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    麻黃細辛附子湯對正常小鼠外感及腎陽虛模型小鼠外感影響的比較*

    2015-11-07 09:49:18孫啟慧相美容王朋展侯衍豹
    中國中醫(yī)急癥 2015年12期
    關鍵詞:林組肛溫腎陽虛

    孫啟慧 相美容 王朋展 侯衍豹 容 蓉 楊 勇,2△

    (1.山東中醫(yī)藥大學,山東濟南250355;2.山東省經(jīng)方研究重點實驗室,山東濟南250355)

    ·研究報告·

    麻黃細辛附子湯對正常小鼠外感及腎陽虛模型小鼠外感影響的比較*

    孫啟慧1相美容1王朋展1侯衍豹1容蓉1楊勇1,2△

    (1.山東中醫(yī)藥大學,山東濟南250355;2.山東省經(jīng)方研究重點實驗室,山東濟南250355)

    目的探討麻黃細辛附子湯(MXF)對正常小鼠外感和腎陽虛模型小鼠外感干預作用效果差異。方法KM小鼠按體質量和肛溫隨機分成6組,并設空白對照組。腹腔注射苯甲酸雌二醇(8 mg/kg)法復制腎陽虛小鼠模型,流感病毒H1N1雞胚尿囊液(血凝滴度為1∶320)滴鼻感染小鼠,建立腎陽虛小鼠外感模型。感染1 d后給分別給MXF和利巴韋林藥物干預,連續(xù)給藥6 d,每日1次,觀察并記錄小鼠的體質量、肛溫變化,死亡數(shù)和死亡時間,比較各臟器指數(shù)變化。結果腎陽虛外感模型建立成功,腎陽虛模型建立成功后,小鼠死亡多發(fā)生在病毒感染后的2~5 d之內(nèi);與正常組比較,其余6組小鼠體質量顯著降低(P<0.01);腎陽虛外感組及腎陽虛外感利巴韋林組的肛溫明顯降低(P<0.01),腎陽虛外感組及腎陽虛外感利巴韋林組的肺指數(shù)明顯升高(P<0.05)。與腎陽虛外感組比較,腎陽虛外感MXF組小鼠死亡率、肺指數(shù)均有所降低,并且小鼠肛溫顯著回升(P<0.05);與正常外感組比較,正常外感MXF組小鼠死亡率、肺指數(shù)均有所降低,肛溫也出現(xiàn)回升趨勢;H1N1感染小鼠,對照組無死亡,正常外感組死亡率10%,腎陽虛外感組死亡率20%,利巴韋林分別給藥干預后死亡率分別是30%和10%,MXF給藥干預后正常外感組和腎陽虛外感組均無死亡現(xiàn)象,與正常組和腎陽虛外感模型組比較,MXF有降低小鼠死亡率的趨勢。結論MXF更適合于腎陽虛外感病證,為臨床上方證相關用藥提供了一定的實驗依據(jù)。

    腎陽虛模型外感正常小鼠外感流感病毒H1N1MXF

    病毒性流行性感冒(流感)每年均在全世界流行,其波及范圍極廣,每年全球大約有10~20%的人感染流感,其中2009年全球爆發(fā)的H1N1甲型流感造成全球至少20萬人死亡[1]。流感一般是由流感病毒引起的上呼吸道病毒感染性疾病,發(fā)病率高,潛伏期短,易暴發(fā)流行,是人類最常見的上呼吸道感染性疾病之一[2]。現(xiàn)代醫(yī)學認為流感臨床癥狀較重,起病急驟,有畏寒、發(fā)熱、頭痛、頭暈、全身酸痛、乏力等,可伴有咽痛、流涕、流淚、咳嗽等呼吸道癥狀;并發(fā)癥發(fā)生率高,特別是肺炎,可引起死亡,年邁體弱和幼年多病或有慢性基礎病患者為其高危人群[3-4]。目前,抗流感病毒藥物研究已取得初步成果,正式上市的抗流感藥物大體分為兩類:金剛烷胺和金剛乙胺類;神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑,逐漸發(fā)現(xiàn)流感病毒對這些藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[5]。中醫(yī)藥治療流感源遠流長,療效顯著[6],麻黃細辛附子湯(MXF)始載于《傷寒論》,為治療陽虛兼外感經(jīng)方之一。本方組方嚴謹,由麻黃、細辛、炮附子組成,麻黃發(fā)汗解表,附子溫里助陽,細辛溫化寒飲,既助麻黃解表,又配合附子逐里之寒飲。全方具有助陽解表、溫經(jīng)散寒之功效,用于治療素體陽虛,復感寒邪,惡寒發(fā)熱,寒重熱輕,頭痛無汗,四肢欠溫,舌質淡,苔薄白,脈沉細等病癥[7]。本研究通過比較MXF對腎陽虛外感及正常外感干預作用的差異,擬探究中藥復方治療疾病的方證相關性,為其在中醫(yī)臨床上的辨證論治所強調的方藥與疾病的高度相關性提供實驗依據(jù)?,F(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1動物KM小鼠雄性(20±2)g,SPF級,由山東魯抗動物實驗中心提供,動物許可證號SCXK(魯)20080002。

    1.2試劑及藥物苯甲酸雌二醇(寧波第二激素廠,批號140627);流感病毒H1N1(北京地方株引自中國CDC病毒病研究所);利巴韋林顆粒(四川百利藥業(yè)有限責任公司,批號131210);麻黃、炮附子、細辛(濟南市建聯(lián)中藥有限公司中藥飲片廠,批號20110501),經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定符合《中國藥典》2010年版標準。

    1.3儀器智能恒溫控制儀(成都泰盟科技有限公司);DT-880B型手持式人體表面溫度快速篩檢儀(深圳市華盛昌機械實業(yè)有限公司);ZIL-2型小鼠自主活動儀(北京醫(yī)科院藥研所);01193-YP601N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

    1.4分組KM小白鼠按體質量和肛溫隨機分為正常外感組、正常外感利巴韋林組及MXF組,腎陽虛外感組、腎陽虛外感利巴韋林組及腎陽虛外感MXF組,并設空白對照組。

    1.5造模1)正常外感模型的制備:KM雄性小鼠36只隨機分為3組,分別為正常外感模型組、正常外感利巴韋林組、正常外感MXF組,流感病毒H1N1雞胚尿囊液(血凝滴度為1∶320)滴鼻感染小鼠50 μL/只,對照組小鼠滴鼻接種等量的50 μL/只給予0.9%氯化鈉注射液,第1日接種流感病毒,2~7 d為藥物干預治療,每天記錄小鼠體質量、肛溫變化,觀察小鼠的精神狀態(tài)、發(fā)病及死亡情況。2)腎陽虛小鼠模型的復制:KM雄性小鼠45只,參考文獻方法[8]并改進造模劑量,4 mL/kg腹腔注射2 mg/mL苯甲酸雌二醇稀釋液,每日1次,連續(xù)15d,復制腎陽虛模型,對照組小鼠4 mL/kg腹腔注射0.9%氯化鈉注射液,于造模12~13 d進行相關指標檢測,通過測定自主活動、肛溫、趾溫、游泳時間[9],以此判定模型成功與否。3)腎陽虛外感小鼠模型建立:將復制成功的腎陽虛模型小鼠以體質量、肛溫為變量,隨機分為3組,分別為腎陽虛外感模型組、腎陽虛外感利巴韋林組、腎陽虛外感MXF組,接種流感病毒方法同正常外感模型。

    1.6給藥小鼠灌胃量按20 mL/kg計算,利巴韋林組劑量為0.0625 g/(kg·d),麻黃細辛附子湯劑量為2.5 g/(kg·d)均相當于人臨床等效劑量。感染第2日給藥,對照組、模型組以10 mL/kg的體積灌服蒸餾水,其余組灌服同體積的利巴韋林及MXF,連續(xù)給藥6 d,每天灌胃1次。

    1.7觀察指標1)造模過程中每天測量接種流感病毒后小鼠的肛溫、體質量1次,記錄每天變化趨勢,連續(xù)7 d。并觀察過程中小鼠的臨床癥狀如精神狀況、活動度、飲食等變化。2)計算每組的死亡率:死亡率=死亡動物數(shù)(只)/動物總數(shù)(只)×100%。3)實驗結束小鼠取各組小鼠肺、脾、胸腺等組織,稱取臟器質量,計算臟器指數(shù)。

    1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件。計量資料以(±s)表示,死亡率的比較采用χ2檢驗。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1腎陽虛小鼠模型建立見表1。結果示,造模后與對照組小鼠比較,模型小鼠肛溫、趾溫、自主活動次數(shù)明顯減少(P<0.01);游泳時間明顯減少(P<0.05)。結合上述指標表明腎陽虛模型建立成功。

    表1 造模對小鼠肛溫、趾溫、自主活動、游泳時間的影響()

    表1 造模對小鼠肛溫、趾溫、自主活動、游泳時間的影響()

    與對照組比較,△P<0.05,△△P<0.01。下同。

    組別自主活動(次/10 min)游泳時間(min)模型組238.96±85.06△△37.43±12.45△對照組329.42±48.9847.77±10.48 n 43 12肛溫(℃)趾溫(℃)35.38±0.55△△19.02±0.49△△36.18±0.5420.07±0.33

    2.2各組小鼠一般情況比較對照組小鼠皮毛干爽光滑,精神狀態(tài)良好,活潑,體質量漸增。正常外感組小鼠感染初期出現(xiàn)不活潑、打噴嚏等癥狀,總體質量從第2日開始下降直至最后解剖未見回升,期間嚴重者甚至出現(xiàn)死亡。腎陽虛外感模型組小鼠感染24 h后,癥狀初期為不活潑、呼吸短促,撓鼻,噴嚏,后期呈現(xiàn)極度消瘦,尾血管發(fā)紫,部分癥狀嚴重的小鼠出現(xiàn)死亡,死亡多發(fā)生在感染后的2~5 d之內(nèi)。

    表2 各組小鼠體質量差值比較(g)

    2.3各組小鼠體質量、肛溫變化情況比較見表2,表3。對照組小鼠體質量有升有降,但總體呈上升趨勢;從接種流感病毒起,正常外感組小鼠體質量呈持續(xù)降低趨勢,到第5日降至最低,隨后體質量有上升的趨勢;腎陽虛外感模型組小鼠體質量從第1日開始一直呈持續(xù)降低趨勢未見恢復;正常外感利巴韋林組、腎陽虛外感利巴韋林組小鼠體質量呈急劇降低趨勢,未見有恢復趨勢,且該組動物整體出現(xiàn)不健康狀態(tài),死亡率比較高,表明利巴韋林無論是治療普通外感、還是腎陽虛外感,其治療作用均較差;MXF干預后,正常外感組小鼠接種病后前2 d體質量呈降低趨勢,給藥第3日開始呈逐漸上升趨勢,腎陽虛外感組小鼠MXF干預后體質量一直呈較明顯上升趨勢,說明MXF對腎陽虛外感小鼠體質量回升有更明顯作用。接種流感病毒后對照組小鼠肛溫明顯高于其他組小鼠,第1日~5日與腎陽虛外感模型組及腎陽虛外感給藥組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。第6日起正常外感組及正常外感利巴韋林組肛溫比正常組降低(P<0.05),腎陽虛外感MXF組肛溫明顯回升與正常組差別不大(P>0.05)。與腎陽虛外感組比較,給藥第5日,腎陽虛外感MXF干預組肛溫明顯上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與正常外感組比較正常外感MXF干預后肛溫出現(xiàn)明顯上升,但差別不大(P>0.05)。利巴韋林治療組肛溫與模型組比較差別不大(P>0.05),表明該藥物對小鼠體溫的回升作用不明顯。

    表3 各組小鼠肛溫變化情況比較(℃,)

    表3 各組小鼠肛溫變化情況比較(℃,)

    與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與正常外感組比較,△△P<0.01;與腎陽虛外感組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    組別n正常組10正常外感組10正常外感利巴韋林組10正常外感MXF組10腎陽虛外感組10腎陽虛外感利巴韋林組10腎陽虛外感MXF組10第1日35.97±0.74##36.18±0.37 36.25±0.19第5日36.6±0.45##35.92±0.83 36.13±0.49 36.29±0.32 35.9±0.836.06±0.62 36.03±0.636.16±0.73 35.59±0.94**35.35±0.75**35.51±0.99**35.7±0.65**35.52±1.4**35.65±0.58**35.4±0.72**35.48±0.51**35.4±0.62**35.53±0.5**35.64±0.62**35.09±0.73**35.53±0.55*36.04±0.52 36.39±0.4#第2日第3日第4日36.28±0.8##36.38±0.82##36.28±0.57##35.85±0.64 35.82±0.93 35.82±0.46 35.92±0.57 35.88±0.57 36.23±0.24第6日第7日36.61±0.29##36.6±0.22##35.85±0.75*35.34±0.61**35.82±0.79 35.51±0.76**36.09±0.53 36.07±0.48△△35.24±1.35**35.05±1.31**35.14±0.45**35.1±0.51**36.36±0.57##36.3±0.78##

    2.4各組小鼠死亡率比較見表4。結果示,H1N1感染小鼠,對照組無死亡。正常外感組死亡率10%,腎陽虛外感組死亡率20.00%,利巴韋林分別給藥干預后死亡率分別是30.00%和10.00%,MXF給藥干預后正常外感組和腎陽虛外感組均無死亡現(xiàn)象,與正常組和腎陽虛外感模型組比較,MXF有降低小鼠死亡率的趨勢。

    表4 各組死亡率比較n(%)

    2.5各組小鼠模型臟器指數(shù)比較見表5。與正常組比較,MXF干預后正常外感組小鼠肺指數(shù)升高(P<0.05);與腎陽虛外感組相比,MXF干預后肺指數(shù)降低(P<0.05),且腎陽虛外感MXF組肺指數(shù)低于正常外感MXF組(P<0.05)。與正常組比較,正常外感組、正常外感利巴韋林組、腎陽虛外感組、腎陽虛外感利巴韋林組、腎陽虛外感MXF組胸腺指數(shù)、睪丸指數(shù)、精囊腺指數(shù)降低(均P<0.05)。與正常外感組比較,正常MXF組脾指數(shù)升高(P<0.05),而腎陽虛外感組、腎陽虛外感利巴韋林組下降(均P<0.05);腎陽虛外感組、腎陽虛外感利巴韋林組、腎陽虛外感MXF組睪丸指數(shù)、精囊腺指數(shù)降低(均P<0.05),正常外感利巴韋林組則升高(P<0.05)。與腎陽虛外感組比較,正常組、正常外感組、正常外感利巴韋林組胸腺指數(shù)、腎指數(shù)、睪丸指數(shù)、精囊腺指數(shù)均升高(均P<0.05)。正常MXF組則胸腺指數(shù)、睪丸指數(shù)、精囊腺指數(shù)升高(均P<0.05)。腎陽虛外感利巴韋林組、腎陽虛外感MXF組腎指數(shù)升高(均P<0.05)。與正常外感利巴韋林組比較,正常外感組胸腺指數(shù)升高,而腎陽虛外感MXF組則降低(均P<0.05)。

    表5 各組小鼠模型臟器指數(shù)比較()

    表5 各組小鼠模型臟器指數(shù)比較()

    與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與正常外感組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與腎陽虛外感組比較,#P<0.05,##P<0.01;其他給藥組與正常外感利巴韋林組比較,★P<0.05。

    組別n正常組10正常外感組10正常外感利巴韋林組10腎指數(shù)1.092±0.141##1.058±0.13##1.089±0.133##正常外感MXF組100.713±0.3280.424±0.128△△0.194±0.093##1.202±0.244腎陽虛外感組100.953±0.464*0.322±0.187△△0.086±0.050**0.089±0.254**腎陽虛外感利巴韋林組100.856±0.461*0.300±0.053**△△##0.086±0.043**1.111±0.117##腎陽虛外感MXF組100.700±0.072#0.353±0.088*0.105±0.032**★1.077±0.123##肺指數(shù)脾指數(shù)胸腺指數(shù)0.616±0.083△#0.453±0.1190.195±0.036##0.871±0.415*0.375±0.1960.181±0.088##★0.707±0.1510.345±0.2920.155±0.05##睪丸指數(shù)精囊腺指數(shù)0.610±0.145##0.137±0.073##0.598±0.135*##0.124±0.043##0.793±0.159△△##0.137±0.055##0.560±0.156##0.137±0.066##0.129±0.035**△△0.050±0.042**△△0.159±0.42**△△0.060±0.019**△△0.197±0.067**△△0.047±0.022**△△

    3 結論

    本實驗采用流感病毒滴鼻感染免疫低下小鼠,造成流感病毒肺炎模型,以死亡率、肛溫、肺指數(shù)等為評價指標,實驗結果示,造模后肺指數(shù)明顯升高,對照組無死亡,感染模型組均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,且腎陽虛外感模型死亡率是正常外感的2倍,表明腎陽虛外感模型相對于正常外感模型而言有病理較嚴重的病理損傷,動物機體狀態(tài)更差;兩種模型感染流感病毒后的小鼠體質量、肛溫均開始下降,給予利巴韋林治療,兩種外感模型利巴韋林效果均較差,正常外感利巴韋林組的肺指數(shù)雖然比正常外感MXF組低,但動物死亡率較高,體質量不斷下降、體溫降低后也未得到回升。而腎陽虛外感利巴韋林組的肺指數(shù)比腎陽虛外感MXF組還要高。以上數(shù)據(jù)反映利巴韋林治療外感效果不理想,筆者推測該現(xiàn)象與利巴韋林藥物的毒副作用有關[10],也與其治療流感病毒的針對性不強或耐藥性有關。

    MXF治療正常外感、腎陽虛外感模型小鼠均有效果,但相對于正常外感模型而言,MXF對腎陽虛外感模型小鼠的體質量恢復增長更明顯。在肺指數(shù)反映的炎性損傷指標中,在腎陽虛外組比正常外感組更嚴重的肺組織損傷基礎上,MXF腎陽虛外感組比MXF正常外感組的肺指數(shù)反而更低些,表明MXF對腎陽虛外感模型有更好的治療作用;另外腎陽虛外感MXF組與正常外感MXF組比較,在動物體質量恢復、肛溫回升方面,也表現(xiàn)出更好的藥效作用,這些均反映了中醫(yī)方證相關的合理性和必要性。

    本研究以正常小鼠外感和腎陽虛小鼠外感為研究對象,對比研究《傷寒論》經(jīng)方MXF對兩種病證的干預效果,同時以西藥利巴韋林作為陽性對照藥參考。本實驗發(fā)現(xiàn),利巴韋林治療這兩種病證的效果均不理想,MXF治療這兩種外感模型均有作用,相對于正常外感組,MXF治療的腎陽虛外感組無論在動物體重恢復、肛溫回升、肺指數(shù)等方面均表現(xiàn)出較好治療效果。這為中醫(yī)的臨床方證相應,辯證施證提供進一步的實驗依據(jù)和支持,同時也為流感的高危人群防治(腎陽虛外感)研究提供參考。

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    Intervention Comparison of Mahuang Xixin Fuzi Decoction on Influenza Virus in Normal Mice and Kid-ney-yang Deficiency Mice Model

    SUN Qihui,XIANG Meirong,WANG Pengzhan,et al.
    Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Shandong,Jinan 250355,China

    Objective:To investigate the difference in intervention of Mahuang Xixin Fuzi decoction on normal mice and Kidney-yang deficiency mice model with influenza virus.Methods:KM mice were randomly divided into six groups by weight and anus temperature,including the normal group.The Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus group and intervened by ribavirin or MXF group and so on,according to the weight and rectal temperature.Kidney-yang deficiency model mice were established by intraperitoneal injection of estradiol benzoate(8 mg/kg).Mice were infected with influenza virus H1N1 allantoic fluid(Hemagglutination titer 1∶320)by intranasal to establish the mice model of influenza disease with kidney-yang deficiency.After infection the mice were treated for 6 days.Body weight and rectal temperature changes,mortality and survival time were observed,comparing the visceral index.Results:After the model established,the infected mice died in 2~5 days. Compared with the normal group,the weight of other groups decreased significantly(P<0.01);the Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus group and intervened by ribavirin decreased significantly(P<0.01),and their lung index decreased(P<0.05).Compared with the normal group,the other index of mice intervened by MXF became normal.After infected with H1N1,there were no death in normal group;the death rate of the normal infected with influenza virus was 10%;the Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus was 20%;the group intervened by ribavirin was 30%and 10%;and there were no death between the group intervened by MXF,which indicated that the MXF could decrease the death rate of mice.Conclusion:MXF hasbetter intervention for the Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus,providing a certain reference value for the clinical combination of traditional Chinese medicine.

    MXF;Kidney-yang deficiency mice model infected with influenza virus;Normal mice model infected with influenza virus;Influenza virus H1N1;MXF

    R285.5

    A

    1004-745X(2015)12-2072-04

    10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.002

    2015-06-03)

    國家科技重大專項(2014ZX09509001-001);國家自然科學基金項目(81273626);山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃(2013-026)

    (電子郵箱:yy7204@163.com)

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