藥用植物地黃不同部位粗提液體外抑菌活性的比較研究

李玉璽　劉俊華　馬海玲

摘 要：采用分光光度法分析比較了藥用植物地黃不同部位乙醇提取液的體外抑菌活性。以地黃花、葉、根等3個部位為試驗材料，以80%乙醇為提取溶劑，制備乙醇提取液，以常見致病菌金黃色葡萄球菌為受試菌株，測定各處理菌懸液OD值，并計算抑菌率。研究結(jié)果表明，地黃不同部位醇提液對金黃色葡萄球菌均有抑制作用，不同部位抑菌效果不同，其中以地黃葉醇提液抑菌作用最強，當濃度為80g/L時，其對金黃色葡萄球菌的抑菌率達到72.43%，MIC為5.0g/L，EC50值為10.651g/L，并且其對金黃色葡萄球菌的抑制作用與提取液質(zhì)量濃度間正相關(guān)性最為顯著。

關(guān)鍵詞：地黃；乙醇提取液；最低抑菌濃度；分光光度法

中圖分類號 S482.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）20-24-03

Abstract：To study the inhibition effects of Ethanol extracts from different part of the medicinal plant Rehmannia glutinosa on Staphylococcus aureus，ethanol-extracts from Rehmannia glutinosa were obtained with normal methods，and the liquid medium with different mass concentration of extracts from the flowers，leaves and roots of Rehmannia glutinosa were prepared，then oscillated the liquid medium of Staphylococcus aureus，which had been inoculated，and the bacteriostasis effects were tested by Spectrophotometric method. The results showed that Staphylococcus aureus was inhibited by the ethanol extracts of Rehmannia glutinosa，but different parts extracts had different inhibition effects，and the bacteriostasis activity was Leaf（72.43）>Flower（55.86%）>Root（55.42%） at the concentration of 80g/L. The MIC and EC50 of Leaf were 5.0g/L and 10.651g/L. The ethanol extracts of three parts of Rehmannia glutinosa all had inhibitory action on Staphylococcus aureus，and the ethanol extract of Rehmannia glutinosa leaves had stonger inhibitions activities than the extracts of other two parts，and the bacteriostatic effects was obviously along with the increase of concentration of ethanol extracts.

Key words：Rehmannia glutinosa；Ethanol extract；MIC；Spectrophotometric method

地黃（Rehmannia glutinosa）為玄參科（Scrophulariaceae）地黃屬（Rehmannia）多年生直立草本植物[1]，其塊根是我國著名的傳統(tǒng)常用大宗中藥材[2-4]，已有研究多集中于地黃的產(chǎn)地適宜性、人工栽培、化學成分分析和營養(yǎng)學等方面[5-7]，而關(guān)于地黃提取液抑菌性方面的研究相對缺乏。

本文以藥用植物地黃的花、葉、根部為植物材料，以80%乙醇為提取溶劑，以金黃色葡萄球菌為受試菌株，測定了地黃植物體不同部位醇提液的抑菌活性，分析比較了地黃葉、花、根等不同部位乙醇提取液對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度和抑菌中濃度，以期為開發(fā)以地黃為植物源的生物抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 （1）儀器：LMQ.R立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、LH系列層流潔凈工作臺（濟南隆宏凈化設(shè)備有限公司）、250B生化培養(yǎng)箱（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）、FA1004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、756PC紫外-可見光分光光度計。（2）材料：本研究所用地黃材料采自濱州學院校園內(nèi)；供試菌株為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus saccharolyticus），由濱州學院生命科學系微生物學實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 細菌基本培養(yǎng)基的配制 按陳金春等[8]的方法，配制營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.2。

1.2.2 菌種活化及菌液的制備 菌種活化參考趙錦慧等[9]的活化方法。無菌條件下挑取少許活化后的金黃色葡萄球菌放入無菌生理鹽水中，搖勻后制備得菌懸液，調(diào)節(jié)其菌體密度為102cfu/mL。

1.2.3 地黃乙醇提取液的制備 將采集得到的地黃除雜洗凈，自然陰干，后用剪刀分別將根、葉、花剪碎研磨成粉。分別準確稱取各部位干粉8.0g，置于帶塞廣口瓶內(nèi)，加50mL80%的乙醇，室溫條件下靜置浸提24h，然后用濾紙過濾除去殘渣，收集濾液，并定容至100mL，即得質(zhì)量濃度為80g/L的地黃各部位乙醇浸提液，于4℃冷藏避光保存，備用。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定 取冷藏備用的地黃各部位提取液母液（80g/L），依次對半稀釋得到質(zhì)量濃度為40g/L、20g/L、10g/L、5g/L、2.5g/L的醇提液，分別加入0.1mL菌懸液，同時設(shè)生長對照（菌懸液+80%乙醇+培養(yǎng)基）和清水對照（菌懸液+清水+培養(yǎng)基），培養(yǎng)12h后觀察菌株生長情況，無菌生長的最低處理濃度即為乙醇提取液對金黃色葡萄球菌的MIC。

1.2.5 提取液抑菌作用測定 采用分光光度計法測定地黃根、葉、花等3個部位醇提液對金黃色葡萄球菌的抑制作用。將分別裝有5mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基試管若干，置于超凈工作臺中紫外滅菌30min。于無菌條件下，準確量取3mL地黃各部位乙醇提取液和200μL金黃色葡萄球菌菌懸液分別加入上述試管中。另取1支裝有5mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基試管，加入3mL相應(yīng)地黃提取液、200μL LB液體培養(yǎng)基，不接任何菌株作為空白對照；同時，取1支裝有5mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基試管，加入200μL金黃色葡萄球菌菌懸液和3mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基，作為含菌對照。每一處理均為3次重復(fù)，置于搖床（37±0.5）℃下恒溫培養(yǎng)24h后，使用紫外-可見光分光光度計測定600nm處菌懸液OD值，依據(jù)下式計算抑菌率：

抑菌率（%）=（1-處理組OD值/對照組OD值）×100

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗數(shù)據(jù)在Windows XP操作系統(tǒng)下應(yīng)用Excel 2003進行匯總與整理，運用Spss19.0進行LSD多重比較和Duncan檢驗以及Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度（MIC）的測定 本研究共設(shè)從0g/L～80g/L7個乙醇提取液濃度梯度，以測定地黃3個部位乙醇提取液對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。由表1可以看出，地黃不同部位乙醇提取液對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度存在較大差異，其中以地黃葉乙醇提取液的抑菌效果最強，其MIC值為5.0g/L，即在5.0g/L質(zhì)量濃度下即具有較強的抑菌效果；而地黃根和地黃花的醇提液MIC分別為10.0g/L、20.0g/L。

2.2 不同部位抑菌作用的比較分析

2.2.1 地黃不同部位醇提液的抑菌作用比較 圖1為地黃不同部位醇提液處理樣品600nm處的OD值。由圖1可知，在低質(zhì)量濃度下（2.5～20g/L），地黃根部、花部醇提液吸光值間無顯著差異，而二者均明顯高于地黃葉醇提液處理組吸光值；在中高濃度（40～80g/L）時，地黃葉醇提液OD值隨著質(zhì)量濃度增加的降幅明顯，說明在較高質(zhì)量濃度下，其抑制金黃色葡萄球菌生長的能力顯著增強；當質(zhì)量濃度為80g/L時，3個部位的抑菌作用為地黃葉>地黃花>地黃根。

2.2.2 地黃不同部位醇提液抑菌活性的濃度效應(yīng) 對地黃提取液質(zhì)量濃度和抑菌率間進行相關(guān)性分析，得不同部位乙醇提取液抑菌力回歸方程（圖2～圖4）。由圖2～4可知，隨著地黃各部位醇提液質(zhì)量濃度的增加，對金黃色葡萄球菌的抑制作用均呈明顯遞增趨勢，且表現(xiàn)為對數(shù)式增長。

抑菌活性與提取液質(zhì)量濃度間的相關(guān)性分析表明，地黃葉部醇提液抑菌力的濃度效應(yīng)最為顯著（R2=0.994，P=0.015），其次為花部（R2=0.983，P=0.024），而根部表現(xiàn)出的抑菌作用的濃度效應(yīng)最不明顯（R2=0.887，P>0.05）。

2.2.3 地黃不同部位醇提液抑菌中濃度（EC50） 依據(jù)圖2～圖4所得抑菌活性與提取液質(zhì)量濃度的回歸方程，計算得到地黃葉、花、根等部位醇提液對金黃色葡萄球菌的EC50值，分別為10.651g/L、41.814g/L、31.480g/L，表明地黃葉乙醇提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用要顯著優(yōu)于花部和根部。

3 結(jié)論與討論

我國北方地區(qū)的地黃，其花期一般為4～5月份，最佳采收期為9～10月份，中藥地黃為地黃的塊根，是我國傳統(tǒng)優(yōu)勢國藥[10-12]。本試驗初步研究了地黃不同部位乙醇提取液對金黃色葡萄球菌的抑制作用、最低抑菌濃度以及EC50值，結(jié)果表明，地黃不同部位乙醇提取液對金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，其葉片醇提液的抑菌效果要強于根部和花部。同時，從質(zhì)量濃度與抑菌力相關(guān)性水平和回歸方程來看，都表明地黃葉醇提液具有更強的抑菌效果，其最低抑菌濃度（MIC）和抑菌中濃度（EC50）等指標水平也明顯低于根部和花部提取液。

本研究中，地黃葉醇提液表現(xiàn)出更強的抑菌作用，可能與研究所用地黃材料有關(guān)，可能是植物采集時地黃葉中積累了相對較多的次生代謝活性物質(zhì)；已有研究表明，地黃葉具有比根部更豐富的梓醇資源，具有很高的開發(fā)價值[11]。本研究僅就地黃的根、葉和花等部位乙醇提取液抑菌活性進行了分析和比較，今后將開展不同極性溶劑提取物和抑菌機理方面的研究，以期為地黃資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)與技術(shù)參考。

參考文獻

[1]中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒[M].北京：科學出版社，2002：51-52.

[2]夏至，李家美.地黃屬及其近緣屬的藥用植物資源調(diào)查研究[J].商丘師范學院學報，2009，25（12）：96-98.

[3]趙素霞，樊克峰，白雁.地黃資源情況分析[J].中藥研究與信息，2003，5（5）：25-27.

[4]于相麗，楊柯金.懷地黃的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2005，33（9）：1720-1721.

[5]劉衛(wèi)欣，盧兗偉，杜海濤，等.地黃及其活性成分藥理作用研究進展[J].國際藥學研究雜志，2009，36（4）：277-280.

[6]曾艷，賈正平，張汝學.地黃化學成分及藥理研究進展[J].中成藥，2006，28（4）：609-611.

[7]李更生，于震，王慧森.地黃化學成分與藥理研究進展[J].國外醫(yī)學中醫(yī)中藥分冊，2004，26（2）：74-78，104.

[8]陳金春，陳國強.微生物學實驗指導[M].北京：清華大學出版社，2005：37.

[9]趙錦慧，陳璨，劉中華，等.中草藥鳳尾草兩種提取物的抑菌活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24（5）：1110-1111.

[10]杜紅光.地黃不同炮制品中梓醇的含量測定研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2004，15（9）：582-583.

[11]翟彥峰.地黃葉化學成分的研究[D].開封：河南大學，2010：17-30

[12]張艷麗，馮志毅，鄭曉珂，等.地黃葉的化學成分研究[J].中國藥學雜志，2014，1：15-21.

（責編：張宏民）