發(fā)酵牦牛肉成熟過程中揮發(fā)性香氣成分的變化

沙　坤，錢　聰，張澤俊，郞玉苗，李海鵬，孫寶忠（.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京009；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院食品與葡萄酒學(xué)院，山東煙臺264670；.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京0008）

發(fā)酵牦牛肉成熟過程中揮發(fā)性香氣成分的變化

沙坤1，2，錢聰1，張澤俊3，郞玉苗1，李海鵬1，孫寶忠1
（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院食品與葡萄酒學(xué)院，山東煙臺264670；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

為探討發(fā)酵牦牛肉揮發(fā)性香氣成分在成熟過程中的變化規(guī)律，本文采用固相微萃取法（SPME）對各取樣點(diǎn)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取，利用氣相-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用法對其中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性和定量分析。總計(jì)有84種揮發(fā)性成分被鑒定，其中，經(jīng)嗅聞鑒定的香氣活性化合物有48種，包括烴類（12）、醇類（8）、酮類（7）、醛類（3）、酸類（3）、含硫化合物（2）、酯類（4）、含氮類化合物（7）和酚類（2）。在成熟過程中，烴類和酮類含量整體呈現(xiàn)波動變化。醛類和酯類含量在成熟前期增加，而后又降低。酸類和吡嗪類形成于成熟過程，含量逐漸增加。烴類是成品發(fā)酵牦牛肉風(fēng)味組成中含量最高的，其次是醇類、酮類及吡嗪類化合物。香辛料的添加、氨基酸的降解及微生物的代謝對發(fā)酵牦牛肉的香氣形成具有重要作用。

發(fā)酵牦牛肉，氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用，揮發(fā)性香氣成分

發(fā)酵肉是一類高檔肉制品，具有色澤美觀、風(fēng)味獨(dú)特、易消化、抗癌、耐貯存等特點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展空間［1］，在世界上的很多國家和地區(qū)被廣泛生產(chǎn)和消費(fèi)。該產(chǎn)品的種類很多，如我國傳統(tǒng)的干腌火腿、臘肉、臘腸等產(chǎn)品是借助微生物的自然發(fā)酵而成，而國外的一些國家已利用現(xiàn)代微生物技術(shù)定向接種有益微生物來生產(chǎn)西式發(fā)酵香腸和火腿。

牦牛是青藏高原地區(qū)的特有物種，牦牛肉具有低脂肪以及富含蛋白質(zhì)、維E等維生素及鐵等礦物質(zhì)的特點(diǎn)［2］，加之其安全無污染的優(yōu)勢，備受科研工作者和消費(fèi)者的關(guān)注。目前市售牦牛肉制品主要有牦牛肉干、牦牛肉脯、風(fēng)干牦牛肉、醬鹵牦牛肉等，產(chǎn)品開發(fā)檔次相對較低，特色產(chǎn)品、精深加工產(chǎn)品較少。已有研究嘗試以嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LABS）作為發(fā)酵劑來制作發(fā)酵牦牛肉，但僅對其發(fā)酵過程中的食用品質(zhì)變化進(jìn)行了研究［3］。通過對發(fā)酵過程中肉制品的揮發(fā)性香氣分析可以了解其形成階段和來源［4-7］，幫助調(diào)控產(chǎn)品的風(fēng)味，而關(guān)于牦牛肉發(fā)酵成熟中的揮發(fā)性香氣成分變化研究還鮮有報(bào)道。

固相微萃?。⊿PME）是一種比較成熟的提取揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的常用方法，已廣泛用于食品中的風(fēng)味成分的提取，具有操作簡單、樣品用量少、無需有機(jī)溶劑、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)［8］。而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、氣相色譜-嗅聞技術(shù)（GC-O）在對食品中風(fēng)味成分的定量和定性分析中發(fā)揮了巨大作用，其中，GC-O法是以人的鼻子作為檢測器，將氣相色譜分離出的揮發(fā)性成分用鼻子進(jìn)行嗅覺辨別，可以有效地鑒定具有活性特征的香氣成分。

本研究選取甘南牦牛的半腱?。⊿T）為原料肉，通過接種戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的混和發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵牦牛肉的制作，應(yīng)用SPME結(jié)合GC-O-MS聯(lián)用法研究其發(fā)酵成熟過程中揮發(fā)性香氣成分的變化，為發(fā)酵牦牛肉風(fēng)味品質(zhì)形成與調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

原料肉購買于甘肅省夏河縣安多牧場，選取3頭健康無病的公牦牛（4歲左右）的半腱肌，于-18℃冷凍貯藏備用；戊糖片球菌和植物乳桿菌干粉發(fā)酵劑生物試劑，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所畜產(chǎn)加工研究室；蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、營養(yǎng)瓊脂生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；磷酸氫二納、檸檬酸氨、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫80、硫酸鎂、硫酸錳分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；食鹽、蔗糖、香葉、黑胡椒粉等食品級，北京海淀區(qū)麥德龍超市；C7～C22系列烷烴色譜純，美國Sigma公司。

7890A-7000B氣-質(zhì)聯(lián)用儀美國安捷倫科技有限公司；Sniffer 9000嗅聞儀瑞士Brechbuhle公司；DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱美國J&W Scientific公司；固相微萃取裝置、50/30 μm CAR/DVB/PDMS固相微萃取頭美國Supelco公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；HH-1超級恒溫水浴鍋金壇市至翔科教儀器廠；XS105電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵牦牛肉的制作制作方法如下：

工藝要點(diǎn)：

原料肉解凍：將原料肉在0～4℃條件下解凍至中心溫度達(dá)到4℃。

修整：將肌肉修整成形狀一致的長條形，平均重量為（0.65±0.12）kg，除去表面脂肪和肌膜。

腌制：將修整后的原料肉放入腌制桶中，加入復(fù)合腌制劑，腌制劑的配比（按原料肉重計(jì)）為：1.3%食鹽，0.4%葡萄糖，0.4%蔗糖，0.1%香葉，0.2%黑胡椒粉，0.1‰亞硝酸酸鹽。同時(shí)，由戊糖片球菌和植物乳桿菌（1∶1）組成的復(fù)合發(fā)酵劑被接種，接種前發(fā)酵劑在MRS培養(yǎng)基活化并培養(yǎng)至108CFU/mL以上，按肉重1%添加。在腌制過程中，環(huán)境保持在2～4℃，80%～85%相對濕度的條件下，腌制時(shí)間為10 d，每隔3 d上下翻倒一次。

成熟：腌制結(jié)束后，將肉塊表面的腌料沖洗干凈，瀝干表面水分，用人造纖維素腸衣包裝，裝入尼龍網(wǎng)袋中吊掛成熟。首先在20～22℃，60%～65%相對濕度條件下，成熟7 d，然后在（15±2）℃，70%～80%相對濕度條件下，成熟18 d。成熟結(jié)束后，每塊肉樣的失重率為35%左右。

1.2.2揮發(fā)性香氣成分分析原料肉腌制結(jié)束后（0 d），分別取成熟第0、5、10、15、20、25 d六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肉樣，用于風(fēng)味成分的分析。

肉樣的揮發(fā)性成分分析采用SPME結(jié)合GC-OMS聯(lián)用的方法。稱取6 g肉樣切碎成2 mm3左右的顆粒，放入20 mL萃取瓶中，密封，50℃條件下平衡20 min。將固相萃取進(jìn)樣器插入萃取瓶的頂空部分，萃取40 min。然后將萃取器轉(zhuǎn)移至氣質(zhì)聯(lián)用儀，在250℃解吸7 min，同時(shí)啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

氣譜條件：毛細(xì)管柱為DB-WAX柱，程序升溫：起始溫度40℃，保持3 min，然后以5℃/min的速度升溫到200℃，再以10℃·min-1的速度升溫到230℃，保持3 min，氣化室溫度250℃；載氣為He，流速0.8 mL·min-1，分流比10∶1。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，接口溫度250℃，傳輸線溫度280℃，離子源溫度為230℃，四級桿溫度為150℃，掃描范圍55～500 m/z。

化合物的定性使用三種方法，一種是通過保留時(shí)間與NIST 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行鑒定，相似指數(shù)和反相似指數(shù)均大于800的為鑒定化合物，另一種是使用標(biāo)準(zhǔn)系列烷烴（C7～C22）在相同氣質(zhì)測定條件下進(jìn)行分析，測定化合物的保留時(shí)間并計(jì)算保留指數(shù)（Retention Indices，RI）［9］，并與網(wǎng)站www.odour.org.uk上已發(fā)表文獻(xiàn)中的RI值進(jìn)行比較來鑒定化合物。同時(shí)，以3位有經(jīng)過訓(xùn)練的感官分析人員嗅聞鑒定香氣成分。根據(jù)化合物的峰面積，通過面積歸一化法定量分析揮發(fā)性成分的相對含量，每個(gè)樣品平行測定3次。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（Duncan法）。

2　結(jié)果與分析

發(fā)酵牦牛肉成熟過程中揮發(fā)性香氣成分變化如表1所示，在各取樣點(diǎn)共檢測出84種揮發(fā)性化合物，包括烴類20種、醇類17種、酮類11種、醛類8種、酸類5種、含硫化合物2種、酯類7種、吡嗪類5種、其他成分9種。其中，經(jīng)嗅聞鑒定的活性香氣成分有48種，包括12種烴類、8種醇類、7種酮類、3種醛類、3種酸類、2種含硫化合物、4種酯類、7種含氮類化合物和2種酚類。在腌制結(jié)束后（成熟0 d），共檢測到44種化合物，而在成熟結(jié)束后（成熟25 d），共檢測到63種化合物，揮發(fā)性成分的種類大量增加。

表1　發(fā)酵牦牛肉成熟過程中揮發(fā)性香氣成分的變化（%）Table 1　Changes of volatile aroma compounds during ripening of fermented yak meat（%）

續(xù)表

續(xù)表

2.1發(fā)酵牦牛肉成熟過程中揮發(fā)性香氣成分的變化及來源

2.1.1烴類烴類總含量在成熟中未呈現(xiàn)明顯的規(guī)律變化（p＜0.05），在成熟15 d時(shí)含量最高（49.07%）。甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯等芳香烴類可能來自動物的飼料，其沉積在動物的脂肪中［10］，它們賦予了產(chǎn)品芳香味和甜味。因其香氣閾值較低，芳香烴類是干腌牛肉中重要的風(fēng)味物質(zhì)［6］。3-蒈烯、β-蒎烯、水芹烯、右旋檸檬烯、松油烯、苯乙烯等萜烯類物質(zhì)與香辛料（特別是胡椒）的添加有很大關(guān)系［6］。它們分別賦予發(fā)酵牦牛肉松木香、玫瑰香、薄荷味、檸檬香、果香、甜味，而萘和2-甲基萘則有可能是由環(huán)境污染物帶來［11］。

2.1.2醇類成熟0 d時(shí)，醇類總含量最高（32.60%），在成熟過程中呈下降的趨勢，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著（p＞0.05）。桉葉油醇、芳樟醇、α-松油醇、對甲基苯異丙醇、苯甲醇從成熟0 d就被檢測到，它們可能來源于腌制時(shí)添加的香料，而3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇和苯乙醇成熟0 d并未檢測到，它們形成于成熟過程中。3-甲基-1-丁醇是亮氨酸通過Strecker降解而形成［12］，具有清香味。1-辛烯-3-醇是不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物［13］，具有蘑菇香氣。

2.1.3酮類酮類總含量從成熟0～10 d過程中，由2.59%顯著增加到17.42%（p＜0.05），之后又出現(xiàn)了波動的變化，成熟25 d時(shí)含量為12.56%。其中，2-庚酮、2-羥基-3-戊酮、4-羥基-4-甲基-2-戊酮、2-壬酮、苯乙酮在成熟0 d時(shí)并未檢測到，它們形成于成熟的過程中。一些甲基酮類（如丙酮、丁酮、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、苯乙酮等）的生成與微生物引起的脂肪酸的β氧化相關(guān)，而3-羥基-2-丁酮則來源于糖類的微生物代謝［12］。在本研究中，除丙酮被鑒定有酸臭味以外，多數(shù)酮類具有奶香和甜香。

2.1.4醛類醛類總含量在成熟過程中總體上看呈現(xiàn)先增加又降低的趨勢，最高含量出現(xiàn)在成熟5 d（2.46%）。在成品發(fā)酵牦牛肉中僅檢測到兩種醛類，壬醛是不飽和脂肪酸氧化的產(chǎn)物［13］，具有青草香氣，而苯甲醛可能由氨基酸代謝產(chǎn)生［10］，具有苦杏仁味。

2.1.5酸類酸類總含量在成熟過程中總體上看呈現(xiàn)增加的趨勢，成熟20 d時(shí)含量最高為4.32%，與成熟25 d的含量沒有顯著差異（p＞0.05）。三種酸類如乙酸、2-甲基丙酸和3-甲基丁酸經(jīng)嗅聞被鑒定，帶有酸味、腐臭的味道，在金華火腿中同樣檢測到了它們的存在［14］，主要來源于微生物的代謝反應(yīng)，說明微生物在發(fā)酵牦牛肉的成熟過程中起到了較大的作用。

2.1.6含硫化合物本研究中僅檢測到了兩種含硫化合物如二甲基二硫醚和3-甲硫基丙醇，它們可能來源于含硫氨基酸如半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸的Strecker降解，這些氨基酸降解后生成硫醇，硫醇可以進(jìn)一步氧化形成二甲基二硫化合物［14］，賦予產(chǎn)品蔥香，肉香味。含硫化合物具有低閾值的特點(diǎn)，對發(fā)酵牦牛肉的風(fēng)味形成將有重要作用。

2.1.7酯類酯類總含量在成熟過程中呈現(xiàn)先增加又降低的趨勢，最高含量為成熟15 d時(shí)的3.16%。酯類是由羧酸和醇類通過微生物的酯化作用而生成。本研究中檢測到四種有香氣的酯類，包括甲酸乙酯、乙酸芳樟酯、γ-癸內(nèi)酯和γ-十二內(nèi)酯，它們具有花香和果香，且香氣閾值較低，對發(fā)酵牦牛肉的風(fēng)味將有重要貢獻(xiàn)。

2.1.8吡嗪類吡嗪類在成熟5 d時(shí)（含量為1.93%）才開始被檢測到，其后含量逐漸增加（p＜0.05），成熟25 d時(shí)達(dá)到5.60%。5種吡嗪類物質(zhì)賦予發(fā)酵牦牛肉熟制的味道如炒花生、堅(jiān)果香、杏仁味、烤香等氣味。在金華火腿［14］中，同樣檢測到了吡嗪類物質(zhì)的存在，它們可能源于氨基酸Strecker降解反應(yīng)，氨基酸在發(fā)生Strecker反應(yīng)后的主要產(chǎn)物氨基酮異構(gòu)為烯醇胺，而后環(huán)化生成吡嗪類物質(zhì)［15］。這些在成熟過程中代謝產(chǎn)生的吡嗪類物質(zhì)對發(fā)酵肉制品的特征風(fēng)味形成具有重要作用。

2.2成品發(fā)酵牦牛肉揮發(fā)性風(fēng)味組成分析

在成品發(fā)酵牦牛肉揮發(fā)性成分的組成中，烴類含量最高（31.29%），其次是醇類（21.40%）、酮類（12.56%）和吡嗪類（5.60%）。這一結(jié)果與Kaban［6］的報(bào)道相似，烴類也是土耳其干腌牛肉“pastirma”的風(fēng)味組成中最豐富的成分。但是發(fā)酵牦牛肉的風(fēng)味組成卻不同于另外的幾類干腌或發(fā)酵肉制品。例如，在克羅地亞和西班牙的干腌豬火腿中［13，16］，脂肪氧化產(chǎn)物醛類是最豐富的；在西班牙的干腌馬肉“Cecina”［7］產(chǎn)品中，酯類物質(zhì)是含量最高的；而在意大利的“San Daniele”火腿［17］中醇類是含量最高的組成成分。原料肉的性質(zhì)差異、加工工藝的不同及香辛料等配料使用的不同可能是導(dǎo)致各類產(chǎn)品風(fēng)味組成差異的原因，也正因此形成了各自產(chǎn)品的獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)。

3　結(jié)論

在發(fā)酵牦牛肉的揮發(fā)性成分檢測中，通過氣相色譜-質(zhì)譜方法共檢測到84種化合物，其中經(jīng)GC-O方法鑒定的活性香氣成分有48種，包括12種烴類、8種醇類、7種酮類、3種醛類、3種酸類、2種含硫化合物、4種酯類、7種含氮類化合物和2種酚類。在成熟過程中，烴類和酮類含量整體呈現(xiàn)波動變化。醛類和酯類含量在成熟前期增加，而后又降低。酸類和吡嗪類形成于成熟過程，含量逐漸增加。成品發(fā)酵牦牛肉揮發(fā)性成分中，烴類是含量最高的，其次是醇類、酮類及吡嗪類化合物，這些成分主要來自腌制階段添加的香辛料、氨基酸的降解及微生物的代謝。

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Changes in volatile aroma compounds during ripening of fermented yak meat

SHA Kun1，2，QIAN Cong1，ZHANG Ze-jun3，LANG Yu-miao1，LI Hai-peng1，SUN Bao-zhong1
（1.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.College of Food and Wine，Yantai Research Institute of China Agricultural University，Yantai 264670，China；3.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The objectives of this study were to discuss the changes in volatile aroma compounds of fermented yak meat during ripening.Volatile compounds in fermented yak meat were extracted by solid-phase micro extraction（SPME）.Gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry（GC-O-MS）was used to identify and quantify these compounds.A total of 84 volatile compounds were identified.Among these compounds，48 aroma-active compounds were identified by GC-O，including hydrocarbons（11），alcohols（8），ketones（7），aldehydes（3），carboxylic acids（3），sulfocompound（2），esters（4），nitrogenous compounds（7），and phenols（2）. During ripening，the content of hydrocarbons and ketones showed fluctuation changes.The content of aldehydes and esters increased during the first ripening stage，and then decreased.Carboxylic acids and pyrazines were formed and increased during ripening.Hydrocarbons were the most abundant volatile compounds in the final product，followed by alcohols，ketones，and nitrogen compounds.Spices，amino acids degradation，and microbial metabolism played a key role in the flavour formation of fermented yak meat.

fermented yak meat；GC-O-MS；volatile aroma compounds

TS251.5

A

1002-0306（2015）24-0076-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.007

2015－05-06

沙坤（1978-），女，博士，副教授，主要從事畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全方面的研究，E-mail：405562127@qq.com。

孫寶忠（1964-），男，博士，研究員，主要從事畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全方面的研究，E-mail：baozhongsun@163.com。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203009）；國家牦牛肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目（CARS-38）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31460403）。