沙眼衣原體臨床株對(duì)利福平的體外敏感性及rpoB基因耐藥突變檢測(cè)

江勇 楊麗娜 劉原君 侯淑萍 齊蔓莉 劉全忠

沙眼衣原體臨床株對(duì)利福平的體外敏感性及rpoB基因耐藥突變檢測(cè)

江勇 楊麗娜 劉原君 侯淑萍 齊蔓莉 劉全忠

目的 檢測(cè)沙眼衣原體臨床株對(duì)利福平的體外敏感性，探討rpoB基因突變與臨床耐藥的關(guān)系。方法 采用微量細(xì)胞培養(yǎng)法確定利福平對(duì)52株沙眼衣原體臨床株的最低抑菌濃度。擴(kuò)增所有臨床株以及標(biāo)準(zhǔn)株rpoB基因，然后進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析。并隨機(jī)選取兩株臨床株進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果 52株臨床菌株中未檢出耐藥株，利福平的最低抑菌濃度是0.004～0.030 mg/L。SSCP和測(cè)序均未發(fā)現(xiàn)rpoB耐藥突變。結(jié)論 利福平治療沙眼衣原體失敗患者未檢測(cè)到rpoB基因突變，利福平治療失敗與多種因素有關(guān)。

沙眼衣原體；利福平；微生物敏感性試驗(yàn)；抗藥性，微生物；DNA突變分析；基因，rpoB

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）感染治療失敗與耐藥的報(bào)告日漸增多［1］。有學(xué)者認(rèn)為對(duì)利福平耐藥的產(chǎn)生主要與rpoB基因的點(diǎn)突變有關(guān)［2］。為監(jiān)測(cè)近年天津市Ct對(duì)利福平的體外敏感性，我們檢測(cè)52例Ct臨床分離株的體外敏感性，采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）方法研究rpoB突變。

一、資料和方法

1.資料：2005年4月至2008年3月，52株Ct臨床株分離自天津市性傳播疾病研究所門診收集的沙眼衣原體尿道炎或?qū)m頸炎患者尿道或?qū)m頸口分泌物，其中36例患者用利福平治療失敗，16例患者未接受利福平治療。采樣標(biāo)準(zhǔn)：直接免疫熒光檢測(cè)到衣原體原體或乳膠免疫層析法檢測(cè)到目的條帶。男性有不同程度的尿道炎癥狀，女性有陰道異常分泌物；非妊娠期婦女；拭子標(biāo)本淋球菌、支原體檢測(cè)陰性；涂片在油鏡下平均每視野中多形核白細(xì)胞數(shù)＞5個(gè)；就診前2周內(nèi)未用抗菌藥物。

McCoy細(xì)胞來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所。利福平標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2.沙眼衣原體細(xì)胞培養(yǎng)：參照以往改進(jìn)的方法分離沙眼衣原體［3］。

3.體外藥物敏感性測(cè)定：預(yù)先確定能引起90%以上細(xì)胞感染的Ct接種量?？咕幑ぷ鳚舛葏⒄瘴墨I(xiàn)［3］，設(shè)6個(gè)倍比稀釋濃度：0.03、0.015、0.008、0.004、0.002、0.001 mg/L。將McCoy細(xì)胞接種于96孔板孵育24 h，形成致密單層細(xì)胞。按接種量加入Ct，32℃，1 100×g，離心1 h后置于5%C02，37℃溫箱中孵育2 h。棄液,每孔加入含不同濃度抗菌藥的感染液（含胎牛血清、慶大霉素、萬(wàn)古霉素、兩性霉素B、放線菌酮的MEM液）［3］，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（加藥，不接種沙眼衣原體）和陽(yáng)性對(duì)照（接種沙眼衣原體，不加藥）。孵育48 h，甲醇固定后碘染色，顯微鏡下觀察未見Ct包涵體的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

4.rpoB基因單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析及測(cè)序：蛋白酶K法制備基因組DNA。上游引物：5′-GCGAATGGGCGATGAGAAG A-3′，下游引物5′-CCGTACTTGTGTCGGCTTCA-3′［1］。95℃預(yù)變性10 min；95℃變性40 s；52℃退火40 s；72℃延伸60 s；35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。預(yù)期目的片段656 bp。取6 μl PCR產(chǎn)物，加入6 μl普通10X上樣緩沖液，混勻。95℃水浴中變性10 min，取出標(biāo)本立即冰浴，并置于-20℃5 min。8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃，80 V電泳6 h，溴化乙錠染色，紫外線透射反射分析儀下觀察、拍照，電泳較慢的為突變株。同時(shí)隨機(jī)選擇2株（MIC分別是0.03和0.008 mg/L）PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

二、結(jié)果

1.藥敏試驗(yàn)：臨床分離株52株傳代至感染率＞90%，進(jìn)行利福平體外藥敏試驗(yàn)，結(jié)果MIC值0.004～0.030 mg/L，其中2株、9株、25株、16株MIC值分別是0.004、0.008、0.015、0.030 mg/L。所有MIC值均低于血藥濃度或組織藥物濃度。

2.rpoB基因突變分析：完成52例臨床株及E型標(biāo)準(zhǔn)株rpoB擴(kuò)增，目的片段656 bp。SSCP檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)突變株。見圖1，2。測(cè)序結(jié)果顯示，與E型標(biāo)準(zhǔn)株比較，2株臨床株rpoB基因273位無(wú)C→T突變（Ala522→Val），284位也無(wú)C→T突變（His526→Tyr）。

圖1 rpoB基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖 1：陰性對(duì)照；2～4：臨床株，擴(kuò)增產(chǎn)物656 bp；5：E型標(biāo)準(zhǔn)株；M：標(biāo)準(zhǔn)參照物

圖2 rpoB單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 E：E型標(biāo)準(zhǔn)株；1～3：不同臨床株。各臨床株與E型標(biāo)準(zhǔn)株電泳后的2條單鏈均在同一水平，表明基因序列相同

三、討論

利福平為利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，對(duì)多種病原體均有抗菌活性，對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)外的病原體均有明顯的殺菌作用。因?yàn)椴涣挤磻?yīng)，利福平在臨床中不作為治療非淋病尿道炎的一線藥物。利福平的峰值血藥濃度為7～9 mg/L，遠(yuǎn)大于我們測(cè)定的MIC值（0.004～0.030 mg/L），顯示了較高的抗衣原體活性。但是，41例樣本（78.85%）測(cè)定值高于文獻(xiàn)報(bào)道值0.007 5 mg/L［4］。利福平與其他抗生素聯(lián)合也有不錯(cuò)的效果。研究表明，單純阿奇霉素不能將沙眼衣原體從宿主細(xì)胞中清除，從而形成持續(xù)感染，可以檢測(cè)到Ct的脂多糖和rRNA。但阿奇霉素與利福平聯(lián)合時(shí)無(wú)耐藥，且較早抑制rRNA的合成［4］。

利福平通過(guò)與衣原體的RNA聚合酶（RNAP）的β亞單位rpoB結(jié)合發(fā)揮作用。rpoB基因核心區(qū)的核苷酸改變引起結(jié)合力下降。rpoB主要有3個(gè)部位的基因簇Ⅰ～Ⅲ易發(fā)生核苷酸變化，對(duì)應(yīng)的氨基酸位置分別是507-533，560-572，687。其中90%的核苷酸改變位于基因簇Ⅰ。基因簇Ⅰ的核苷酸改變與耐藥有關(guān)。2003年，Dreses-Werringloer等［2］檢測(cè)5株利福平耐藥突變株的rpoB的核苷酸序列。其中，3株變異株（最小抑菌濃度4 mg/L）在基因簇Ⅰ區(qū)522位密碼子GCA突變成GTA，相應(yīng)的丙氨酸被纈氨酸所取代；另外2株高水平耐藥的變異株（最小抑菌濃度64～256 mg/L）在基因簇Ⅰ區(qū)526位密碼子CAC突變成TAC，相應(yīng)的組氨酸被酪氨酸所取代。作者推測(cè)還有其他耐藥機(jī)制，因?yàn)榘l(fā)生His526→Tyr突變的不同沙眼衣原體株，利福平MIC值可相差4倍。Kutlin等［5］研究2株利福平耐藥沙眼衣原體的rpoB基因，測(cè)序發(fā)現(xiàn)其中1株發(fā)生His526→Tyr突變，然而另1株無(wú)突變，因此首次提出沙眼衣原體耐受利福平與rpoB基因突變無(wú)關(guān)。我們采用U.Dreses-Werringloer等的方法，擴(kuò)增rpoB中心區(qū)的基因簇Ⅰ、Ⅱ，然后通過(guò)SSCP檢測(cè)rpoB基因突變株。SSCP方法及測(cè)序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)突變，與藥敏試驗(yàn)無(wú)耐藥株一致。

因此，不良反應(yīng)較少的利福霉素類藥物，既能殺滅細(xì)胞外的衣原體，又能避免衣原體持續(xù)感染，可能將成為治療衣原體感染的理想選擇。利福平可以作為臨床二線用藥治療沙眼衣原體感染，雖然MIC值有所提高，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到體外耐藥的水平。臨床利福平治療沙眼衣原體失敗患者未檢測(cè)到rpoB基因突變，利福平治療失敗與多種因素有關(guān)。

［1］Mpiga P,Ravaoarinoro M.Chlamydia trachomatispersistence:an update［J］.Microbiol Res,2006,161（1）:9-19.

［2］Dreses-Werringloer U,Padubrin I,K?hler L,et al.Detection of nucleotide variability in rpoB in both rifampin-sensitive and rifampin-resistant strains ofChlamydia trachomatis［J］.Antimicrob Agents Chemother,2003,47（7）:2316-2318.

［3］江勇,楊麗娜,齊蔓莉,等.提高沙眼衣原體臨床株培養(yǎng)陽(yáng)性率的探討［J］.中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志,2008,24（9）:706-708.

［4］Dreses-Werringloer U,Padubrin I,Zeidler H,et al.Effects of azithromycin and rifampin onChlamydia trachomatisinfectionin vitro［J］.Antimicrob Agents Chemother,2001,45（11）:3001-3008.

［5］Kutlin A,Kohlhoff S,Roblin P,et al.Emergence of resistance to rifampin and rifalazil inChlamydophila pneumoniaeand Chlamydia trachomatis［J］.AntimicrobAgentsChemother,2005,49（3）:903-907.

In vitroactivity of rifampin against and rpoB mutations inChlamydia trachomatisclinical isolates

Jiang Yong, Yang Lina,Liu Yuanjun,Hou Shuping,Qi Manli,Liu Quanzhong*.*Department of Dermatology and Venereology,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Liu Quanzhong,Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

Liu Quanzhong,Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the susceptibility ofChlamydia trachomatisclinical isolates to rifampin,and assess the relationship between rpoB mutations and antibiotic resistance in them.MethodsA microculture method was used to determine the minimal inhibitory concentration（MIC）of rifampin in 52Chlamydia trachomatisclinical isolates. The rpoB gene was amplified from all the clinical isolates and a standard strain ofChlamydia trachomatisfollowed by single-strand conformation polymorphism（SSCP）analysis.Sequencing of PCR products was carried out for two clinical isolates.ResultsNo rifampin-resistant strain was found among these clinical isolates.The MIC of rifampin varied from 0.004 to 0.030 mg/L.Neither SSCP analysis nor sequencing showed rpoB mutations.ConclusionsNo rpoB mutations were found inChlamydia trachomatisisolates from patients unresponsive to rifampin.The unresponsiveness to rifampin may be attributed to multiple factors.

Chlamydia trachomatis;Rifampin;Microbial sensitivity tests;Drug resistance,microbial;DNA mutational analysis;Genes,rpoB

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.018

國(guó)家自然科學(xué)基金（30872285）

300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科［江勇（現(xiàn)在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科，300211）、劉原君、侯淑萍、齊蔓莉、劉全忠）］；天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚性病科（楊麗娜）

劉全忠，Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

2014-12-31）

（本文編輯：尚淑賢）