活血通絡(luò)解毒方對(duì)腦缺血Wistar大鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影響*

賈　蕓　易燕鋒　艾宗耀　肖梅紅　嵇　冰楊春華陸周翔

（1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江湖州313000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院，浙江湖州313000）

·研究報(bào)告·

活血通絡(luò)解毒方對(duì)腦缺血Wistar大鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影響*

賈蕓1易燕鋒1艾宗耀2△肖梅紅2嵇冰2楊春華2陸周翔2

（1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江湖州313000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院，浙江湖州313000）

目的研究活血通絡(luò)解毒方對(duì)腦缺血Wistar大鼠神經(jīng)缺損功能評(píng)分及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的影響。方法60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組，模型組，活血通絡(luò)解毒方低劑量組、中劑量組、高劑量組5組。大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型造模成功24 h、7 d、14 d后，各組給予相應(yīng)處理，分別分析比較檢查各組神經(jīng)功能評(píng)分情況及TNF-α、IL-1β、IL-6水平。結(jié)果假手術(shù)組無(wú)大鼠死亡，模型組死亡2只，分別死于術(shù)后第2日、第8日，活血通絡(luò)解毒方高劑量組死亡2只，分別死于術(shù)后第6日和第9日?；钛ńj(luò)解毒方中、低劑量組未見(jiàn)動(dòng)物死亡。造模后各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與假手術(shù)組比較均升高（P＜0.01）。各治療組在治療后其評(píng)分與模型組比較均降低（均P＜0.05），且中劑量組神經(jīng)功能缺失評(píng)分第7 d明顯低于模型組（P＜0.01）。治療中劑量組神經(jīng)功能缺失評(píng)分從術(shù)后第7日、14日均低于高劑量組和低劑量組（P＜0.05），高劑量組和低劑量組評(píng)分差別不大（P＞0.05）。造模后24 h各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平與假手術(shù)組比較均明顯升高（均P＜0.05），而模型組、高、中、低劑量組間比較則差別不大（均P＞0.05）。術(shù)后2周假手術(shù)組、模型組TNF-α、IL-1β、IL-6水平與本組術(shù)后24 h比較差別不大（均P＞0.05）；術(shù)后2周高、中、低劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平與本組術(shù)后24 h比較均下降（均P＜0.05），且中劑量組下降最明顯（P＜0.05）。術(shù)后2周高、中、低劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平與模型組同期比較均下降（均P＜0.05）。結(jié)論活血通絡(luò)解毒方可改善缺血性Wistar大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及其炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，這可能是干預(yù)腦梗死的機(jī)制之一。

腦梗死腦缺血再灌注炎癥細(xì)胞因子活血通絡(luò)解毒方實(shí)驗(yàn)研究

急性腦梗死是由于腦部供血障礙，引起腦組織缺血性壞死的一類疾病，前期筆者通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)活血通絡(luò)解毒方對(duì)急性腦梗死患者有較好的臨床療效［1］，擬進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，觀察活血通絡(luò)解毒方對(duì)腦缺血Wistar大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分及炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（280± 20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［合格證號(hào)SCXK（浙）2003-0003，經(jīng)檢疫合格備用］。大鼠在24～25℃下分籠飼養(yǎng)，保持相對(duì)濕度約為12%、光照明暗比為13∶1。

1.2試劑與器材活血通絡(luò)解毒方：茯苓15 g，玄參10 g，金銀花12 g，當(dāng)歸10 g，赤芍10 g，大黃3 g，梔子10 g，川芎6 g，地龍10 g，紅花10 g，全蝎3 g，甘草6 g。中藥液（中藥材由浙江中藥材公司提供）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院藥劑科配制。原藥材經(jīng)煎煮后，去除藥渣留取藥液，將藥液濃縮至每毫升含原生藥材2 g作為高劑量組，每毫升含原生藥材1 g為中劑量組，每毫升含原生藥材0.5g為低劑量組。10%水合氯醛（上海西唐生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)ws20131012）；0.9%氯化鈉注射液（浙江莎普愛(ài)思藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)140914-1C）；5%聚維酮碘溶液（杭州民生藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)591409111）；Elisa試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6（武漢博士德生物工程有限公司）。電子分析天平儀Sartorius AG（德國(guó)）；離心機(jī)（江蘇華大離心機(jī)股份有限公司）；721分光光度計(jì)（上海予騰生物科技有限公司）；多譜酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；眼科手術(shù)剪、止血鉗、動(dòng)脈夾、手術(shù)縫合針、線，試管，Eppendof管（上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司）；魚線：Ф=0.21 mm（威海潤(rùn)澤進(jìn)出口有限公司）。

1.3分組與造模將Wistar雄性大鼠按照改良Longa等［2］法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型。造模成功后按隨機(jī)數(shù)字表法分組為假手術(shù)組、模型組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組各12只。慶大霉素按照每日35 mg/kg大鼠體質(zhì)量抗感染，腹腔注射3 d。Wistar大鼠在再灌注術(shù)后完全蘇醒后，參照改良Berdson評(píng)分分級(jí)法分別觀察大鼠神經(jīng)和行為學(xué)改變。評(píng)分≥2分者表示模型制作成功，納入實(shí)驗(yàn)。

1.4給藥大鼠所用藥物等效劑量按照成人的臨床日用量與體質(zhì)量折算系數(shù)比，再計(jì)算出相當(dāng)于高、中、低劑量的藥量。每毫升含原生藥材2 g作為高劑量組，每毫升含原生藥材1 g為中劑量組，每毫升含原生藥材0.5 g為低劑量組。每天用活血通絡(luò)解毒方灌胃1次，術(shù)后24 h后給藥。模型組和假手術(shù)組按照相同的方法分別給予相同體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組用藥時(shí)間均為14 d。

1.5觀察指標(biāo)分別于術(shù)后當(dāng)日，術(shù)后第1日、第7日、第14日進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分方法與造模后的神經(jīng)行為學(xué)的評(píng)分方法相同。術(shù)后24 h、14 d分別經(jīng)大鼠尾靜脈、腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6濃度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析、配對(duì)t檢驗(yàn)和重復(fù)方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠死亡情況比較截止實(shí)驗(yàn)結(jié)束，假手術(shù)組無(wú)大鼠死亡，模型組死亡2只，分別死于術(shù)后第2日、第8日，活血通絡(luò)解毒方高劑量組死亡2只，分別死于術(shù)后第6日和第9日。活血通絡(luò)解毒方中、低劑量組未見(jiàn)動(dòng)物死亡。

2.2治療過(guò)程中各組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較見(jiàn)表1。造模后各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分與假手術(shù)組比較均升高（P＜0.01）。各治療組在治療后其評(píng)分與模型組比較均降低（均P＜0.05），且中劑量組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分第7日明顯低于模型組（P＜0.01）。治療中劑量組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分從術(shù)后第7日、14日均低于高劑量組和低劑量組（P＜0.05），高劑量組和低劑量組評(píng)分差別不大（P＞0.05）。

表1　各組大鼠不同時(shí)期神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較（分，）

表1　各組大鼠不同時(shí)期神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較（分，）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與高劑量組、低劑量組比較，●P＜0.05。

組別術(shù)后24 h術(shù)后7 d n評(píng)分n假手術(shù)組12012模型組12 9.2±1.2*11高劑量組12 9.4±1.0*11中劑量組12 9.3±1.3*12低劑量組12 9.3±1.1*12術(shù)后14 d評(píng)分n評(píng)分0120 9.1±1.3*10 8.8±2.1*7.1±1.8*△10 6.6±1.7*△5.6±2.3*△△●12 4.8±1.7*△△●7.3±3.2*△12 6.9±1.4*△

2.3治療前后各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較見(jiàn)表2。造模后24 h各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平與假手術(shù)組比較均明顯升高（均P＜0.05），而模型組、高、中、低劑量組間比較則差別不大（均P＞0.05）。術(shù)后2周假手術(shù)組、模型組TNF-α、IL-1β、IL-6水平與本組術(shù)后24 h比較差別不大（均P＞0.05）；術(shù)后2周高、中、低劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平與本組術(shù)后24 h比較均下降（均P＜0.05），且中劑量組下降最明顯（P＜0.05）。術(shù)后2周高、中、低劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平與模型組同期比較均下降（均P＜0.05）。

表2　各組Wistar大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（）

表2　各組Wistar大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（）

與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05；與本組術(shù)后24 h比較，*P＜0.05；與模型組同期比較，△P＜0.05；與高劑量組、低劑量組比較，●P＜0.05。

組別時(shí)間IL-6（pg/mL）假手術(shù)組術(shù)后24 h0.61±0.10（n＝12）術(shù)后2周0.59±0.13模型組術(shù)后24 h1.53±0.15＃TNF-α（ng/mL）IL-1β（pg/mL）1.27±0.161.33±0.89 1.23±0.221.43±0.61 2.64±0.36＃2.27±0.86＃（n＝12）術(shù)后2周1.49±0.20 2.59±0.352.16±0.75高劑量組術(shù)后24 h2.38±0.21＃2.24±0.81＃1.14±0.13＃（n＝12）術(shù)后2周1.61±0.30*△1.81±0.80*△0.72±0.16*△中劑量組術(shù)后24 h2.45±0.35＃2.21±0.74＃1.12±0.21＃（n＝12）術(shù)后2周1.30±0.21*△●1.38±0.66*△●0.60±0.14*△●低劑量組術(shù)后24 h2.50±0.23＃2.26±0.82＃1.50±0.12＃（n＝12）術(shù)后2周1.78±0.33*△1.89±0.76*△0.80±0.11*△

3　討論

Bothe等研究證實(shí)，檢測(cè)神經(jīng)元缺血損傷的唯一手段是行為學(xué)檢查所提示的功能異常，該檢測(cè)方法不能被任何其他方法所替代［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，造模后各組大鼠均有一定程度的神經(jīng)功能缺失改變，采用相應(yīng)治療后，活血通絡(luò)解毒方各劑量組均能明顯改善神經(jīng)功能缺損癥狀，降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，中劑量組尤為明顯。在術(shù)后14 d，中劑量組神經(jīng)功能缺失評(píng)分明顯低于高劑量組和低劑量組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以看出，在改善神經(jīng)功能障礙及起效時(shí)間方面中劑量治療具有更明顯優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)治療缺血性中風(fēng)有著悠久的歷史。許多研究表明，瘀血內(nèi)阻貫穿疾病的全部過(guò)程并且急性期毒損腦絡(luò)是重要的病機(jī)［4］。有業(yè)者認(rèn)為中風(fēng)病毒邪深入血絡(luò)，與瘀血相搏，形成毒瘀互結(jié)，損傷腦髓、腦脈，因此治療上除了一般的活血化瘀之外，還應(yīng)重視解毒［5］?；钛ńj(luò)解毒方以活血化瘀、解毒通絡(luò)為大法，方中金銀花、大黃、梔子清熱解毒；紅花、桃仁、當(dāng)歸、赤芍、川芎活血化瘀，全蝎、地龍祛風(fēng)通絡(luò)。全方共奏活血化瘀、解毒通絡(luò)之功。

腦梗死過(guò)程中炎癥反應(yīng)促進(jìn)了腦缺血損傷的發(fā)展，是加重缺血性腦損傷和神經(jīng)損傷的重要病理機(jī)制之一［6-7］。腦缺血損傷后在缺血受損區(qū)有細(xì)胞因子的過(guò)量表達(dá)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，過(guò)量炎癥因子的產(chǎn)生能加重神經(jīng)細(xì)胞損傷［8］。尤其是TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子［9-10］過(guò)度釋放，致使血腦屏障受損，加重腦損傷及腦水腫，形成缺血炎癥惡性循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［11］，腦缺血大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6相關(guān)細(xì)胞因子均升高。造模后24 h各組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6均有明顯升高。術(shù)后2周假手術(shù)組、模型組炎性細(xì)胞因子差別不大；高、中、低劑量組炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）與造模后24 h比較均下降，以中劑量組下降最為明顯，術(shù)后2周高、中、低劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平與模型組同期比較均下降，表明活血通絡(luò)解毒方可通過(guò)降低腦缺血再灌注Wistar大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，保護(hù)腦缺血大鼠腦組織。

綜上所述，活血通絡(luò)解毒方具有促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，其作用機(jī)理可能是通過(guò)降低血清中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平而達(dá)到改善神經(jīng)功能的作用。由于腦梗死急性期多種炎癥因子及細(xì)胞因子發(fā)揮作用，致病機(jī)理復(fù)雜，因此需要進(jìn)一步深入研究。

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The Effect of Huoxue Tongluo Jiedu Decoction on Inflammatory Cytokine TNF-α，IL-1β and IL-6 of Rats with Cerebral Ischemia Wistar

JIA Yun，YI Yanfeng，AI Zongyao，et al.
Medical School of Huzhou U-niversity，Zhejiang，Huzhou 313000，China

【Abstracrt】Objective：To Study the efficacy of Huoxue tongluo jiedu Decoction on inflammatory cytokine TNF-α，IL-1β，IL-6 of rats with cerebral ischemia Wistar.Methods：Sixty Wistar Mice were randomly devided into sham-operated group，the model group，group with low level of Huoxue tongluo jiedu Decoction，group with moderate level，and group with high level.The middle cerebral artery occlusion reperfusion model in rats was built according to Longa.24h after finishing modeling and 7 and 14 days after the treatment，the level of TNF-α，IL-1β and IL-6 of each group were detected，and the neurobehavioral change was observed.Results：At the end of the experiment，there were no rats dead in sham operation group and group with low level，2 in the model group on 2nd and 8th day respectively after operation，2 in group with high level on 6th and 9th day respectively after operation.After finishing modeling，compared with sham operation group，Neurological deficit scores of other groups significantly increased，with statistical significance（P＜0.01）.Compared with the model group，the situation of neural function was improved，and the level of TNF-α，IL-1β and IL-6 of each group increased（P＜0.05）.After 14 days′treatment，the level of TNF-α，IL-1β and IL-6 of each group decreased，among which，the group with moderate dose decreased the most（P＜0.05）.Conclusion：Huoxue tongluo jiedu Decoction can improve Neurological deficit scores and decrease the level of TNF-α，IL-1β，IL-6，which may be one of the mechanisms ofcerebral infarction.

Cerebral infarction；Cerebral ischemia reperfusion；Inflammatory cytokine；Huoxue tongluo jiedu Decoction；Experimental study

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2079-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.004

2015-07-26）

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013ZB126）；湖州師范學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目（KY2013025）

（電子郵箱：azy5765@sina.com）