針刺太陽(yáng)、風(fēng)池穴對(duì)腦缺血再灌注家兔熱休克蛋白70及細(xì)胞凋亡的影響

趙軍,蘭惠羽

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

腦缺血再灌注損傷是在缺血性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的,病理生理過程復(fù)雜,涉及到氧自由基增多、鈣超載、微血管損傷和細(xì)胞功能代謝障礙等多個(gè)環(huán)節(jié)[1-3]。因此,闡明腦缺血再灌注損傷的機(jī)制和尋找有效的治療靶點(diǎn)已成為目前亟待解決的重要課題。近年來實(shí)驗(yàn)研究表明針刺對(duì)腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用,日益受到關(guān)注[4-6]。

太陽(yáng)穴和風(fēng)池穴是臨床上針刺治療缺血性腦卒中主要的穴位,合稱為“頭四關(guān)穴”。本研究通過電針“頭四關(guān)穴”對(duì)缺血再灌注家兔腦組織中HSP70蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響,探討其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

54只健康雄性新西蘭白兔,清潔級(jí),4～5月齡,體重為2.5～3.0 kg,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和針刺組,每組 18只。每組根據(jù)再灌注1、3、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn),隨機(jī)各取6只。所有動(dòng)物自由進(jìn)食和水,12 h晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

HSP70免疫組化一抗,購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;細(xì)胞凋亡(Tunnel法)檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自美國(guó)Roche公司;PV二步法試劑和DAB顯色劑,購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。其他為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器為德國(guó)菜卡2135型組織切片機(jī);美國(guó)motic公司 moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng);Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng);上海安亭臺(tái)式離心機(jī)。

1.3 動(dòng)物模型的制備

[7-9],采用線栓法建立家兔局灶腦缺血再灌注損傷模型。先將直徑為0.285 mm的3號(hào)尼龍線剪成10 cm長(zhǎng),在距一端0.5～1.0 cm處均勻涂上硅橡膠,控制線栓頭端直徑在0.51～0.55 mm,并在距離線栓頭端6.0 cm處做標(biāo)記。

家兔術(shù)前禁食 12 h,稱重后自耳緣靜脈緩慢注射20 g/L的烏拉坦(5 mL/kg)麻醉,常規(guī)消毒后,頸部正中切口,暴露出左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)及分叉,并分離出近段頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。暫時(shí)夾閉 CCA和ICA,結(jié)扎ECA并于近端將其剪斷,將線栓經(jīng)ECA殘端向ICA內(nèi)緩緩送入,松開ICA動(dòng)脈夾。當(dāng)線栓進(jìn)入大腦中動(dòng)脈(MCA)起始部遇阻力時(shí)停止,記錄造成大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)時(shí)間。記算線栓插入深度,并將 ECA殘端及線栓一同結(jié)扎固定。再灌注時(shí),用鑷子夾住線栓外露殘端輕輕向外拉出,遇到明顯阻力感停止?fàn)坷?記錄時(shí)間作為再灌注開始時(shí)間。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈,徹底止血后縫合切口。

假手術(shù)組家免除不栓塞大腦中動(dòng)脈外,其余處理同模型組和針刺組。參照文獻(xiàn)[10-11]中的評(píng)分法,0分為無神經(jīng)缺損癥狀;1分為右前肢屈曲;2分為向右旋轉(zhuǎn);3分為向右傾倒;4分為不能行走或昏迷。其中1～4分為有效模型,納入實(shí)驗(yàn)分組。

1.4 干預(yù)方法

參考實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[12],選取家兔“頭四關(guān)穴”,即雙側(cè)太陽(yáng)穴和風(fēng)池穴。用長(zhǎng)40 mm毫針,太陽(yáng)穴水平向后斜刺5 mm,風(fēng)池穴向后下方斜刺5 mm。針刺后,雙側(cè)太陽(yáng)及風(fēng)池穴連接電針儀,頻率為 2 Hz,采用連續(xù)波,刺激強(qiáng)度以針柄震顫且家兔安靜不掙扎為度,治療時(shí)間為30 min。針刺組在造模成功后6 h開始首次針刺,各時(shí)間點(diǎn)療程分別為1 d、3 d和7 d。每日1次。假手術(shù)組和模型組家兔除不針刺外,每日同樣抓取。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

各組家免于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)烏拉坦( 5 mL/kg)麻醉后,心臟取血分離血清。然后用4%的多聚甲醛PBS液進(jìn)行心臟灌注固定后取腦,自視交叉向前后各取厚 2.5 mm的冠狀腦片,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片備用。

HE染色觀察各組家兔腦組織缺血區(qū)病理變化;免疫組化PV二步法檢測(cè)缺血區(qū)周圍腦組織HSP70蛋白表達(dá),Tunnel法檢測(cè)缺血區(qū)周圍腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況,按說明書進(jìn)行操作。免疫組化和細(xì)胞凋亡分析采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng),每張切片于梗死灶周圍選擇10個(gè)表達(dá)最強(qiáng)的高倍視野(400倍)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析,兩兩比較用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組腦組織均未見明顯病理改變。模型組家兔左側(cè)大腦皮質(zhì)及基底核區(qū)可見明顯的梗死灶,缺血中心區(qū)神經(jīng)纖維呈網(wǎng)格狀改變,神經(jīng)元數(shù)量明顯減少;缺血區(qū)周圍腦組織水腫,炎細(xì)胞增多;神經(jīng)元變性壞死,細(xì)胞核固縮或溶解,胞漿呈嗜酸性變;膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多;上述病理改變以3 d時(shí)最為明顯。針刺組各時(shí)間點(diǎn)與模型組各時(shí)間點(diǎn)相比,梗死灶均有不同程度減小,梗死灶內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯增多,腦水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕;缺血周圍神經(jīng)元形態(tài)均有不同程度的改善。

2.2 腦組織HSP70表達(dá)

HSP70蛋白主要表達(dá)在神經(jīng)元胞質(zhì)中,陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)淡黃色、黃色或棕黃色。假手術(shù)組HSP70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較少,顏色較淡。模型組各時(shí)間點(diǎn)HSP70蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多,且顏色較深,與假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。針刺組各時(shí)間點(diǎn) HSP70蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多,且顏色較深,與假手術(shù)組和模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 詳 見 表 1、 圖 1-3。

表1 各組腦組織HSP70蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比較(±s,個(gè))

表1 各組腦組織HSP70蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比較(±s,個(gè))

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 再灌注1 d 再灌注3 d 再灌注7 d假手術(shù)組 6 11.05±1.87 9.51±2.43 11.01±2.37模型組 6 23.83±1.721) 18.51±1.871) 15.17±1.161)針刺組 6 32.00±3.031)2) 26.84±1.171)2) 21.33±1.631)2)

圖1 假手術(shù)組HSP70組化示意圖

2.3 腦組織細(xì)胞凋亡

圖2 模型組HSP70組化示意圖

圖3 針刺組HSP70組化示意圖

TUNEL主要標(biāo)記在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核中,呈黃色或棕黃色。假手術(shù)組凋亡細(xì)胞數(shù)目較少。模型組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)目隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多,至3 d達(dá)高峰,與假手術(shù)組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。針刺組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少,優(yōu)于假手術(shù)組和模型組(均P＜0.01)。見表2、圖4-6。

表2 各組TUNEL表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 (±s,個(gè))

表2 各組TUNEL表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 (±s,個(gè))

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 再灌注1 d 再灌注3 d 再灌注7 d假手術(shù)組 6 6.00±1.41 5.33±1.21 6.67±1.21模型組 6 17.66±1.631) 29.17±2.791) 25.16±1.471)針刺組 6 12.84±1.941)2) 18.00±1.421)2) 13.00±1.521)2)

圖4 假手術(shù)組TUNEL示意圖

圖5 模型組TUNEL示意圖

圖6 針刺組TUNEL示意圖

3 討論

HSP70是熱休克蛋白家族中含量最高和最保守的一類蛋白,在細(xì)胞的信息傳遞、生長(zhǎng)和分化中起到重要的調(diào)控作用,同時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷能產(chǎn)生自我保護(hù)作用,被認(rèn)為是評(píng)價(jià)缺血性腦損傷程度的重要指標(biāo)。在機(jī)體缺血缺氧、創(chuàng)傷和氧化應(yīng)激等過程中,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)HSP70含量明顯增加,在腦缺血早期對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)的作用,而缺血后期對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)有著重要作用[13]。

臨床研究表明,針刺風(fēng)池可以改善大腦的缺血缺氧狀況,增加腦血流量,改善腦部血液循環(huán)功能,可以誘導(dǎo)腦細(xì)胞的缺血耐受機(jī)制,降低外周血管阻力,改善微循環(huán)和側(cè)支循環(huán),減輕腦組織損傷,對(duì)腦缺血性疾病具有較好的治療作用[14]。針刺“頭四關(guān)穴”可顯著改善偏頭痛患者的腦血流速度與狀態(tài),降低偏頭痛患者的血漿ET、NO水平,調(diào)節(jié)患者血漿內(nèi)5-HT含量。另有研究[15]表明,針刺“頭四關(guān)穴”對(duì)缺血性腦卒中患者有較好的治療作用,其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)血漿中ET-1的含量。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示,模型組 HSP70蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目明顯增多,針刺“頭四關(guān)穴”后各時(shí)間點(diǎn)HSP70蛋白陽(yáng)細(xì)胞數(shù)較模型組均明顯增加。病理和細(xì)胞凋亡結(jié)果表明,模型組家兔左側(cè)腦組織呈網(wǎng)格狀改變,梗死灶明顯,神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加,腦神經(jīng)細(xì)胞損傷程度較重。針刺組各時(shí)間點(diǎn)的梗死灶均有不同程度減小,神經(jīng)元數(shù)量明顯增多,神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少,腦組織缺血性損傷有一定程度改善。

我們推測(cè)腦缺血再灌注后,損傷的腦組織中產(chǎn)生大量的氧自由基和興奮性氨基酸等對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有毒性作用的物質(zhì),并且通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,加重了神經(jīng)細(xì)胞損傷程度[16]。針刺“頭四關(guān)穴”能夠改善缺血再灌注損傷后腦組織血流量和血流狀態(tài),通過提高缺血后腦組織中 HSP70蛋白表達(dá),調(diào)控氧自由基和興奮性氨基酸等產(chǎn)生的毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而抑制了神經(jīng)細(xì)胞凋亡起到神經(jīng)保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Yenari MA, Hemmen TM. Therapeutic hypothermia for brain ischemia: where have we come and where do we go?[J]. Stroke, 2010,41(10):72-74.

[2]Zhang P, Li J, Liu Y, et al. Human neural stem cell transplantation attenuates apoptosis and improves neurological functions after cerebral ischemia in rats[J]. Acta Anaesthesiol Scand, 2009, 53(9):1184-1191.

[3]Li JS, Zhang W, Kang ZM, et al. Hyperbaric oxygen preconditioning reduces ischemia-reperfusion injury by inhibition of apoptosis via mitochondrial pathway in rat brain[J]. Neuroscience, 2009, 159(4):1309-1315.

[4]徐虹,洪禮傳,黃艷秋,等.針刺對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,30(7):731-736.

[5]孫潔,閆明茹,鄭宇,等.“醒腦開竅”針刺法早期介入對(duì)腦缺血再灌注大鼠 SOD及 MDA的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(5):1397-1400.

[6]閆醒予.電針對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中自由基及熱休克蛋白70 表達(dá)的影響[J].針刺研究,2007,32(2):102-104.

[7]楊冀萍,劉懷軍,劉瑞春,等.兔局灶性腦缺血再灌注模型的建立和影像學(xué)評(píng)價(jià)[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2006,14(5):354-356.

[8]Meng X, Fisher M, Shen Q, et al. Characterizing the diffusion/perfusion mismatch in experimental focal cerebral ischemia[J]. Ann Neurol, 2004, 55(2):207-212.

[9]孔令琦,謝敬霞,韓鴻賓,等.提高線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞性兔腦缺血再灌注模型穩(wěn)定性和可重復(fù)性的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2004,20(2):209-212.

[10]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[11]程發(fā)峰,宋文婷,郭少英,等.三種神經(jīng)功能評(píng)分在鼠類局灶性腦缺血模型評(píng)價(jià)中的比較[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2011,6(4):337-341.

[12]林文注,王佩.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:280-281.

[13]劉耘,史佳巍,袁翔宇.丹星通絡(luò)湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠熱休克蛋白 70表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16(11):1463-1465.

[14]符健.針刺風(fēng)池穴為主治療椎動(dòng)脈型頸椎病臨床研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):中醫(yī)臨床版,2003,10(4):38-40.

[15]張晨茜,儲(chǔ)浩然,程紅亮,等.針刺風(fēng)池、風(fēng)府穴對(duì)缺血性腦卒中患者血漿內(nèi)皮素的影響[J].上海針灸雜志,2012,31(1):15-17.

[16]呂鵬,李玲,張麗.大鼠全腦缺血對(duì)再灌注海馬區(qū) NO含量和 Bcl-2表達(dá)的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(6):649-652.