酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用

王 倩， 白函瑜， 毛學(xué)英

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用

王 倩， 白函瑜， 毛學(xué)英*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

為探討酪蛋白糖巨肽（GMP）酶解物的二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制作用，選擇木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解GMP獲得糖巨肽酶解物，選擇甘氨酰脯氨酸對(duì)硝基苯胺為底物的發(fā)色底物法檢測(cè)DPP-4活性。結(jié)果表明，GMP酶解物的DPP-4抑制效果優(yōu)于GMP本身，并且隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)酶解物DPP-4抑制作用逐漸增加，其中GMP木瓜蛋白酶解物對(duì)DPP-4抑制效果最好，GMP木瓜蛋白酶酶解物作為DPP-4抑制劑具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

糖巨肽；酶解；DPP-4抑制劑

編者按：長(zhǎng)期航天飛行對(duì)航天員身體的影響涉及多個(gè)方面，如腸胃功能減弱、心血管系統(tǒng)紊亂，甚至糖代謝失常等。研究表明，失重環(huán)境下人體對(duì)鉀、鋅的需求增加，而對(duì)鈉、鐵的需求降低，胰島素水平呈下降趨勢(shì)。飲食調(diào)節(jié)是保障航天員身體健康的有效途徑，本期的兩篇文章《酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用》和《電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測(cè)定黑茶元素溶出特性》分別從食源性功能多肽和日常茶飲的角度為科學(xué)合理配置航天食譜提供了有益參考。

（主持人：陳斌研究員）

糖尿病是一種受遺傳和環(huán)境因素影響的多因素內(nèi)分泌疾病，主要表現(xiàn)為高血糖、糖尿和負(fù)氮平衡等代謝紊亂癥狀，還會(huì)引起足部壞疽、尿毒癥、腦血管病變、心肌梗死等并發(fā)癥，是危害人類(lèi)健康的一種嚴(yán)重代謝性疾?。?-2］。糖尿病主要包括1型糖尿病、2型糖尿病兩種類(lèi)型，其中2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）占全部糖尿病患者的90%以上［3-4］。目前對(duì)糖尿病的治療主要以西藥為主，但長(zhǎng)期服用副作用大。

天然來(lái)源的二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑具有安全性良好、無(wú)不良反應(yīng)、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)［5］，DPP-4抑制劑逐漸成為干預(yù)2型糖尿病的新靶點(diǎn)。它通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合DPP-4的活性位點(diǎn)改變DPP-4構(gòu)象，降低DPP-4的催化活性，抑制DPP-4對(duì)腸促胰島素的降解，增加血液中腸促胰島素濃度，使腸促胰島素更好地發(fā)揮刺激胰島素釋放的作用，增強(qiáng)胰島細(xì)胞對(duì)血糖的敏感性，強(qiáng)化組織細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取利用，促進(jìn)β細(xì)胞增生等作用［6］。

乳蛋白是乳中的主要營(yíng)養(yǎng)成分，作為一種全價(jià)蛋白質(zhì)不僅能夠提供優(yōu)質(zhì)氨基酸，經(jīng)過(guò)適當(dāng)可控酶解后還能釋放出生物活性肽，這些活性肽具有調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗菌、清除自由基和促進(jìn)礦物元素吸收等多種生物學(xué)功能［7-8］。乳蛋白肽還具有DPP-4抑制作用，有研究已經(jīng)從β-乳球蛋白酶解物中分離出了具有抑制DPP-4活性的肽Ile-Pro-Ala，Val-Ala-Gly-Thr-Trp-Tyr［9-10］。酪蛋白和乳清分離蛋白分別經(jīng)堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶酶解所得酶解物均具有DPP-4抑制作用［11-13］，但目前尚未見(jiàn)酪蛋白糖巨肽（GMP）及其酶解物DPP-4抑制作用的相關(guān)報(bào)道。

酪蛋白糖巨肽（glycomacropeptide，GMP）是κ-酪蛋白在胃蛋白酶作用下苯丙氨酸-蛋氨酸之間的肽鍵斷裂形成的含有64個(gè)氨基酸的糖基磷酸肽［14］。研究發(fā)現(xiàn)，GMP具有降低人體總膽固醇、甘油三酯、血糖、胰島素水平的能力［15］。在太空失重環(huán)境中，機(jī)體糖代謝會(huì)發(fā)生變化，如胰島細(xì)胞胰島素分泌量下降以及細(xì)胞糖消耗減少等［16-17］?；谌樵椿钚噪呢S富的生物學(xué)活性功能以及GMP血糖調(diào)節(jié)能力，本研究旨在探討GMP及其酶解物對(duì)DPP-4酶的抑制作用，為GMP的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)，也為GMP在太空失重環(huán)境中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶、DPP-4、Gly-Pro-PNA、Ile-Pro-Ile（又稱(chēng)為Diprotin A）、TNBS，Sigma公司；堿性蛋白酶，丹麥諾維信公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，美國(guó)Amresco公司；酪蛋白糖巨肽，丹麥Arla公司；Tris粉末、NaOH（分析純）、HCl（分析純），北京化工廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

iMarkTMMicroplate Reader型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-RAD公司；L20型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興有限公司；DK-8B型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；FE20型分析天平，北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GMP酶解物的制備［18］

利用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶分別酶解GMP，酶解條件如表1。按底物質(zhì)量濃度50 g/L稱(chēng)取酪蛋白糖巨肽于室溫下充分溶解2 h，并將恒溫水浴鍋溫度調(diào)至各酶的最適溫度，加堿或酸調(diào)節(jié)達(dá)到酶最適pH值，再按酶與底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的比例把酶加入在恒溫水浴鍋中酶解。酶解過(guò)程中不斷加入1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl來(lái)維持酶最適pH值，分別于酶解0.25，0.50，0.75，1，2，3，4，5 h處取樣，最后在85℃滅酶15 min，凍干待用。

表1 4種蛋白酶酶解條件Tab.1 Hydrolysis conditions of different enzymes

1.3.2 DPP-4活性測(cè)定［19］

檢測(cè)DPP-4活性采用發(fā)色底物法，底物選擇甘氨酰脯氨酸對(duì)硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）。各物質(zhì)添加量如表2。按照樣品或Diprotin A、DPP-4、Tris-HCl緩沖液、Gly-Pro-PNA的順序依次加入96孔板，在37℃、pH值為8.0條件下反應(yīng)30 min后于405 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。

DPP-4抑制率=［1-（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD陰性對(duì)照組-OD空白組）］×100%。

表2 DPP-4活性測(cè)定體系各組分加入量Tab.2 Adding amount of reactants for DPP-4 inhibition assayμL

1.4 水解度測(cè)定

水解度（DH）測(cè)定采用三硝基苯磺酸（TNBS）法，樣品用1%十二烷基硫酸鈉稀釋后取0.125 mL先后與1 mL磷酸緩沖液、1 mL 0.1%TNBS溶液混勻在50℃條件下水浴避光反應(yīng)60 min，用2 mL 0.1 mol/L HCl終止反應(yīng)后室溫冷卻并于420 nm下測(cè)吸光值，見(jiàn)式（1）。式（1）中：h表示酶解物中每克被裂解的肽鍵的物質(zhì)的量，（meq/g protein）；htot表示每克原料蛋白質(zhì)的總肽鍵的物質(zhì)的量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±SD形式表示，采用SPSS13.0軟件中One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GMP動(dòng)物性蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度

GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物對(duì)DPP-4的抑制作用及其水解度變化如圖1。整體來(lái)看，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，GMP酶解物DPP-4抑制率和水解度均逐漸增加，水解度在第5小時(shí)達(dá)到最大值，GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物水解度最大值分別為4.09%±0.22%，4.71%±0.29%。GMP經(jīng)蛋白酶酶解0.25 h所得酶解物DPP-4抑制率與GMP無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；GMP經(jīng)胰蛋白酶酶解5 h時(shí)，胰蛋白酶酶解物DPP-4抑制率達(dá)到最大值21.86% ±0.19%；GMP經(jīng)胃蛋白酶酶解3 h所得產(chǎn)物的DPP-4抑制率最高，為32.50%±0.38%（樣品終質(zhì)量濃度為1.0 g/L）。

圖1 GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物DPP-4抑制率及其水解度Fig.1 DPP-4 inhibition rate and DH of GMP hydrolysates obtained by pepsin and trypsin

2.2 GMP其他來(lái)源蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度

GMP木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度如圖2。在蛋白酶作用下，GMP酶解物的DH隨酶解時(shí)間的增加逐漸增大，酶解時(shí)間為5 h時(shí)DH達(dá)到最大，木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶酶解物DH最大值分別為11.33%±0.18%，9.31% ±0.37%。GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4抑制作用顯著優(yōu)于GMP本身（P＜0.05），酶解4 h所得酶解物的DPP-4抑制率最高為69.30%±1.58%，但與第1小時(shí)酶解物無(wú)顯著差異（P＞0.05）；GMP堿性蛋白酶DPP-4抑制率酶解時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈上升趨勢(shì)，第4小時(shí)酶解物的DPP-4抑制率最高為29.10%±0.97%，酶解時(shí)間為5 h時(shí)，酶解物的DPP-4抑制率下降，低于第4小時(shí)酶解物的DPP-4抑制率。

圖2 GMP木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶酶解物DPP-4抑制率及其水解度Fig.2 DPP-4 inhibition rate and DH of GMP hydrolysates obtained by papain andalkaline

2.3 GMP木瓜蛋白酶酶解物對(duì)DPP-4抑制作用

的劑量效應(yīng)

由2.2結(jié)果可知，GMP經(jīng)木瓜蛋白酶酶解第1小時(shí)酶解物的DPP-4抑制效果最好，對(duì)該酶解物進(jìn)行DPP-4抑制效果的劑量效應(yīng)評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖3。DPP-4抑制率隨酶解物濃度增加呈劑量依賴(lài)性增加，最大值為85.69%±0.17%，高于陽(yáng)性對(duì)照Diprotin A（0.01 g/L）的DPP-4抑制率。GMP木瓜蛋白酶第1小時(shí)酶解物IC50為497.0 mg/L，Diprotin AIC50為19.71 mg/L。

圖3 不同濃度GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4抑制率Fig.3 DPP-4 inhibition rate of different concentrations of GMP hydrolysate obtained with papain

3 結(jié) 論

DPP-4抑制劑由于具有特殊的氨基酸組成、序列或者特殊的結(jié)構(gòu)從而可以與DPP-4酶活性位點(diǎn)結(jié)合［20-21］，進(jìn)而可以抑制DPP-4對(duì)內(nèi)源性GIP和GLP-1的降解，延長(zhǎng)和提高腸促胰島素的活性，促進(jìn)胰島素分泌、降低血糖。多肽類(lèi)物質(zhì)的N端第二位上有脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）時(shí)，該多肽就會(huì)成為DPP-4發(fā)揮活性的主要底物，如乳源活性肽Val-Ala、Ile-Pro-Ala-Val-Phe、Ile-Pro-Ala-Val-Phe-Lys均具有DPP-4抑制作用［19，22］。

本研究發(fā)現(xiàn)，GMP酶解物的DPP-4抑制作用優(yōu)于GMP本身，主要由于蛋白酶的作用使含有64個(gè)氨基酸的GMP肽鍵斷裂產(chǎn)生了具有DPP-4抑制作用的肽段。其中，GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4的抑制作用較好，這與木瓜蛋白酶特殊的作用位點(diǎn)有關(guān)。木瓜蛋白酶（3.4.22.2）可裂解堿性氨基酸（Arg、Lys、His），Leu或Gly的肽鍵，經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后能產(chǎn)生N端第二位上有脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）的多肽。

GMP經(jīng)木瓜蛋白酶酶解1 h獲得的酶解產(chǎn)物對(duì)DPP-4抑制效果較好，作為一種乳源活性肽，其食用安全性高，作為DPP-4抑制劑用于糖尿病干預(yù)具有潛在應(yīng)用價(jià)值。GMP酶解產(chǎn)物活性肽段的分離純化和氨基酸序列鑒定，及其抑制DPP-4活性的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

［1］Ginsberg H N.Insulin resistance and cardiovascular disease［J］.Journal of Clinical Iinvestigation，2000，106（4），453-458.

［2］Savage D B，Petersen K F，Shulman G I.Mechanisms of insulin resistance in humans and possible links with inflammation［J］.Hypertension，2005，45（5），828-833.

［3］Zimmet P，Alberti K G，Shaw J.Global and societal implications of the diabetes epidemic［J］.Nature，2001，414（6865）：782-787.

［4］Zimmet P Z.Diabetes epidemiology as a tool to trigger diabetes research and care［J］.Diabetologia，1999，42（5）：499-518.

［5］Garber A J，Abrahamson M J，Barzilayet J I，et al. AACE comprehensivediabetesmanagementalgorithm 2013［J］.Endocrine Practice，2013，19（2）：327-336.

［6］Savkur R S，Miller A R.Investigational PPAR-gamma agonists for the treatment of Type 2 diabetes［J］.Expert Opinion on Investigational Drugs，2006，15（7）：763-778.

［7］Meisel H.Biochemical properties of regulatory peptides derived from milk proteins［J］.Biopolymers，1997，43（2）：119-128

［8］Meisel H.Multifunctional peptides encrypted in milk proteins［J］.Biofactors，2004，21（1-4）：55-61.

［9］Uchida M，Ohshiba Y，Mogami O.Novel dipeptidylpeptidase-4-inhibiting peptide derived from β-Lactoglobulin［J］.Journal of Pharmacological Sciences，2011，117（1）：63-66.

［10］Tulipano G，Sibilia V，Caroli A M，et al.Whey proteins as source of dipeptidyldipeptidase IV（dipeptidyl peptidase-4）inhibitors［J］.Peptides，2011，32（4）：835-838.

［11］Lacroix I M，Li-Chan E C.Dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity of dairy protein hydrolysates［J］.International Dairy Journal，2012，25（2）：97-102.

［12］Lacroix I M，Li-Chan E C.Evaluation of the potential of dietary proteins as precursors of dipeptidyl peptidase（DPP）-IV inhibitors by an in silicoapproach［J］.Journal of Functional Foods，2012，4（2）：403-422.

［13］Power O，Nongonierma A B，Jakeman P，et al.Food protein hydrolysates as a source of dipeptidyl peptidase IV inhibitory peptides for the management of type 2 diabetes［J］.Nutrition，2013，14：15.

［14］章芳.奶中的生理活性肽——CGMP的研究開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2000，21：27-28.

［15］Keogh J B，Clifton P.The effect of meal replacements high in glycomacropeptide on weight loss and markers of cardiovascular disease risk［J］.American Journal of Clinical Nutrition，2008，87（6）：1602-1605.

［16］陳英，李巖，楊春敏，等.模擬失重對(duì)生物機(jī)能的影響研究進(jìn)展［J］.空軍總醫(yī)院學(xué)報(bào)，2007，23：40-45.

［17］Tobin B W，Leeper-Woodford S K，Hashemi B B，et al.Altered TNF-alpha，glucose，insulin，and amino acids in islets of Langerhans cultured in a microgravity model system［J］.American Journal of Physiologyendocrinology and Metabolism，2001，280：92-102.

［18］Cheng Xue，Tang Xi，Wang Qian，et al.Antibacterial effect and hydrophobicity of yak κ-casein hydrolysate and its fractions［J］.International Dairy Journal，2013，31：111-116.

［19］Nongonierma A B，F(xiàn)itzgerald R J.Dipeptidyl peptidase IV inhibitory and antioxidative properties of milk proteinderived dipeptides and hydrolysates［J］.Peptides，2013，39：157-163.

［20］Lambeir A M，Durinx C，Scharpe S，et al.Dipeptidylpeptidase IV from bench to bedside：an update on structural properties，functions，and clinical aspects of the enzyme DPP IV［J］.Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences，2003，40（3）：209-294.

［21］Havale S H，Pal M.Medicinal chemistry approaches to the inhibition of dipeptidyl peptidase-4 for the treatment of type 2 diabetes［J］.Bioorganic&Medicinal Chemistry，2009，17（5）：1783-1802.

［22］Silveira S T，Martínez-Maqueda D，Recio I，et al. Dipeptidyl peptidase-IV inhibitory peptides generated by tryptic hydrolysis of a whey protein concentrate rich in β-lactoglobulin［J］.Food Chemistry，2013，141：1072-1077.

Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitory Activity of Casein Glycomacropeptide Hydrolysates

WANG Qian， BAI Hanyu， MAO Xueying*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The aim of the present study was to investigate the dipeptidyl peptidase-4（DPP-4）inhibitory activity of glycomacropeptide（GMP）hydrolysates obtained with papain，alkaline，trypsin and protease. The DPP-4 activity was assayed by the chromogenic substrate with Gly-Pro-PNA as a substrate in vivo. GMP hydrolysates showed a higher DPP-4 inhibitory rate than native GMP.The DPP-4 inhibitory activity of GMP hydrolysates increased during the hydrolysisperiods.GMP hydrolysates obtained by papain possessed the greatest DPP-4 inhibitory activity.The papain-treated GMP may have the potential application as DPP-4 inhibitor.

glycomacropeptide；hydrolysis；dipeptidyl peptidase-4 inhibitor

葉紅波）

TS252.1；Q816

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.02.004

2095-6002（2015）02-0019-05

王倩，白函瑜，毛學(xué)英.酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（2）：19-23.

WANG Qian，BAI Hanyu，MAO Xueying.Dipeptidyl peptidase-4 inhibitory activity of casein glycomacropeptide hydrolysates［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（2）：19-23.

2015-02-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31371753）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（201410019040）。

王 倩，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿樵椿钚噪模?/p>

*毛學(xué)英，女，教授，博士，主要從事功能乳品方面的研究。

。