凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間蛋白降解的影響

王　　玲，梁　　琪，*，宋雪梅，張　　炎

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅蘭州730070）

凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間蛋白降解的影響

王玲1，2，梁琪1，2，*，宋雪梅1，2，張炎1，2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅蘭州730070）

以新鮮牦牛乳為原料，采用小牛皺胃酶、木瓜蛋白酶和微生物凝乳酶制作硬質(zhì)干酪，探討凝乳酶種類對牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間蛋白質(zhì)降解的影響。結(jié)果表明：三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過程中，不同凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪在成熟期間蛋白質(zhì)降解能力存在較大差異，總氮（TN）、pH4.6水溶性氮（pH4.6-SN/TN）、12%的三氯乙酸氮（12% TCA-N/TN）、5%磷鎢酸氮（5%PTA-N/TN）含量、游離氨基酸均隨成熟時間延長不同程度的增加，蛋白氮和酪蛋白氮逐漸降低，多肽氮呈先升高后下降趨勢，且微生物凝乳酶降解牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白能力顯著（p＜0.05）高于木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶。

牦牛乳，硬質(zhì)干酪，凝乳酶，蛋白質(zhì)降解，成熟

牦牛乳是青藏高原特有的天然綠色食品［1］，與普通牛乳相比，牦牛乳的蛋白質(zhì)、乳糖、脂肪和礦物質(zhì)營養(yǎng)含量更高。干酪是指在原料乳中加入發(fā)酵劑、凝乳酶，凝固或者部分凝固原料乳中的蛋白質(zhì)，使凝塊中的部分乳清析出，形成成熟或者未成熟的乳制品。干酪含有豐富的營養(yǎng)成分，被譽為奶界的“乳黃金”。依據(jù)凝乳方式的不同，干酪可分為酶凝型與酸凝型干酪，大部分屬于酶凝型干酪。目前國際市場上的凝乳酶中動物來源的約占70%，微生物的占30%，植物的不到1%。但由于動物凝乳酶供不應(yīng)求且價格昂貴，因此微生物和植物凝乳酶逐步替代部分動物凝乳酶成為近年研究的熱點。

在干酪成熟過程中，凝乳酶來源和性質(zhì)的差別，使其降解蛋白的能力也不同，若凝乳酶過度水解蛋白質(zhì)會產(chǎn)生苦味［2-3］。因此，研究干酪成熟過程中蛋白質(zhì)的降解有利于控制干酪的品質(zhì)。干酪中的總氮（TN）、pH4.6水溶性氮（pH4.6-SN/TN）、12%的三氯乙酸氮（12%TCA-N/TN）、5%磷鎢酸氮（5%PTA-N/TN）、蛋白氮、酪蛋白氮和多肽氮是干酪蛋白質(zhì)降解程度的重要指標(biāo)。目前，國外就干酪成熟過程中蛋白質(zhì)降解對干酪品質(zhì)影響的研究報道較多。sousa［4］綜述了在干酪成熟期間蛋白質(zhì)降解的研究進(jìn)展。Ferna?ndez-Salguero［5］研究表明植物凝乳酶比動物凝乳酶蛋白降解能力強。Antonio［6］研究了植物凝乳酶和小牛皺胃酶山羊乳干酪成熟期間的蛋白降解，兩種凝乳酶干酪組成成分沒有實質(zhì)性差異，但植物凝乳酶干酪的pH4.6-SN/TN高于小牛皺胃酶干酪。因此，凝乳酶的種類對干酪成熟期間蛋白質(zhì)的降解有顯著的影響。而國內(nèi)干酪生產(chǎn)剛剛起步，相關(guān)研究鮮有報道。成熟過程中，凝乳酶種類對牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白質(zhì)降解的影響尚未見報道。因此，本文研究動物、植物及微生物凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過程中的蛋白質(zhì)降解影響，旨在對牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白降解規(guī)律有更明確的認(rèn)識，對指導(dǎo)牦牛乳硬質(zhì)干酪生產(chǎn)和質(zhì)量控制具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮牦牛乳采自甘肅天祝縣（蛋白含量5.00%～5.32%，乳脂6.50%～7.50%）；小牛皺胃酶酶活為1×105SU/g，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；微生物凝乳酶酶活為2×104SU/g，甘肅華羚生物技術(shù)研究中心；木瓜蛋白酶酶活為8×105SU/g，上海源葉生物科技有限公司；CHOOZ型直投式嗜熱發(fā)酵劑活力2.5～5U（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌），丹麥丹尼斯克公司。

TDD-5M低速離心機長沙平凡儀器有限公司；754PC型紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；TGL-20高速臺式冷凍離心機；AL204電子天平梅特勒儀器有限公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)燥箱上海恒科技有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋上海恒科技有限公司；LRH-300GSII人工氣候箱廣東省醫(yī)療器械廠；UV-5100真空包裝機廣東中山市名康包裝機械廠；SKD-200凱氏定氮儀上海沛歐分析儀器有限公司。

1.2實驗方法

原料乳→過濾→檢驗→巴氏殺菌（63℃，30min）→冷卻（35℃）→添加發(fā)酵劑（0.0625g/100mL）→添加CaCl2（1%）→添加凝乳酶→35℃凝乳，40min→切割→45℃二次加熱→排乳清→攪拌、加鹽（凝塊的2%）→35℃堆釀（30min）→壓榨成型（4～5h）→真空包裝→成熟

分別添加酶活相當(dāng)?shù)哪槊福ㄐ∨０櫸该?.001g/100mL、微生物凝乳酶0.0025g/100mL、木瓜蛋白酶0.006g/100mL）制作牦牛乳硬質(zhì)干酪。測定貯藏在10℃的六個成熟階段（0、30、60、90、120、150、180d）的牦牛乳硬質(zhì)干酪的總氮、pH4.6-SN、5%PTA-N、12%TCA-N、游離氨基酸、蛋白氮、酪蛋白氮和多肽氮含量的變化。

1.2.1總氮的測定依照GB/T5009.5-2010采用凱氏定氮法測定干酪中的總氮。

1.2.2pH4.6水溶性氮（pH4.6-SN/TN）含量測定采用Kuchroo等［7］方法。稱取0.75g干酪，加入25mL pH4.6的醋酸鹽緩沖液，充分研磨，25mL pH4.6的醋酸鹽緩沖液充分沖洗，移入離心管，4000r/min離心20min，取20mL上清液進(jìn)行凱氏微量定氮，以占總氮量的百分?jǐn)?shù)表示，并做三次平行實驗。

1.2.312%三氯乙酸氮（12%TCA-N/TN）含量測定采用Samson等［8］方法。稱取1.50g干酪，加入25mL 12%的三氯乙酸溶液，充分研磨，25mL 12%三氯乙酸緩沖液充分沖洗，移入離心管，4000r/min離心20min，取20mL上清液進(jìn)行凱氏微量定氮，以占總氮的百分?jǐn)?shù)表示，并做三次平行實驗。

1.2.45%磷鎢酸氮（5%PTA-N/TN）含量的測定采用Samaon［8］的方法。pH4.6可溶性氮的上清液中取出10mL，加入7mL 4mol/L的硫酸和3mL 333g/L的磷鎢酸氮，搖勻，4℃靜置24h，濾紙過濾，取上清液10mL移入凱氏消化瓶，進(jìn)行凱氏微量定氮，并以占干酪總氮量的百分?jǐn)?shù)表示，并做三次平行實驗。

1.2.5游離氨基酸的測定采用茚三酮比色法進(jìn)行測定［9］。

1.2.6蛋白氮、酪蛋白氮和多肽氮采用L.Tejada［10］的方法計算，由蛋白氮、酪蛋白氮和多肽氮由12% TCA-N/TN和pH4.6-SN/TN換算得出，蛋白氮=總氮-12%TCA-N/TN，酪蛋白氮=總氮-pH4.6-SN/TN，多肽氮=pH4.6-SN/TN-12%TCA-N/TN。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，并利用Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析。

2　結(jié)果與分析

2.1總氮含量的變化

凝乳酶參與干酪生產(chǎn)的凝乳后，隨乳清排出，通常有5%～10%的凝乳酶殘留在凝塊中，主要是殘留凝乳酶對干酪蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)生重要作用，而不是發(fā)酵劑和乳中本身的酶，并且使用不同的凝乳酶產(chǎn)生的結(jié)果也不同［7］。圖1反映了三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間總氮含量的變化。

由圖1可以看出，隨成熟時間的延長，三種凝乳酶干酪總氮含量均呈逐漸上升的趨勢，這與Hayaloglu［11］研究相一致。成熟90d時，加入木瓜蛋白酶、小牛皺胃酶和微生物凝乳酶的牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮含量分別升高了6.31%、7.99%和4.5%。由此可以看出在成熟前期，微生物凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮含量貢獻(xiàn)較小。在成熟90～180d內(nèi)，加入木瓜蛋白酶、小牛皺胃酶和微生物凝乳酶的牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮含量分別從31.75%、25.86%和20.86%上升到34.52%、30.21%和32.13%，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮含量增加的更多，說明成熟后期微生物凝乳酶蛋白質(zhì)分解能力較強。在0～180d這一成熟過程中，同一種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮含量差異顯著（p＜0.05）。

成熟0～150d內(nèi)，木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮含量顯著（p＜0.05）高于微生物凝乳酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的總氮含量，小牛皺胃酶次之，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮含量最低。這是由于凝乳酶的凝乳特性使酪蛋白凝乳產(chǎn)生差異，乳清排除程度不同引起的。但成熟180d時，微生物凝乳酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮含量分別為32.13%和30.21%，前者顯著高于后者（p＜0.05），其原因有待進(jìn)一步研究。

圖1　凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪總氮的影響Fig.1　Effect of rennet on total nitrogen for yak’s milk hard cheese

2.2pH4.6-SN/TN含量的變化

pH4.6-SN是干酪成熟程度的一種標(biāo)志，該數(shù)值的高低，表明了蛋白質(zhì)水解程度的高低。pH4.6-SN/TN主要包含中、小分子量肽，由于pH4.6時，γ-酪蛋白沉淀，可溶的乳清蛋白和蛋白胨對可溶性氮貢獻(xiàn)較小。O’keeffe［12］認(rèn)為干酪成熟初期pH4.6-SN/TN主要是由凝乳酶作用產(chǎn)生的。pH4.6-SN/TN是由蛋白水解引起的，直接影響干酪的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)。圖2反映了三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間pH4.6-SN/TN含量的變化。

由圖2可知，隨成熟時間的延長，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪pH4.6-SN含量都呈上升趨勢。成熟前30d內(nèi)，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪pH4.6-SN/TN含量增加不明顯；成熟30d后，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪pH4.6-SN/TN含量迅速增加，說明成熟期后期凝乳酶降解蛋白質(zhì)的反應(yīng)活躍，反應(yīng)產(chǎn)物趨于小分子化。成熟180d時，微生物凝乳酶、小牛皺胃酶和木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪分別變化了15.32%、12.06%和13.49%，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪pH4.6-SN/TN含量變化最大。在0～180d成熟過程中，同一種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪pH4.6-SN/TN含量差異顯著（p＜0.05）。0～90d，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的pH4.6-SN含量顯著（p＜0.05）高于木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪，且木瓜蛋白酶牦牛乳高于小牛皺胃酶牦牛乳，這與Galán研究植物凝乳酶比小牛皺胃酶pH4.6-SN/TN含量高的實驗結(jié)果一致［13］。成熟120d時，木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪pH4.6-SN/TN含量顯著（p＜0.05）高于微生物凝乳酶和小牛皺胃酶。在干酪成熟過程中，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪pH4.6-SN/TN含量高，說明微生物凝乳酶的蛋白質(zhì)降解能力較強，F(xiàn)ox的研究結(jié)果也同樣反映了微生物凝乳酶的蛋白質(zhì)降解能力最強［13］。

圖2　凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪pH4.6可溶性氮含量的影響Fig.2　Effect of rennet on pH4.6 soluble nitrogen content for yak’s milk hard cheese

2.312%TCA-SN/TN含量的變化

三氯乙酸是一種蛋白質(zhì)沉淀劑，用來分離成熟干酪中氮的組分。12%TCA-SN/TN的成分主要是小分子肽（具有2～20氨基酸殘基）和少量的氨基酸［14］。Venema等指出12%TCA-SN/TN比pH4.6-SN/TN能更好的作為干酪成熟的指標(biāo)。圖3反映了三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間12%TCA-SN/TN含量的變化。

由圖3可以看出，干酪整個成熟期間，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪12%TCA-SN/TN含量顯著（p＜0.05）高于其它兩種酶。成熟0d時，木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪12%TCA-SN/TN含量與小牛皺胃酶含量差異不顯著（p＞0.05），但成熟0d之后，木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪12%TCA-SN/TN含量顯著（p＜0.05）高于小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪12%TCA-SN/TN含量。這是因為在牦牛乳硬質(zhì)干酪中殘留木瓜蛋白酶含量高于小牛皺胃酶，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解強烈，Roa［15］研究荊棘薊凝乳酶和小牛皺胃酶制作的干酪時，殘留量較高的荊棘薊凝乳酶引起了干酪強烈蛋白降解。

在干酪0～180d成熟過程中，對同一種凝乳酶而言，木瓜蛋白酶和微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪12%TCA-SN/TN含量差異都顯著（p＜0.05）。成熟前30d內(nèi)，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪12%TCA-SN/TN含量差異不顯著（p＞0.05），但成熟30d后，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪12%TCA-SN/TN含量差異顯著（p＜0.05），說明小牛皺胃酶在后期降解牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白強烈。成熟前中期，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的12%TCA-SN/TN含量增加趨勢平緩，成熟后期呈明顯上升趨勢。12%TCA-SN/TN主要是加入的凝乳酶和發(fā)酵劑共同作用而產(chǎn)生的。這可能是由于成熟前期，主要是凝乳酶活性的作用，在成熟后期，一些多肽和中肽在大部分乳酸菌死亡釋放出的胞內(nèi)蛋白酶和凝乳酶釋放的肽酶共同作用下迅速水解成小肽和氨基酸，所以三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪12%TCA-SN/TN迅速上升。成熟180d時，微生物凝乳酶、木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的12%TCA-SN/TN含量分別為15.89%、11.07%和10.03%。與小牛皺胃酶和木瓜蛋白酶相比，微生物凝乳酶較強的蛋白酶活力將蛋白質(zhì)降解為更多的酪蛋白多肽，乳酸菌和其他酶將其進(jìn)一步降解為小分子量12% TCA-SN/TN。這說明微生物凝乳酶在干酪成熟期間對蛋白質(zhì)降解起著非常重要的作用。相對而言，木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶對12%TCA-SN/TN的貢獻(xiàn)較小。12%TCA-SN/TN含量變化類似于pH4.6-SN/TN含量變化，說明微生物凝乳酶不僅蛋白水解能力強，對酪蛋白降解作用比其他酶顯著而且還有進(jìn)攻酶蛋白的非專一性，能把大肽、中肽進(jìn)一步降解成小肽。

圖3　凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪12%三氯乙酸可溶性氮含量的影響Fig.3　Effect of rennet on 12%TCA soluble nitrogen content for yak’s milk hard cheese

2.45%PTA-SN/TN含量的變化

磷鎢酸是一種極有辨別力的蛋白質(zhì)沉淀劑，絕大多數(shù)游離氨基酸都可在5%PTA-SN/TN中溶解，但分子量大于600u的肽類則被沉淀出來，因此5%PTASN/TN經(jīng)常作為成熟干酪中游離氨基酸含量的標(biāo)志。圖4反映了三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間5% PTA-SN/TN含量的變化。

由圖4可以看出，隨成熟時間的延長，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的5%PTA-SN/TN含量均呈上升趨勢。三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪降解過程中，5% PTA-SN/TN含量都比較低，Sanjuán等也有相似的報道［16］。成熟180d時，微生物凝乳酶、小牛皺胃酶和木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪5%PTA-SN/TN含量分別為10.42%、8.18%和8.42%，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪5%PTA-SN/TN含量最高。Nunez［17］報道拉瑟瑞納干酪中，植物凝乳酶干酪5%PTA-SN/TN含量稍高于小牛皺胃酶干酪5%PTA-SN/TN的含量。成熟前120d，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的5%PTA-SN/TN含量增加趨勢明顯，成熟120d之后，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的5%PTA-SN/TN含量增加趨于平緩。成熟0～60d，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪5%PTA-SN/TN含量差異顯著（p＜0.05）。成熟150d時，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪5%PTA-SN/TN含量顯著（p＜0.05）高于木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪5% PTA-SN/TN含量，且木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪5%PTA-SN/TN含量差異不顯著（p＞0.05）。干酪成熟前60d內(nèi)，小牛皺胃酶比微生物凝乳酶生產(chǎn)的牦牛乳硬質(zhì)干酪的5%PTA-SN/TN含量高，成熟60d之后，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪5%PTASN/TN含量顯著（p＜0.05）高于小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪5%PTA-SN/TN含量。這可能是由于成熟后期，殘留的少量的小牛皺胃酶活性減弱導(dǎo)致的。Fox等［18］通過研究認(rèn)為，凝乳酶對酪蛋白的降解作用，只分解到形成肽這一階段。Aston等［19］提出，5%PTASN/TN的增加主要是由于發(fā)酵劑中形成的微生物肽酶作用的結(jié)果。

圖4　凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪5%磷鎢酸可溶性氮含量的影響Fig.4　Effect of rennet on 5%phosphotungstic acid soluble nitrogen content for yak milk hard cheese

2.5不同凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪游離氨基酸含量變化的影響

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，不同氨基酸含量下的吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。酪氨酸濃度在100～600μg/mL范圍內(nèi)吸光度A與濃度C呈線性關(guān)系，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.0011x-0.0053，其中y是吸光度，x是測試液的濃度；相關(guān)系數(shù)R2=0.999。干酪在成熟期間，凝乳酶先使酪蛋白分子降解為大分子肽，在發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑肽酶作用下進(jìn)一步降解為小分子肽和游離氨基酸，這些降解產(chǎn)物是干酪風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)。

圖6是三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪游離氨基酸含量的變化。如圖6所示，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪游離氨基酸總量都隨著成熟時間的延長而增加。干酪成熟前期游離氨基酸增加速度較慢，成熟后期游離氨基酸含量迅速升高，說明成熟后期蛋白質(zhì)水解程度劇烈。成熟初期，主要是凝乳酶降解牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白，且乳酸菌細(xì)胞裂解的少，微生物蛋白酶含量較低，降解產(chǎn)生主要大分子量的肽段，所以游離氨基酸總量增加較慢；隨著乳酸菌細(xì)胞的裂解增加，微生物蛋白酶也在逐步增加，將大分子量肽段降解成小分子肽段和游離氨基酸，所以游離氨基酸含量增加。這說明凝乳酶作用于蛋白質(zhì)降解的前期，而蛋白質(zhì)的后期降解主要是由發(fā)酵劑引起的。Vicente研究了發(fā)酵劑和凝乳酶對干酪游離氨基酸含量的影響，添加發(fā)酵劑干酪游離氨基酸含量顯著高于不加發(fā)酵劑干酪游離氨基酸含量［20］。

成熟180d時，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪游離氨基酸達(dá)到35.32%，木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶分別是33.15%和32.84%，說明微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白降解能力較強。在0～180d各個成熟時期，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪游離氨基酸含量顯著（p＜0.05）高于木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪游離氨基酸含量，且木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪游離氨基酸含量顯著（p＜0.05）高于小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪游離氨基酸含量，說明凝乳酶對游離氨基酸的含量也有一定的影響，Vicente［20］研究表明不同凝乳酶影響游離氨基酸的含量。

圖5　氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5　Standard curve of amino acid

圖6　凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪中游離氨基酸含量的影響Fig.6　Effect of rennet on FAA content for yak’s milk hard cheese

圖7　凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪中酪蛋白氮含量的影響Fig.7　Effect of rennet on casein nitrogen content for yak’s milk hard cheese

2.6酪蛋白氮含量的變化

乳中蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白，乳清蛋白在干酪制作過程中被排出，所以干酪中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白。圖7反映了三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間酪蛋白含量的變化。

由圖7可知，成熟期間，三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白含量是逐漸降低的，這是因為牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白被降解為多肽，多肽再被降解成小分子肽和游離氨基酸。在0～180d成熟過程中，對同一種凝乳酶而言，木瓜蛋白酶和微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白含量差異顯著（p＜0.05）。成熟前30d內(nèi)，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白含量差異不顯著（p＞0.05），成熟30d之后，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白含量差異顯著（p＜0.05）。成熟60d時，木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白含量差異不顯著（p＞0.05）。達(dá)到成熟終點時，微生物凝乳酶、木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白含量分別變化了15.32%、14.18%和12.06%，由此可以看出，微生物降解牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白氮的能力最強。且整個成熟過程中，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白含量顯著（p＜0.05）高于木瓜蛋白酶和微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪酪蛋白含量。這是小牛皺胃酶降解酪蛋白的能力較弱導(dǎo)致的，Tejada研究發(fā)現(xiàn)植物凝乳酶干酪酪蛋白氮含量顯著低于小牛皺胃酶干酪酪蛋白氮含量［21］。

2.7蛋白氮含量的變化

在干酪中，除去非蛋白氮以外的所有氮都稱為蛋白氮。由圖8所示，三種凝乳酶牦牛硬質(zhì)干酪成熟過程中，蛋白氮呈現(xiàn)不斷減小的趨勢，這是由于牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過程中，凝乳酶降解蛋白質(zhì)把蛋白氮分解成氨基酸，氨基酸進(jìn)一步被分解成無機物，使得牦牛乳硬質(zhì)干酪中的蛋白氮不斷減少，微生物凝乳酶生產(chǎn)的牦牛乳硬質(zhì)干酪的蛋白氮含量最低，說明微生物凝乳酶降解蛋白能力最強烈。在0～180d成熟過程中，對同一種凝乳酶而言，木瓜蛋白酶和微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白氮含量差異顯著（p＜0.05）。成熟前30d，小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白氮含量影響差異不顯著（p＞0.05），成熟后期差異顯著（p＜0.05）。成熟0～180d內(nèi)，對不同凝乳酶而言，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白氮含量顯著（p＜0.05）低于木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白氮含量。說明微生物降解牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白能力最強。成熟30d內(nèi)，木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白氮含量影響差異不顯著（p＞0.05），反之，成熟30d之后，蛋白氮含量影響差異顯著（p＜0.05）。成熟180d時，微生物凝乳酶、木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪的蛋白氮分別為84.11%、88.64%和89.97%。由此可以看出，干酪成熟期間，微生物凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪的蛋白降解較強，生成的非蛋白氮相對較高，蛋白氮含量相對較低。

圖8　凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪中蛋白氮含量的影響Fig.8　Effect of rennet on protein nitrogen content for yak’s milk hard cheese

2.8多肽氮含量的變化

多肽氮是蛋白質(zhì)降解的中間產(chǎn)物，它能更好的反映牦牛乳硬質(zhì)干酪各個成熟階段蛋白質(zhì)降解的具體情況。成熟0～180d，同一種凝乳酶而言，木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪多肽氮含量差異顯著（p＜0.05）。成熟30～60d時，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪多肽氮含量差異不顯著（p＞0.05）。成熟30d時，微生物凝乳酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪多肽氮含量差異不顯著（p＞0.05）。成熟120d之后，微生物凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪多肽氮含量顯著（p＜0.05）低于木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶牦牛乳硬質(zhì)干酪多肽氮含量。三種凝乳酶生產(chǎn)的牦牛乳硬質(zhì)干酪多肽氮呈先升高后降低趨勢，這與Tejada［21］研究不同凝乳酶干酪多肽氮含量變化一致。這是因為成熟初期，凝乳酶降解蛋白質(zhì)為中等和大分子量肽，使牦牛乳硬質(zhì)干酪中的多肽氮含量升高，成熟后期，發(fā)酵劑蛋白酶進(jìn)一步將中等和大分子肽降解為小分子肽和氨基酸殘基，相應(yīng)的牦牛乳硬質(zhì)干酪的多肽氮含量降低。三種凝乳酶牦牛乳硬質(zhì)干酪中多肽氮含量變化是沒有固定的趨勢的，處于動態(tài)變化的。這主要是由于干酪中蛋白質(zhì)降解生成多肽氮不斷積累的同時又進(jìn)一步降解生成一些小分子肽和氨基酸，從而導(dǎo)致多肽氮在干酪成熟期間一直存在波動性。

圖9　凝乳酶對牦牛乳硬質(zhì)干酪中蛋白氮含量的影響Fig.9　Effect of rennet on polypetide nitrogen content for yak’s milk hard cheese

3　結(jié)論

干酪成熟過程中，殘留凝乳酶影響干酪中蛋白質(zhì)的降解，其降解程度直接關(guān)系著干酪的質(zhì)量和風(fēng)味。通過研究凝乳酶種類對牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間蛋白質(zhì)的降解表明，木瓜蛋白酶易使牦牛乳硬質(zhì)干酪蛋白降解產(chǎn)生苦味，克服這一風(fēng)味缺陷還有待進(jìn)一步的研究，小牛皺胃酶、微生物凝乳酶和木瓜蛋白酶牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過程中，總氮、pH4.6 SN/TN、12% TCA-N/TN、5%PTA-N/TN含量、游離氨基酸均隨成熟時間延長不同程度的增加，蛋白氮和酪蛋白氮逐漸降低，多肽氮先升高后下降趨勢，微生物凝乳酶分解蛋白質(zhì)的能力最強，其次是木瓜蛋白酶，小牛皺胃酶蛋白降解適中。由此可以看出，凝乳酶種類和成熟時間對牦牛乳硬質(zhì)干酪的蛋白質(zhì)降解有明顯的影響。

［1］楊楠，梁琪，楊敏，等.牦牛脫脂乳中酪蛋白受熱處理溫度及時間影響的研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（5）：121-125.

［2］Kuchroo C N，F(xiàn)ox P F.Fractionation of the water-solublenitrogen from Cheddar cheese：chemical methods［J］.Milchwissen-Schaft-Milk Science International，1982，37（6）：331-335.

［3］Sohal T S，Roehl D，Jelen P.Rennet as a cause of bitterness development in quarg［J］.Journal of Dairy Science，1988，71（12）：3188-3196.

［4］Sousa M J，Ard? Y，McSweeney P L H.Advances in the study of proteolysis during cheese ripening［J］.International Dairy Journal，2001，11（4）：327-345.

［5］Fernández-Salguero J，Sanjuán E.Influence of vegetable and animal rennet on proteolysis during ripening in ewes’milk cheese［J］.Food Chemistry，1999，64（2）：177-183.

［6］Pino A，Prados F，Galán E，et al.Proteolysis during the ripening of goats’milk cheese made with plant coagulant or calf rennet［J］.Food Research International，2009，42（3）：324-330.

［7］Bütikofer U，Rüegg M，Ard? Y.Determination of nitrogen fractions in cheese：Evaluation of a collaborative study［J］.LWTFood Science and Technology，1993，26（3）：271-275.

［8］Samson O，Agboola，Milena Radovnoavic-Tesic.Influence of Ausrtalian Native Herbs on the maturation of vacuum-packed Cheese［J］.Lebensm Technol，2002，3：575-583.

［9］高向陽.食品分析與檢驗［M］.北京：中國計量出版社，2006：119.

［10］Tejada L，Abellán A，Cayuela J M，et al.Proteolysis in goats’milk cheese made with calf rennet and plant coagulant［J］. International Dairy Journal，2008，18（2）：139-146.

［11］Hayaloglu A A.Volatile composition and proteolysis in traditionally produced mature Kashar cheese［J］.International Journal of Food Science and Technology，2009，44（7）：1388-1394.

［12］O’Keeffe A M，F(xiàn)ox P F.Proteolysis in Cheddar cheese：role of coagulant and starter bacteria［J］.Journal of Dairy Research，1978，45（3）：465-477.

［13］Galán E，Prados F，Pino A，et al.Influence of different amounts of vegetable coagulant from cardoon Cynara cardunculus and calf rennet on the proteolysis and sensory characteristics of cheeses made with sheep milk［J］.International Dairy Journal，2008，18（1）：93-98.

［14］Neviani E，Giraffa G，Brizzi A，et al.Amino acid requirements andpeptidaseactivitiesofStreptococcussalivariussubsp. thermophilus［J］.Journal of Applied Bacteriology，1995，79（3）：302-307.

［15］Roa I，Belén López M，Javier Mendiola F.Residual clotting activity and ripening properties of vegetable rennet from Cynara cardunculus in La Serena cheese［J］.Food Research International，1999，32（6）：413-419.

［16］Sanjuán E，Millán R，Saavedra P，et al.Influence of animal and vegetable rennet on the physicochemical characteristics of Los Pedroches cheese during ripening［J］.Food Chemistry，2002，78（3）：281-289.

［17］Nu?ez M，Pozo B F D，Rodríguez-Marin M A，et al.Effect of vegetable and animal rennet on chemical，microbiological，rheological and sensory characteristics of La Serena cheese［J］. Journal of Dairy Research，1991，58（4）：511-519.

［18］Fox P F.Rennets and their action in cheese manufactureand ripening［J］.Biotechnology and Applied Biochemistry（USA），1988，10：522.

［19］Aston J W，Giles J E，Durward I G，et al.Effect of elevated ripening temperatures on proteolysis and flavour development in Cheddar cheese［J］.Journal of Dairy Research，1985，52（4）：565-572.

［20］Vicente M S，Ibanez F C，Barcina Y，et al.Changes in the free amino acid content during ripening of Idiazabal cheese：influence of starter and rennet type［J］.Food Chemistry，2001，72（3）：309-317.

［21］Tejada L，Abellán A，Cayuela J M，et al.Sensorial characteristics during ripening of the Murcia al vino goat’s milk cheese：the effect of the type of coagulant used and the size of the cheese［J］.Journal of Sensory Studies，2006，21（3）：333-347.

Study on proteolysis of yak milk hard cheese effect of milk-clotting enzymes types during ripening period

WANG Ling1，2，LIANG Qi1，2，*，SONG Xue-mei1，2，ZHANG Yan1，2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu，Lanzhou 730070，China）

The fresh yak milk was as material，calf rennet，microbial rennet and papain was used as milk-clotting enzymes to produce hard cheese.And it was studied that the milk-clotting enzymes types effected on yak milk hard cheese proteolysis during ripening.The results showed that there was a big difference in proteolysis of different milk-clotting enzymes yak milk hard cheese.To some degree，the TN，pH4.6-SN/TN，12%TCA-N/TN，5%PTA-N/TN and FAA increased gradually with the ripening time.Protein nitrogen and casein nitrogen decreased sequentially decreased.Polypetide nitrogen increased continuously and then decreased.The proteolysis of microbial rennet yak milk hard cheese was significant（p＜0.05）higher than the papain and calf rennet yak milk hard cheese.

yak milk；hard cheese；milk-clotting enzymes；proteolysis；ripening

TS252.53

A

1002-0306（2015）14-0199-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.033

2014-12-08

王玲（1988-），女，碩士研究生，研究方向：乳制品加工。

梁琪（1969-），女，教授，研究方向：食品品質(zhì)，乳品科學(xué)。

國家自然科學(xué)基金（31260383）。