測定結果

3.1在對黃連上清片中的黃芩及白芷進行高效液相色譜分析時，分別考察了甲醇、50%甲醇［5］、70%乙醇3種溶劑的提取效率及乙腈-0.05%磷酸水溶液［6］及乙腈-水兩種流動相體系，結果表明，以甲醇為提取溶劑，超聲處理30 min，可將黃連上清片中待測成分基本提取完全；以乙腈-水為流動相體系梯度洗脫得到的色譜圖基線平穩(wěn)分離效果好，檢測波長在300 nm處時色譜峰響應靈敏度高，因此可在同一波長處同時測定黃芩苷及歐前胡素的含量。藥典中要求進行含量測定的鹽酸小檗堿為生物堿類有效成分，本方法采用乙腈-水為流動相體系，無法同時檢出。

3.2通過對比可知，不同生產廠家的黃連上清片中黃芩苷及歐前胡素的含量波動較大。樣7中黃芩苷的含量為樣3的3.5倍，樣1中歐前胡素的含量與樣5相差十幾倍，而樣6中未檢出歐前胡素，由此可見，不同廠家的生產工藝、藥材投料量及藥材質量存在較大差異，而藥典中僅以鹽酸小檗堿的含量作為檢驗標準，不利于黃連上清片的質量控制。

3.3本方法操作簡便、快捷，樣品用量少，回收率和線性相關系數(shù)良好，精密度和重復性好，可作為黃連上清片中黃芩苷和歐前胡素含量的質量控制方法。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1067-1068.

［2］唐顯虹.不同廠家黃連上清片特征指紋圖譜比較［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（24）：67-71.

［3］李靜，蔡旭升.高效液相色譜法在黃連上清片中有效成分的含量測定［J］.中國中醫(yī)藥資訊，2011，3（17）：55-56.

［4］張峰，梁艷.高效液相色譜法測定黃連上清片中連翹苷含量［J］.中國藥業(yè)，2011，20（22）：44-45.

［5］劉永路，容淑盈.高效液相色譜法測定黃連上清片中黃芩苷含量［J］.中國藥業(yè)，2007，16（12）：43-44.

［6］戴紅鋒，尹慶鋒，謝彤.UPLC法測定復方虎黃噴劑中虎杖苷、黃芩苷、歐前胡素［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，2014，30（1）：88-89.

［7］王連國，王欣，孟憲杰，等.高效液相色譜法測定白芷中歐前胡素和異歐前胡素含量［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2011，20（22）：2816-2817.

Study on Content Determination of Baicalin and Imperatorin in Huanglianshangqing Tablets

Zhang Xiaobo，Cao Hengtao，Wang Xiaoyan（Institute for Food and Drug Control of Anyang City，Henan Anyang 455000，China）

Objective:To establish a method for the determination of baicalin and imperatorin in huanglianshangqing tablets by HPLC.Methods：Using high performance liquid chromatography（HPLC）and a Waters Symmetry C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile-water in gradient elution，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was at 300 nm，the column temperature was at 25℃and detected by PDA.Results：A good linear relationship of baicalin was obtained within the range of 0.083～3.325 μg（r=0.999 9）and the average recovery was 103.54%（RSD=1.24%），and a good linear relationship of imperatorin was found within the range of 0.004～0.160 μg（r=0.999 9）and the average recovery was 102.69%（RSD= 0.95%）.Conclusion:The method was convenient，accurate and reliable，and can be used for the simultaneous determination at the same wavelength of the contents of baicalin and imperatorin in huanglianshangqing tablets.

HPLC；Huanglianshangqing Tablets；Baicalin；Imperatorin

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.09.007

2015-04-20）

張小博，女，主管藥師。研究方向：藥品質量。通訊作者E-mail：ayzhbo@163.com