地塞米松誘導小鼠脾淋巴細胞凋亡實驗研究*

伊 萍，龔惠紅，明 瑩，胡 鑫＊＊

(1.中南民族大學藥學院，湖北武漢430074;2.湖北科技學院生物醫(yī)學工程學院;3.咸寧市溫泉紅旗路中學)

糖皮質激素可影響小鼠脾淋巴細胞承受凋亡的能力，當機體處于應激狀態(tài)時能調節(jié)能量反應，具有很強的抗炎、抗變態(tài)反應作用，在臨床上主要用于抗生素治療無效的炎癥、較強變態(tài)反應以及抗內毒素性休克等疾病，還用于治療惡性淋巴瘤以及許多免疫系統(tǒng)疾病的常見藥物。但其在長期使用中會產(chǎn)生某些副作用，主要表現(xiàn)為抑制免疫系統(tǒng)功能、減輕免疫反應，其主要機制可能是引起免疫細胞凋亡［1～5］。迄今為止，已經(jīng)有相當多關于細胞凋亡及其相關研究的報道，其檢測方法也較多，如何建立一種快速、可靠、準確的誘導細胞凋亡模型是目前許多相關研究需要解決的問題。我們主要探討通過地塞米松建立一種體外誘導淋巴細胞凋亡模型［6］，然后用流式細胞術、DNA梯度法以及蛋白質免疫印跡等實驗室常規(guī)技術手段鑒定和檢測細胞是否發(fā)生凋亡及其凋亡后生物化學變化特征，為以后研究細胞凋亡及淋巴細胞免疫抑制機制等提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡昆明種小白鼠20只，體質量16～20g，由湖北省實驗動物研究中心提供，每次實驗取4只小鼠，重復實驗5次。

1.2 主要試劑 地塞米松磷酸鈉(湖北襄樊恒生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品);Annexin V－FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天有限公司);DNA提取試劑盒(天根有限公司);RMPI1640細胞培養(yǎng)基(Hy－Clone);小牛血清(HyClone);蛋白裂解液(自配);PBS(自配)。

1.3 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(3111型，Thermo);倒置顯微鏡(上海美譜達儀器有限公司);細胞培養(yǎng)瓶(NEST);流式細胞儀(Gallios型，貝克曼庫爾特);電泳儀(北京東方儀器廠);蛋白質印跡設備(DYY－6C，北京市六一儀器廠)。

1.4 脾淋巴細胞的制備和培養(yǎng) 取4只6～8周的昆明種小鼠，在無菌環(huán)境中取出小鼠的脾臟，用玻璃膜片將脾臟研磨成細胞懸液，用紗布過濾后，加入紅細胞裂解液裂解數(shù)分鐘，離心之后用PBS洗滌3次，然后用含有10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液將細胞稀釋成6×106/ml，以便后面使用。

1.5 脾淋巴細胞在地塞米松誘導下的最適濃度向NEST塑料瓶中加入濃度6×106的細胞，分別設置空白對照正常組和地塞米松作用組，地塞米松的濃度依次為 10－8，10－6，10－4，10－2mol/L，用10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液補至適當體積。同時取小鼠的脾淋巴細胞做為新鮮對照組。把裝好小鼠脾淋巴細胞的培養(yǎng)瓶放在5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)17h。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 分別收集上述6組細胞，要設置兩組單陽組的對照，按照Annexin V－FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作，檢測細胞的凋亡率。

1.7 DNA凝膠電泳法檢測淋巴細胞凋亡 分別收集上述6組細胞，按DNA提取試劑盒操作說明提取 DNA，進行 DNA電泳，觀察凋亡細胞DNA ladder。

1.8 用蛋白質印跡檢測小鼠脾淋巴細胞中凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl－2的凋亡 先提取6組細胞中的蛋白質，然后通過電泳、轉膜、封閉、孵育抗體、顯影5個步驟完成Bax和Bcl－2蛋白質表達。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測結果 如圖1所示，新鮮分離小鼠脾淋巴細胞幾乎未發(fā)生凋亡;正常組脾淋巴細胞可發(fā)生自然凋亡［凋亡率為(31.4±0.4)%］;不同濃度地塞米松處理后脾淋巴細胞出現(xiàn)不同程度凋亡，其中濃度為 10－2mol/L、10－4mol/L地塞米松處理組誘導凋亡較高，其淋巴細胞凋亡率分別為(65.7±0.8)%(P＜0.05)、(76.6±1.2)%(P ＜0.01);濃度為 10－6mol/L、10－8mol/L處理組隨濃度降低誘導凋亡逐漸減弱，與正常組接近(P＞0.05)。

圖1 流式細胞術檢測不同濃度地塞米松誘導小鼠脾臟淋巴細胞凋亡

2.2 DNA凝膠電泳法檢測淋巴細胞凋亡 如圖2所示，10－2mol/L地塞米松濃度組淋巴細胞出現(xiàn)的凋亡程度最明顯，其余各地塞米松濃度組10－4、10－6mol/L凋亡程度依次下降，地塞米松濃度10－8mol/L組凋亡程度較小，呈濃度依賴性，而新鮮分離淋巴細胞幾乎未見凋亡。

2.3 蛋白質免疫印跡檢測小鼠脾淋巴細胞中凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl－2 為進一步探討地塞米松誘導小鼠脾淋巴細胞凋亡分子機制，我們用蛋白質免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白表達，以β－actin為內參。如圖3所示，地塞米松濃度為10－2mol/L時，凋亡蛋白 Bax表達最高，濃度10－4、10－6、10－8mol/L 地塞米松處理組 Bax 表達水平幾乎依次遞減，新鮮分離淋巴細胞組未見Bax表達。而從抗凋亡蛋白Bcl－2表達情況來看，地塞米松濃度為10－2mol/L處理組淋巴細胞幾乎未見表達，濃度 10－4、10－6、10－8mol/L 地塞米松處理組和新鮮分離組Bcl－2表達逐漸升高。上述結果提示，濃度為10－2mol/L組淋巴細胞經(jīng)地塞米松處理后發(fā)生凋亡的原因可能至少部分與其誘導凋亡蛋白Bax表達升高、抗凋亡蛋白Bcl－2表達下降甚至不表達緊密相關，而其他濃度處理組凋亡相關蛋白表達水平變化同其細胞凋亡遞減趨勢一致。

圖2 DNA凝膠電泳檢測不同濃度地塞米松誘導小鼠脾臟淋巴細胞凋亡

圖3 Western blotting檢測不同濃度地塞米松誘導小鼠脾臟淋巴細胞凋亡相關基因表達

3 討論

細胞最終結局主要包含兩種可能:一是細胞凋亡，另一個是細胞壞死。從生理學意義上講，細胞壞死是一種機體內非正?，F(xiàn)象，在缺氧、補體攻擊、代謝中毒等一系列物理或化學損害因子的作用下，導致細胞的死亡，屬于“他殺”行為。而細胞凋亡則不同，它是細胞為維持機體內環(huán)境穩(wěn)定而進行的一種程序性死亡，屬于“自殺”行為［7］，類似秋季樹葉自然凋落，而凋亡細胞不會影響機體正常運轉，也幾乎不會產(chǎn)生任何炎癥反應，因為凋亡細胞會被巨噬細胞或者其他免疫細胞清除掉。細胞凋亡具有重大生物學理論和實際意義，多種相關基因如抗凋亡和(或)抑制凋亡基因嚴格控制其發(fā)生發(fā)展，多種疾病的發(fā)生與細胞凋亡有著密切聯(lián)系。盡管目前細胞凋亡過程在生命科學研究中已有了較大突破，但迄今為止，細胞凋亡的機制尚未完全闡明。

本文從凋亡細胞形態(tài)特征等角度證明地塞米松能夠誘導小鼠脾臟淋巴細胞凋亡，用流式細胞術和蛋白質免疫印跡等方法進行了定性和定量分析，并且提取凋亡細胞DNA進行梯度分析加以鑒定是否發(fā)生凋亡，該方法被認為是檢測細胞凋亡的金標準。本研究還從凋亡蛋白水平表達變化角度證實地塞米松誘導脾淋巴細胞凋亡機制可能是通過誘導凋亡蛋白Bax表達提高和抑制抗凋亡蛋白Bcl－2的表達［8］。綜上所述，本實驗采用流式細胞術、DNA ladder以及蛋白質印跡法篩選地塞米松誘導小鼠脾淋巴細胞凋亡的最適濃度，結果證實地塞米松濃度為10－2mol/L能夠達到誘導小鼠脾臟淋巴細胞最佳效果，為建立準確、可靠的細胞凋亡模型及淋巴細胞凋亡相關免疫抑制的研究提供實驗依據(jù)。

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［5］劉金保，王隨照，趙青.氨茶堿及地塞米松對小鼠淋巴細胞凋亡的調節(jié)作用［J］.中國病理生理雜志，1999，15(7):609

［6］夏洪生，張玲梅.地塞米松誘導脾淋巴細胞凋亡模型的制備［J］.深圳中西醫(yī)結合雜志，2004，14(5):270

［7］楊連君，曹雪濤.bcl－2，bax 與腫瘤細胞的凋亡［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2003，10(3):232

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